饒君鳳，呂偉德，宋濤

（1.杭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江杭州310018；2.杭州富陽厚鑫生態(tài)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，浙江杭州311404）

西紅花又名番紅花和藏紅花，藥用部位為其柱頭，西紅花能活血、解郁、安神，是2014年我國新增的藥食兩用貴重中藥，有紅色金子之稱，同時，因其獨特的香氣和良好的食品增色調(diào)味作用，又被稱為世界上最貴的香料。浙江省是我國西紅花的主產(chǎn)區(qū)，各級政府部門均制定了相關(guān)政策大力促進(jìn)西紅花產(chǎn)業(yè)的健康快速發(fā)展，由于西紅花在栽培條件下不能結(jié)實，僅靠球莖無性繁殖，繁殖過程中種球品質(zhì)退化嚴(yán)重，加上西紅花種植過程存在嚴(yán)重的連作障礙，制約了西紅花產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展和壯大[1]。已有研究認(rèn)為，根系分泌物的自毒作用[2]以及由此誘發(fā)的土傳病害病原生物的選擇性促進(jìn)[3]是導(dǎo)致土壤微生態(tài)系統(tǒng)失衡及作物連作障礙的主要原因。通過有益微生物的直接引入或通過增施有機(jī)肥，間接改善土壤微生態(tài)的多樣性，是防治連作障礙的有效方法[4]，其中增施含有自毒物質(zhì)高效降解菌的有機(jī)肥是目前研究較多的用于連作障礙防治的有效途徑[5]。研究表明，微生物群落結(jié)構(gòu)與組成變化會直接影響土壤功能的發(fā)揮[6]；根際微生物的數(shù)量、活性和群落結(jié)構(gòu)及其變化,直接影響植物吸收水分、養(yǎng)分及其對惡劣環(huán)境的抵抗能力，并與病菌的侵入和感染密切相關(guān)[7]，因此，土壤微生態(tài)系統(tǒng)綜合功能失調(diào)是造成連作障礙的主要原因，探索土壤微生物生態(tài)調(diào)控途徑是消減連作障礙的關(guān)鍵。本實驗研究了不同微生物肥料對西紅花產(chǎn)量的影響，并采用代謝組學(xué)技術(shù)研究了其對西紅花球莖代謝物的影響，以期為西紅花微生物生態(tài)的成功調(diào)控及其連作土壤的生物修復(fù)提供參考，進(jìn)而為克服與治理名貴中藥材西紅花及其他中藥材與農(nóng)作物生產(chǎn)中的連作障礙提供有效的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

肥料a：重茬凈復(fù)合微生物菌劑，500 g/包，武漢埃格瑞生物工程技術(shù)有限公司；肥料b：微生物菌劑（廣譜型），500 g/包，濰坊市綠隴生物技術(shù)有限公司；肥料c：錦能菌寶608，錦江化工（山東）有限公司，2 000克/袋，以上3種菌肥均購自淘寶網(wǎng)。肥料d：自制活性生物肥料，2 500 g/袋，由課題組人員在前期西紅花自毒物質(zhì)降解菌研究基礎(chǔ)上，采用4株多功能降解細(xì)菌作為自制活性生物肥料生產(chǎn)菌。4株多功能降解細(xì)菌分別為暹羅芽孢桿菌Bacillus siamensis B1-6、解淀粉芽孢桿菌WZZ-6、綠針假單胞菌 DSY3B6、Arthrobacter nicotinovorans SSDB1。采用單因子實驗和正交實驗對4個菌株的發(fā)酵條件分別進(jìn)行優(yōu)化，確定各自的發(fā)酵培養(yǎng)條件后進(jìn)行發(fā)酵，對這4種發(fā)酵菌體等比例混合后制成活性微生物，再加入少量基質(zhì)，充分混勻后，通風(fēng)晾干或低溫烘干，制成自制活性生物肥料（微生物總數(shù)達(dá)到108以上）。

