趙國超 朱小方 王彤 李建粵

摘 要： 以目前上海市主栽的高產(chǎn)常規(guī)水稻“秀水134”為材料，利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功敲除甜菜堿醛脫氫酶2基因，獲得了兩種類型純合突變體植株.采用表達載體特異性結(jié)合的引物檢測T1代轉(zhuǎn)基因植株，成功獲得6株不攜帶載體骨架的轉(zhuǎn)基因植株.定量PCR分析顯示，突變體植株甜菜堿醛脫氫酶2基因表達量極顯著低于野生型對照（p<0.01），但突變體植株成熟種子香味物質(zhì)2-乙酰-1-吡咯啉（2AP）含量極顯著高于野生型對照（p<0.01）.比較野生型對照與突變體植株的主要農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量性狀，兩者間都沒有顯著差異（p>0.05）.本研究可為加快高產(chǎn)香型水稻在上海及周邊地區(qū)的推廣應(yīng)用，以及為今后利用CRISPR/Cas9技術(shù)快速培育其他高產(chǎn)香型水稻新品種研究奠定基礎(chǔ).

關(guān)鍵詞： 水稻; 甜菜堿醛脫氫酶2基因; 2-乙酰-1-吡咯啉（2AP）; CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù); “秀水134”

中圖分類號： S 511 ?文獻標(biāo)志碼： A ?文章編號： 1000-5137（2019）05-0574-07

Abstract： In the study，fragrance rice mutant lines were developed with CRISPR/CAS9 by editing fragrance gene Badh2 in “Xiushui 134”，a major elite rice cultivar in Shanghai region.Six mutant lines without the vector backbone were successfully obtained by PCR detection.Quantitative PCR analysis showed that the expression of Badh2 in mutant plants was significantly lower than that in wild type （p<0.01），the content of 2AP in mature seed of mutant plants was significantly higher than that in wild type （p<0.01），but there were no significant differences on main agronomic traits between the mutant plants and wild type （p>0.05）.This research can accelerate the application of high-yield fragrant rice in Shanghai areas，and lay the foundation for the future study on the rapid cultivation of other high-yield fragrant rice varieties using CRISPR/Cas9 technology.

Key words： rice; betaine aldehyde dehydrogenase 2 gene; 2AP; CRISPR/Cas9 gene editing technology; “Xiushui 134”

香味是稻米的重要食味品質(zhì)性狀之一.使用具有香味的米煮飯，稻米在蒸煮和食用過程中都會散發(fā)清香氣味而深受消費者鐘愛.由于市場對香米需求量的日益增加，國內(nèi)外的香型水稻育種研究也越來越受到重視.

稻米香味由隱性基因控制，并位于第8號染色體上[1-3].BRADBURY等[4]以泰國香稻為材料研究發(fā)現(xiàn)：水稻香味的產(chǎn)生與第8號染色體上編碼甜菜堿醛脫氫酶2（Betaine aldehyde dehydrogenase 2，BADH2）基因（Badh2）有關(guān).SHI等[5]在不同香稻品種中發(fā)現(xiàn)Badh2編碼鏈上不同位點的突變.CHEN等[6]和NIU等[7]分別通過Badh2基因互補實驗和RNAi實驗證實了Badh2就是水稻的香味基因.

文獻[8-10]報道了利用分子標(biāo)記輔助選育各種優(yōu)質(zhì)香型水稻的研究成果.盡管利用分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)可以有針對性地對水稻植株進行香味基因的追蹤篩選，但其與傳統(tǒng)常規(guī)育種所需時間相同，在本地和海南加代繁殖周期較長（3.5～4.0 a）.

“秀水134”水稻是目前上海市主栽的高產(chǎn)常規(guī)水稻品種，表現(xiàn)為穩(wěn)產(chǎn)，穗型較大，不易倒伏和高抗病性等特性[11]，但其屬于非香水稻.

