楊 旭，翁雅芳，羅模桂，汪 瑜，劉官智△

1.四川省自貢市第四人民醫(yī)院(自貢643000)；2.四川省衛(wèi)生康復職業(yè)學院(自貢643000)；3.成都市癌癥防治中心(成都市腫瘤質控中心)(成都 610041)

急性濕疹(Atopic eczema，AE)是最常見的皮膚病，每5個人中就有一個在一生中受到影響，最近的數(shù)據(jù)顯示，其患病率仍在上升，特別是在低收入國家。其發(fā)病是一種復雜的慢性疾病，可導致各種令人痛苦的癥狀，如瘙癢、睡眠障礙以及皮膚外觀改變等[1]。研究發(fā)現(xiàn)中藥治療濕疹具有獨特優(yōu)勢，但治療濕疹的中藥方劑很多，最常見的有三黃止癢洗劑、消風散、除濕湯等?，F(xiàn)階段，在濕疹治療中應用中藥的研究已經有很多，但其具體作用機制還沒有得到充分系統(tǒng)的研究，另外，在治療效果上還需要進一步的提高[2-3]。白鮮皮是一種治療皮膚病的抗炎藥物，主要用于治療濕疹、特應性皮炎和牛皮癬等皮膚病，其還具有殺蟲、止癢、清熱除濕等作用[4]。紫草油具有涼血、活血、解毒透疹、抗菌抗炎、抗過敏、抑制滲出及減少水腫等作用[5]。關于兩者聯(lián)合治療濕疹的作用機制報道尚少，本研究通過白鮮皮聯(lián)合紫草油治療大鼠濕疹的研究，初步探索其可能的作用機制，為有效治療濕疹提供科學理論依據(jù)。

材料和方法

1 材 料

1.1 試驗動物及分組：40只健康SD大鼠購自成都達碩實驗動物有限公司，雌雄各半，體質量180～220 g，使用許可證號：SYXK(川)2014-189。大鼠在條件為溫度(22℃～25℃)和濕度(35%～75%)，12 h晝夜光照交替，自由攝食飲水下養(yǎng)殖。大鼠被隨機分為5組，分別為空白組、模型組、白鮮皮組、紫草油組、白鮮皮聯(lián)合紫草油組，每組8只大鼠，大鼠每籠2只進行飼養(yǎng)。

1.2 大鼠濕疹模型制備：造模采用2，4-二硝基氯苯(DNCB)(成都科龍化工試劑廠)于大鼠背部皮膚造模[6]。具體方法為實驗前1天大鼠背部去毛，面積約6 cm2，于第1天，用150 μl 1%DNCB溶解在丙酮：橄欖油混合物(3∶1v/v)中施用背部皮膚，于第5天，背部皮膚施用150 μl 0.2 %DNCB溶液[溶解在丙酮：橄欖油混合物(3∶1v/v)]，每周3次，共4周(第5～33天)?？瞻捉M大鼠背部皮膚施用相同量的丙酮橄欖油混合物(3∶1v/v)。觀察造模大鼠，如大鼠皮膚上出現(xiàn)瘙癢、紅斑/出血、水腫、剝蝕/糜爛和鱗屑/干燥等濕疹樣皮損表現(xiàn)，即為造模成功。

2 方 法

2.1 給藥方法：造模成功后第2天起開始給藥，空白組和模型組僅給予純凈水外洗，白鮮皮組：以濃度5 %的白鮮皮提取液(分別取白鮮皮藥材50 g加入1300 ml冷水中浸泡30 min后，煎煮約30 min至1000 ml，制備5 %的提取液)用注射器反復外洗背部皮膚5 s左右，每天2次，每次5 ml。紫草油組：以濃度100 %的紫草油(80℃加熱15～20 min，以紫草輕度變焦炭為度，待油冷卻后過濾)于背部皮膚外涂治療，2次/d。白鮮皮聯(lián)合紫草油組：先用5 %的白鮮皮提取液反復外洗背部皮膚5 s左右，后以100 %的紫草油外涂背部皮膚治療，2次/d。每組均連續(xù)治療12 d。白鮮皮、紫草均來自四川省中醫(yī)藥研究院。

2.2 樣本采集：末次給藥24 h后經大鼠眼球取血2 ml，1500 r/min離心20 min，取出血清置于微量離心管內，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?；斷頸處死實驗大鼠，取大鼠造模區(qū)皮膚組織，分成兩份，一份于4 %多聚甲醛固定，另一份于-80℃低溫保存，用于后續(xù)檢測。

2.3 觀察指標

2.3.1 濕疹程度及嚴重度指數(shù)評分(Eczema area and severity index，EASI)：評分方法參考《濕疹面積及嚴重度指數(shù)評分法》[7]。濕疹程度以水腫/丘疹、紅斑、滲出/結痂、剝脫/抓痕、苔蘚化為主要觀察表現(xiàn)。以0～3分計分濕疹表現(xiàn)的嚴重度，0分為無(仔細觀察后也不能確定)，1分為輕(需仔細觀察才能見到)，2分為中(此體征可立即看到)，3分為重(此體征非常明顯)，各種癥狀分值之間可記0.5分。