澆灌用水為建德三都新和實驗田地日常澆灌使用的溪水。

JCS-600電子天平，生產(chǎn)編號：1418208，生產(chǎn)日期：201408，凱豐集團(tuán)有限公司制造。

2 實驗設(shè)計與取樣

西紅花參試品種為建德新和西紅花專業(yè)合作社自留的建德種西紅花，種植在合作社承包的連續(xù)種植5 a以上的田地。試驗中使用的4種菌肥分別為重茬凈（肥料a）、微生物菌劑（肥料b）、錦能寶（肥料c）和自制活性生物肥料（肥料d）。將一包菌肥分別均勻溶解在2桶水中，每桶水40 L，共80 L，采用灌注方式施肥，設(shè)空白對照。各處理均重復(fù)3次，每個重復(fù)均有10行西紅花，每行均種有種球10株（平均每株產(chǎn)2個種球），試驗組與對照組隨機(jī)分布在同一塊田中，且兩組之間間隔距離較遠(yuǎn)。施過菌肥的除不再噴農(nóng)藥外，其余管理與對照組相同。菌肥處理時間為2016年2月15日，處理62 d后即4月17日取球莖進(jìn)行代謝物分析。具體取樣過程為：一種菌肥試驗每個平衡取3株（一般每株有2個球，個別的只有1個球），將球在清水中洗凈后，3株中每株切一小片球莖混合成一個樣品，共取3個平衡，對照組用同樣方法取樣，取樣時盡量選取外形、長勢相似的植株，將樣品放在信封里用訂書機(jī)封好，再將信封浸入液氮中然后撈出埋在干冰中，當(dāng)天下午從建德取樣地寄往上海淵譜生物科技有限公司進(jìn)行代謝物分析。處理后的75 d即4月30日在西紅花葉子接近枯萎可以采種球時，對種球和種球根際土壤進(jìn)行取樣，每個樣本采集2行×3種球和泥土，共5個樣本，一般取中間2行，即同時分別取每個微生物肥料試驗組10行中的第5～6行，共挖取2行種球和泥土，一個微生物肥料取6行種球和泥土，將泥土直接送檢測機(jī)構(gòu)做宏基因組測序，共取了重茬凈（肥料a）、微生物菌劑（肥料b）和自制活性生物肥料（肥料d）3種菌肥泥土。另將這些種球按施不同微生物肥料分別放置，每個施微生物肥料的西紅花種球只算總數(shù)不再設(shè)平衡，7月27日在種球的泥土和其他雜質(zhì)全部自動脫落后對每個種球進(jìn)行稱重。

3 代謝組分分析

準(zhǔn)確稱取10 mg西紅花球莖粉末樣品移至2 mL離心管中，加入 600 μL的甲醇:水（v:v=4:1）溶液，渦旋 3 min 后溫室靜置 10 min，12 000 r·min-1離心。取上清，12 000 r·min-1離心后取100 μL 進(jìn)行UHPLC（1290 Infinity II LCTM，安捷倫）分析。流動相為A（0.1%甲酸水溶液）和B（100%乙腈），洗脫梯度為0 min，98.0%A；1.0 min，98%A；5.0 min，60%A；12.0 min，30%A；15.0 min，5%A；20.0 min，5%A，流速為0.40 mL·min-1，上樣量為1 μL。

采用6545 Q-TOF系統(tǒng)（安捷倫）進(jìn)行代謝物分析。參數(shù)為：質(zhì)荷比50～1 000；掃描速度為2張·s-1；毛細(xì)管電壓3.5 kV，噴頭電壓500 V（正離子模式），1 500 V（負(fù)離子模式）；碰撞電壓110 V，噴霧器壓強45 Pa，流速8 L·min-1；二級質(zhì)譜碰撞電壓分別為10，20，40 V。結(jié)合 Masshunter Qual軟件（安捷倫）及代謝組數(shù)據(jù)庫對代謝物進(jìn)行檢驗分析。篩選標(biāo)準(zhǔn)為：質(zhì)荷比小于5×10-6，保留時間小于0.1 min。隨后采用Mass Profinder 08（安捷倫）提取代謝物峰面積。數(shù)據(jù)分析前，采用歸一化方法對代謝物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。利用SIMCA 13.0軟件進(jìn)行PCA分析，采用Excel 2013進(jìn)行T-檢驗，p＜ 0.05表示各代謝物在處理間存在顯著差異。

4 宏基因組測序

使用OMEGA E.Z.N.A DNA試劑盒提取西紅花根際土壤基因組DNA；采用Epicentre公司的Copy Control TM Fosmid Library Production Kit構(gòu)建宏基因文庫；使用IllumunaMiseq測序平臺，采用PE300測序方案，進(jìn)行高通量測序；采用prinseq軟件去除每個樣品中片段短和低復(fù)雜度序列、引物序列和低質(zhì)量序列；采用pri.cluster軟件對測序錯誤進(jìn)行校正；以silva數(shù)據(jù)庫中序列為模板，利用uchime軟件去除嵌合體；采用uclust（uclust v1.1.579）進(jìn)行OTU聚類；采用RDP classifier軟件進(jìn)行物種分類。以上具體操作步驟詳見文獻(xiàn)[8]。

對群落中物種的Alp Ha多樣性指標(biāo)（ACE、Chao1、Shannon指數(shù)、Coverage）進(jìn)行分析，具體步驟詳見文獻(xiàn)[8,11]。通過QIIME軟件，采用迭代算法對高通量測序數(shù)據(jù)進(jìn)行Beta多樣性指標(biāo)分析，本文采用加權(quán)重計算方式，具體步驟詳見文獻(xiàn)[12]。

5 結(jié)果

5.1 不同微生物肥料對西紅花產(chǎn)量的影響

由表1可見，與對照組相比，4種微生物肥料均能降低無效球重量，提高有效球重量比。其中，施用重茬凈的效果最好，施用錦能菌寶608次之，施用微生物菌劑效果最差但高于對照組。

表1 不同微生物肥料對西紅花產(chǎn)量的影響Table1 Effect of different microbial fertilizers on yield of saffron