本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)，以“秀水134”水稻為材料，對其香味基因Badh2進行編輯，獲得了香型“秀水134”水稻，為加快高產(chǎn)香型水稻在上海及周邊地區(qū)的推廣應(yīng)用，也為今后利用CRISPR/Cas9技術(shù)快速培育其他高產(chǎn)香型水稻新品種提供參考.

1 材料與方法

1.1 水稻材料和種植

以“秀水134”為遺傳轉(zhuǎn)化受體，開展常規(guī)的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?，轉(zhuǎn)基因材料種植于上海師范大學(xué)實驗基地，常規(guī)田間種植及管理.

1.2 實驗方法

1.2.1 Badh2敲除載體的構(gòu)建

利用CRISPR-P網(wǎng)站設(shè)計Badh2基因（Xiushui 134Os08g0424500）一個Target序列（http：//cbi.hzau.edu.cn/CRISPR/）.Target序列為CGCGATTGCGCGGAGGTACT（對應(yīng)基因互補序列：AGTACCTCCGCGCAATCGCG），如圖1（a）所示.采用引物合成的方式獲得所選的Target序列.引物合成時，在Target序列上游引物5′端加TGGC，下游引物5′端加AAAC.引物由上海生工生物工程公司合成.

按照常規(guī)分子生物學(xué)方法完成CH-Target中間載體和pCAMBIA1300-CH-Badh2敲除載體構(gòu)建以及鑒定的工作.將pCAMBIA1300-CH-Badh2載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌并完成鑒定（CH-Target中間載體由上海植物逆境生物學(xué)研究中心朱健康課題組提供）.

1.2.2 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻

分別取“秀水134”水稻幼穗或成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織為遺傳轉(zhuǎn)化外植體.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻遺傳轉(zhuǎn)化中的培養(yǎng)基組成、愈傷組織誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)化操作、抗性篩選及植株再生方法都參照李建粵等[12]的報道.

1.2.3 轉(zhuǎn)基因陽性植株和突變類型鑒定及無載體突變體植株的獲得

設(shè)計一對能夠與pCAMBIA1300-CH-Badh2載體T-DNA序列同源配對的引物F0/R0（表1），對轉(zhuǎn)基因水稻葉片提取的基因組DNA進行擴增及電泳檢測.

在目的基因靶點位置兩側(cè)設(shè)計引物F2a/R2a（表1），對轉(zhuǎn)基因水稻陽性植株基因組DNA進行擴增.擴增產(chǎn)物送華大生物公司進行測序.測序結(jié)果利用DNAMAN軟件進行分析，并與野生型Badh2基因序列進行比對.根據(jù)峰圖和比對結(jié)果及網(wǎng)站（http：//dsdecode.scgene.com/）判斷突變類型.

利用F0/R0引物（表1），對轉(zhuǎn)基因T1代植株葉片提取的基因組DNA進行PCR擴增及電泳檢測.

1.2.4 突變體植株Badh2基因定量PCR檢測

分別根據(jù)Actin和Badh2基因序列設(shè)計定量PCR檢測引物（表1）.分別收獲“秀水134”和突變體水稻開花7 d后的種子，取穎果提取總RNA.利用TaKaRa公司的RNA提取試劑盒預(yù)處理RNA去除基因組DNA并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA.以Actin基因為內(nèi)參，分別以“秀水134”和突變體水稻cDNA為模板，分析Badh2基因的mRNA表達水平.采用2-ΔCt法分析數(shù)據(jù)，確定基因的相對表達量.

1.2.5 突變體植株成熟種子2-乙酰-1-吡咯啉（2AP）含量測定

采用GC-MS法測定“秀水134”水稻和突變體水稻成熟種子香味物質(zhì)2AP（2-acetyl-1-pyrroline）含量.2AP提取和測定方法參照HUANG等[13]和應(yīng)興華等[14]的報道.