2.3.2 病理組織學觀察：將固定的皮膚組織按常規(guī)方法制備石蠟切片，HE染色，鏡檢觀察病理組織變化并拍照。

2.3.3 酶聯(lián)免疫法：ELISA檢測血清因子：采用ELISA試劑盒(上海茁彩)檢測大鼠血清中IFN-γ(貨號：ZC-36294)、IL-4(貨號：ZC-36402)、IL-31(貨號：ZC-32435)、LTB4(貨號：ZC-36369)、LTC4(貨號：ZC-36371)含量。

2.3.4 免疫組化檢測皮膚組織CysLTR1、CysLTR2表達：取固定后的大鼠皮膚組織，進行洗滌、脫水、石蠟包埋，連續(xù)切片在含有2 %明膠的溫水中漂浮，以防止樣品脫落，加一抗、二抗孵育，并用3,3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)為底物的Vectaain Elite ABC試劑盒(Vector)顯影，光鏡檢查，選擇陽性物質最明顯處5個視野，放大400倍，采用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)(Media Cybernetics，Inc.公司)半定量檢測陽性物質的積分光密度(IOD)，計算平均IOD。

2.3.5 WB檢測皮膚組織中間絲聚合蛋白(FLG)、蛋白酶激活受體-2(PAR-2)、TRPV1含量：采用RIPA裂解液低溫提取總蛋白，BCA法測定總蛋白量，蛋白質(10 μg)經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分解，轉移到PVDF(聚偏氟乙烯)膜上。將膜封閉在5 %的脫脂牛奶中2 h，加入初級抗體孵育過夜：FLG、PAR-2、TRPV1(稀釋1∶1000)，用PBST洗滌膜，隨后用辣根過氧化物酶結合的山羊抗兔抗體(1∶20000)在室溫下孵育2 h，PBST清洗膜，采集圖像并進行軟件分析，以目標條帶與內參條帶A值的比值作為目的蛋白的表達含量。

結 果

1 不同處理組EASI評分 模型組大鼠較空白組EASI評分明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組比較，白鮮皮組、紫草油組、白鮮皮聯(lián)合紫草油組皮損評分明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，聯(lián)合用藥組EASI評分下降較單一用藥組明顯，表現(xiàn)紅斑、丘疹、抓痕/剝脫均減輕的現(xiàn)象,見表1。

表1 不同處理組EASI評分(分)

2 皮膚病理組織學觀察 空白組：組織結構清晰，無明顯異常。模型組：病理組織改變明顯，可見皮膚組織結構充血模糊、水腫及炎細胞浸潤。白鮮皮組：可見組織結構較清晰、局部可見充血、水腫及炎細胞浸潤。紫草油組：可見皮膚組織局部出現(xiàn)充血、水腫、局部結構呈現(xiàn)模糊，病理損傷較模型組減輕。白鮮皮聯(lián)合紫草油組：組織結構清晰、水腫、充血及炎細胞浸潤少見，病理損傷較模型組明顯減輕，見圖1。

3 不同處理組血清因子 ELISA結果顯示，模型組較空白組IL-4、IL-31、LTB4、LTC4水平明顯升高，IFN-γ水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；經不同處理治療，僅白鮮皮聯(lián)合紫草油組較模型組IL-4、IL-31、LTB4、LTC4水平明顯降低，IFN-γ水平較明顯升高，組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表2。

圖1 不同處理組病理組織學觀察(HE染色，×400)

表2 不同處理組IFN-γ、IL-4、IL-31、LTB4、LTC4水平(pg/mg)

4 不同處理組皮膚組織CysLTR1、CysLTR2水平 與空白組比較模型組大鼠CysLTR1、CysLTR2水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；經不同處理治療，僅白鮮皮聯(lián)合紫草油組較模型組CysLTR1、CysLTR2水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表3，圖2。

5 不同處理組皮膚組織FLG、PAR-2、TRPV1含量 WB結果顯示，模型組較空白組PAR-2、TRPV1水平明顯升高，F(xiàn)LG水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；經不同處理治療，僅白鮮皮聯(lián)合紫草油組較模型組PAR-2、TRPV1水平明顯降低(P<0.05)，F(xiàn)LG水平較模型組升高，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，圖3。

表3 不同處理組CysLTR1、CysLTR2水平(n=8)

圖2 免疫組化圖(×400)