5.2 不同微生物肥料對西紅花球莖代謝物的影響

本實驗中，共鑒定到129種代謝組。由圖1可知，經(jīng)4種菌肥處理后的西紅花球莖代謝物均與對照組存在顯著差異，其中自制活性生物肥料（肥料d）與對照組差異最大，而重茬凈（肥料a）與對照組差異最小。

與對照組相比，菌肥a處理后，2種代謝物量上升顯著（腺苷5′-單磷酸和葡萄糖 1-磷酸），2種代謝物量下降顯著（原兒茶酸O-己糖苷2和2,6-二氨基庚二酸）（見表1）。菌肥b處理后，琥珀酸、延胡索酸和蘋果酸量上升顯著，而原兒茶酸O-己糖苷2、咖啡酸和犬尿氨酸量則下降顯著。菌肥c處理后，分別有3個代謝物量上升（乙酰、脯氨酸和同型半胱氨酸），2個代謝物量下降（原兒茶酸O-己糖苷2和甘油酸）。與對照組相比，菌肥4處理后，西紅花球莖代謝物差異最大，分別有包括泛酸、共軛亞油酸、維生素B2、抗壞血酸和松油酸等在內(nèi)的13個代謝物量上升顯著，而原兒茶酸O-己糖苷2甘油酸果糖和蔗糖的量下降顯著，詳見表2。

5.3 不同微生物肥料對根際微生物生態(tài)的影響

通過測定各個土壤樣品的細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)組成，以比較所研制的自制活性生物肥料對根際土壤細(xì)菌種群的影響。如表3和表4所示，不同處理的土壤與對照相比，在門水平上具有一定差異，主要表現(xiàn)在各處理組的變形菌門、放線菌門增加，酸酐菌門、擬桿菌門減少；在屬水平上的表現(xiàn)為Sphingomonas、Gemmatimonas、Nitrosospira、Acinetobacter、Bacillus明顯增加,Gp6、Gp3、Exiguobacterium、Citrobacter、Pseudomonas等呈減少趨勢。從中可看出，經(jīng)處理之后，根際土壤中好酸性的細(xì)菌呈減少趨勢，而嗜中性或堿性的細(xì)菌呈增加趨勢，表明增施生物肥料具有緩解西紅花連作障礙的功效。

圖1 不同微生物肥料處理后西紅花球莖化合物的主成分分析Fig.1 Principal component analysis of differential accumulated metabolites in saffron bulbs after different microbial fertilizer treatment

6 討 論

西紅花采收前采集各實驗組根際土壤，采用第二代高通量測序方法，測定各土壤樣品的細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)組成，發(fā)現(xiàn)施用微生物肥料后根際土壤中好酸性的細(xì)菌有減少趨勢，而嗜中性或堿性的細(xì)菌有增加趨勢，表明增施生物肥料或自制活性生物肥料具有緩解西紅花連作障礙的功效。通過與對照組比較，4種微生物肥料均顯著提高了西紅花有效球重量比，其中重茬凈的效果最佳，微生物肥料的抗連作障礙作用在產(chǎn)量上得到了證實。

通過分析代謝物發(fā)現(xiàn)，在重茬凈處理后，腺苷5′-單磷酸和葡萄糖 1-磷酸量顯著上升。腺苷5′-單磷酸是植物體內(nèi)合成ATP的重要底物，在腺苷酸激酶的作用下與二膦酸腺苷合成ATP。葡萄糖1-磷酸是植物體內(nèi)合成淀粉的重要物質(zhì)[13]。這2種代謝物的上升可能對提高西紅花產(chǎn)量有重要作用。除此之外，還發(fā)現(xiàn)原兒茶酸O-己糖苷2在各種微生物肥料處理后均有顯著下降，原兒茶酸O-己糖苷2的降低對西紅花產(chǎn)量的影響需進(jìn)一步研究。除重茬凈外，其他3種微生物肥料也能提高西紅花產(chǎn)量，在球莖代謝物分析中，發(fā)現(xiàn)不同代謝物有表達(dá)差異，表明以上4種微生物肥料能夠通過調(diào)控不同代謝物的積累影響產(chǎn)量。而4種微生物肥料是如何調(diào)控以上代謝物的尚需進(jìn)一步研究。從代謝組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過自制活性生物肥料處理的西紅花球莖引起的代謝物差異最多，但產(chǎn)量并非最佳。因此，不同微生物肥料造成的代謝物差異是如何影響西紅花產(chǎn)量的尚待進(jìn)一步深入研究。

表2 不同微生物肥料處理后西紅花球莖積累化合物的變化Table2 Up-and down-accumulated metabolites after different microbial fertilizer treatment

表3 不同微生物肥料處理對根際土壤細(xì)菌宏基因組的影響（Phylum門水平）Table3 Effect of different microbial fertilizers on rhizosphere soil bacterial metagenomics（Phylum level）

本研究中，施用不同微生物肥料會影響土壤的細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)。例如，好酸性的細(xì)菌減少，而嗜中性或堿性的細(xì)菌增加。但微生物肥料是如何影響西紅花根際微生物種群結(jié)構(gòu)的有待進(jìn)一步研究。以上研究結(jié)果對緩解西紅花連作障礙具有一定的指導(dǎo)意義。