1.2.6 突變體植株主要農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量性狀分析

水稻成熟時，在野生型“秀水134”和純合突變體植株種植的小區(qū)中，隨機選取5棵單株，分別測量劍葉高和株高，調(diào)查每株的有效穗數(shù)和每穗實粒數(shù)，稱量千粒重和單株重，最后利用Excel進行統(tǒng)計分析，并用t檢測對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測及突變類型分析

使用F0和R0引物對轉(zhuǎn)基因T0代植株進行PCR檢測.結(jié)果顯示所有轉(zhuǎn)基因植株都能夠擴增出789 bp目標(biāo)條帶.

經(jīng)PCR鑒定后的陽性植株分別使用可擴增相應(yīng)Target位點的引物，對目的基因Badh2進行擴增和測序分析.通過DANMAN比對及測序峰圖分析測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在由含有Target-1序列的表達載體轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)基因植株中，有兩棵T0代轉(zhuǎn)基因陽性植株表現(xiàn)出兩種純合突變，分別被定名為badh2-1和badh2-2.badh2-1突變是在目的基因第二外顯子328 bp處有一個堿基T插入，badh2-2是在目的基因第二外顯子329 bp和335 bp處缺失ACCTCCG 7個堿基，如圖1（b）所示.

2.2 突變體目的基因編碼的氨基酸序列分析

純合突變體badh2-1目的基因編碼的氨基酸相比野生型植株Badh2編碼的氨基酸，在第77個氨基酸處開始發(fā)生移碼突變，并提前終止.突變體badh2-1 Badh2基因編碼的蛋白質(zhì)由原來503個氨基酸變成468個氨基酸，但兩者在第77個氨基酸后，氨基酸種類都發(fā)生了變化（圖2）.

純合突變體badh2-2目的基因在第二外顯子329 bp和335 bp處發(fā)生了7個堿基缺失，也同樣使Badh2基因編碼氨基酸時發(fā)生移碼突變和提前終止，由原來503個氨基酸縮短為481個氨基酸，同時在第76個氨基酸后的氨基酸種類也全部發(fā)生了改變（圖2）.

2.3 突變體T1植株基因組載體檢測

從兩種純合突變體T0植株上收獲T1種子.將T1種子種植于上海師范大學(xué)校植物園內(nèi).苗期取葉片提取DNA，使用F0和R0引物，對野生型“秀水134”和兩種純合突變體T1植株進行載體擴增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在有些植株基因組中依然能夠擴增出載體片段，有6棵T1植株無法擴增出載體（圖3）.由此表明，載體在T1植株中發(fā)生了分離.保留無載體骨架的T1植株.

2.4 突變體植株Badh2基因表達分析

對野生型“秀水134”水稻和兩種突變體badh2-1和badh2-2植株Badh2基因進行定量PCR檢測，結(jié)果顯示兩種不同突變類型植株的Badh2基因轉(zhuǎn)錄水平差異不顯著（p>0.05），但兩種不同突變類型植株的Badh2基因轉(zhuǎn)錄水平都比野生型“秀水134”水稻呈極顯著下調(diào)（p<0.01）（圖4）.

2.5 突變體植株成熟種子2AP含量分析

檢測野生型“秀水134”和兩種突變體植株成熟種子的2AP含量，結(jié)果顯示兩種突變體植株成熟種子香味物質(zhì)2AP的含量都極顯著高于野生型“秀水134”水稻（p<0.01），但兩種不同突變體植株成熟種子2AP的含量差異不顯著（p>0.05）（圖5）.

2.6 突變體植株主要農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量性狀分析

為了明確香味基因Badh2突變是否影響水稻植株主要農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量性狀，對野生型“秀水134”及其突變體badh2-1植株主要農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量性狀進行了考查，發(fā)現(xiàn)野生型“秀水134”水稻與突變體植株的劍葉高、株高、有效穗數(shù)都沒有顯著差異（p>0.05）（表2）.產(chǎn)量性狀分析顯示，野生型“秀水134”水稻與突變體植株的每穗實粒數(shù)、千粒重及單株重之間也沒有顯著差異（p>0.05）（表3）.