圖3 不同處理組FLG、PAR-2、TRPV1含量

討 論

AE是臨床常見的表皮及真皮淺層的炎癥性皮膚科常見病，典型表現(xiàn)為持續(xù)性瘙癢、紅腫、浸潤、增厚、粗糙等，發(fā)病時會嚴重影響患者的生活質量，其發(fā)病機制復雜，研究認為主要由代謝異常、內分泌失調、患者自身消化系統(tǒng)疾病、外部環(huán)境中的病毒和細菌以及溫濕度和異物過敏原的刺激等因素引起[8]，造成了一定程度的治療困難。并且，糖皮質激素長期應用可出現(xiàn)皮膚萎縮、色素沉著、毛細血管擴張、系統(tǒng)吸收、快速抵抗等副作用，且停藥易復發(fā)，因此限制了激素的長期應用和用量，目前如何提高臨床療效、抑制復發(fā)和預防發(fā)生不良反應等已經成為近年來臨床治療濕疹的熱點。因此，以中藥治療濕疹為切入點，對中醫(yī)藥治療濕疹的作用機理進行研究，為中醫(yī)藥在臨床濕疹治療中的應用指導提供新的思路。天然產物萜類化合物具有廣泛的生物活性，包括抗炎、抗癌、抗血管生成、抗真菌和抗乙肝病毒活性，這使得對這類成分的植物化學或生物活性研究具有重要意義，白鮮皮根皮屬于蕓香科植物，是一種富含型半萜類的植物，作為一種傳統(tǒng)中藥，在中國幾千年來，由于其止癢、清熱和祛濕的能力，它被廣泛用于治療炎癥、微生物感染、外陰瘙癢、濕疹、疥瘡、癌癥和其他疾病。此外，還能有效抑制高脂飲食引起的體重和脂肪含量增加，降低血液中甘油三酯(TG)和總膽固醇含量，減輕肥胖，并具有殺蟲作用。

先前的研究表明，中藥不僅可以治療胃炎、胃潰瘍、糖尿病、類風濕性關節(jié)炎等；中藥在AE治療方面具有治療效果顯著、治療組分及靶標途徑多的特點，在應用于AE治療上已成為研究熱點[9-11]。因此從這一點出發(fā)，建立急性濕疹大鼠模型，對急性濕疹進行中藥治療，以尋找更有效的中藥治療濕疹方法，并通過試驗研究中藥治療濕疹的作用機制。白鮮皮性味苦、寒；歸胃、脾、膀胱經，其具有祛風、清濕、解毒等功能，多用于風/濕疹、瘡毒濕熱、風濕熱痹、疥癬瘡癩、黃疸尿赤等，具有多重藥效藥理作用[12]。紫草性味咸、甘、寒，歸肝、心兩經，其具有活血、清熱、透疹、解毒等功能。紫草素及其衍生物是紫草的主要化學成分，在抗炎、抗菌、免疫調節(jié)等方面具有較為廣泛的生物活性，在各種皮膚病治療中應用廣泛，并取得了一定療效[13]。

至今為止，濕疹的發(fā)病機制仍未完全明確，在免疫炎癥性反應中，Th1/Th2亞群及其相互之間的平衡在免疫應答的調節(jié)中起著關鍵的作用。研究指出，當機體的免疫系統(tǒng)被激活，誘導Th2細胞轉化為Th1細胞，其進一步產生的炎癥因子對靶器官造成一定的損害，從而導致相關疾病的發(fā)生。除了Th1和Th2細胞外，其他T細胞亞型包括Th17和Th22細胞也在皮炎與濕疹的發(fā)病機制中具有重要作用[14]。細胞因子主要由Th1、Th2分泌，其分泌異常在AE的發(fā)病過程中起著重要作用[15]。研究發(fā)現(xiàn)IL-31、IFN-γ、IL-4、LTB4、LTC4水平與濕疹相關，IL-31水平在AE患者皮損處明顯上調，可引起皮膚炎癥細胞浸潤、瘙癢[16]。LTB4、LTC4、CysLTR1、CysLTR2水平在AE患者中明顯升高[17]。LTB4、LTC4可使白細胞趨化作用引起皮膚表現(xiàn)出紅斑、腫脹、滲出，其引起的皮損表現(xiàn)，中醫(yī)多辨證為濕熱蘊膚證[18]。可見LTB4、LTC4、CysLTR1、CysLTR2水平升高參與AE皮損表現(xiàn)，而中醫(yī)藥治療AE達到清熱、燥濕、止癢的機制可能與抑制炎癥細胞浸潤及下調LTB4、LTC4水平及其受體的表達相關。AE所致的皮膚瘙癢常由內源性及外源性化學物質介導的多條信號通路共同傳遞。編碼絲聚蛋白原的主要基因FLG減少可導致保濕因子的大量減少從而引起皮膚干燥、粗糙，最終致使皮膚受損引起皮膚屏障功能異常[19]。目前認為皮膚瘙癢發(fā)生的一條主要途徑為非組胺依賴的PAR-2途徑，其下游信號分子是TRPV1，是癢覺通路傳遞的樞紐，PAR-2廣泛表達于人體皮膚上，AE發(fā)生時，PAR-2被活化可破壞皮膚屏障功能，PAR-2被激活后最后會致使下游TRPV1通道開放，增加TRPV1活性誘導產生癢覺[20]。因此，抑制PAR-2/TRPV1信號通路激活，對延緩AE發(fā)展具有重要意義。

本研究表明，白鮮皮聯(lián)合紫草油可調節(jié)急性濕疹大鼠Th1/Th2細胞分泌，減少細胞因子IL-31、IL-4水平，抑制PAR-2、TRPV1表達，其機制可能是通過PAR-2/TRPV1信號通路來實現(xiàn)，發(fā)揮治療急性濕疹瘙癢的作用。