3 討 論

過去對于香稻育種主要使用常規(guī)選育方法.大多先將香型水稻與具有多種有利性狀的非香型水稻雜交并自交，然后通過咀嚼或氫氧化鉀溶液浸泡對F2代植株米粒是否具有香味進行鑒定，保留米粒具有香味的單株，繼續(xù)通過多代自交方式培育出香稻新品種.常規(guī)選育方法很難培育出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)等綜合性狀好的香型水稻新品種.利用分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)選育香型水稻，雖然可以將雜交后的植株多次與具有多種有利性狀的非香型水稻進行回交，使選育出的香稻品種聚集更多有利性狀，但也無法避免育種周期長的問題.

快速培育香型水稻一直以來都是水稻育種家們追求的目標(biāo).分子生物學(xué)新技術(shù)的發(fā)展已實現(xiàn)了縮短香稻的育種進程.2015年，SHAN等[15]通過TALEN技術(shù)，對“日本晴”水稻香味基因Badh2進行編輯，獲得了大約30%的Badh2基因雜合后代.2017年，邵高能等[16]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對“中花11”水稻Badh2基因進行編輯，確認(rèn)了利用CRISPR/Cas9技術(shù)能夠快速培育香型水稻的可行性.2017年和2018年，周文甲等[17]和王付華等[18]也采用CRISPR/Cas9技術(shù)分別對黑龍江省和河南省水稻品種的Badh2基因進行編輯，也獲得了相應(yīng)的香型水稻.與TALEN技術(shù)相比，CRISPR/Cas9技術(shù)是一項能夠?qū)δ康幕蛱囟ㄎ稽c進行更有效編輯的技術(shù)，實驗成本低，成功率高，并且可使育種時間更短.

本研究也采用CRISPR-Cas9技術(shù)，對上海市目前主栽的重要常規(guī)水稻“秀水134” Badh2基因進行編輯，也獲得了兩種Badh2基因純合突變的“秀水134”水稻.檢測分析顯示，兩種突變體植株成熟種子香味物質(zhì)2AP含量都極顯著高于野生型“秀水134”水稻.

BRADBURY等[4]最早報道了8號染色體上編碼BADH2的基因與水稻香味直接相關(guān).隨后，不同的研究者又先后報道了12個位于Badh2不同編碼鏈位點突變的等位基因[5，19-20].SHI等[21]在2014年報道了一個突變位于啟動子和5UTR的新Badh2等位基因.香味新等位基因的發(fā)現(xiàn)為香稻育種提供了重要的基因資源.本研究結(jié)果也為今后香型水稻育種提供了兩個有利用價值的新型香味等位基因.

2-乙酰-1-吡咯啉是水稻最重要的香味化合物[22].當(dāng)Badh2編碼鏈突變將導(dǎo)致BADH2原有功能喪失，使其作用底物2AP的代謝途徑中斷，2AP不斷積累從而使水稻變香[4].MICHAEL等[20]進一步研究發(fā)現(xiàn)：Badh2不同編碼鏈位點突變都能夠增加水稻香味物質(zhì)的2AP含量.本研究也進一步證明了這一的結(jié)果.

目前在生產(chǎn)上應(yīng)用的香稻品種大多是通過常規(guī)育種獲得，產(chǎn)量大多低于非香水稻.本研究通過對“秀水134”和“Badh2突變體”后代農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量性狀比較分析發(fā)現(xiàn)，香味基因Badh2突變并不會影響水稻農(nóng)藝性狀和降低水稻的產(chǎn)量.

本研究通過對T1代植株表達載體分析，已成功獲得不具有載體骨架結(jié)構(gòu)的香型“秀水134”水稻.香型“秀水134”水稻的成功培育，不僅可為加快高產(chǎn)香型水稻在上海市的推廣應(yīng)用，同時也為今后利用已成功構(gòu)建的Badh2敲除載體快速培育其他高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)香型水稻新品種的研究提供參考.

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（責(zé)任編輯：顧浩然）