Nisin產(chǎn)生菌株的篩選及產(chǎn)物初步探究與鑒定

李俊輝，王燕，周寶琳，李丕武，趙鑫君，王婷*

(1.齊魯工業(yè)大學(山東省科學院)，山東省微生物工程重點實驗室，濟南 250353；2.山東省中醫(yī)藥大學，濟南 250353)

細菌素(bacteriocin) 是細菌在代謝過程中由核糖體合成并分泌到環(huán)境中的一類具有抑(殺)菌活性的代謝產(chǎn)物, 通常是低分子量的多肽或者蛋白類物質[1,2]。自1925年Gratia發(fā)現(xiàn)第一個細菌素以來，已發(fā)現(xiàn)上百種細菌可以產(chǎn)生細菌素[3,4]。而乳酸鏈球菌素(Nisin)是由某些乳酸乳球菌產(chǎn)生的具有34個氨基酸殘基的多肽類物質[5，6]，能對某些革蘭氏陽性菌，尤其對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等食源性致病菌起到強烈的抑制作用[7]。作為天然的抑菌劑，可以減少或避免化學防腐劑所帶來的安全隱患, 提高食品品質，是一類極具開發(fā)潛力的天然食品防腐添加劑[8]。

Nisin是由乳酸乳球菌產(chǎn)生的，但并非所有的乳酸乳球菌只產(chǎn)生Nisin，還有熱敏感的雙球菌素(diplococcin)、乳球菌素(lactococcin)等多種細菌素[9，10]。如今雖然許多文章對Nisin產(chǎn)生菌的篩選進行了研究，但大多停留在生理生化試驗的基礎上進行初步的斷定，在鑒定產(chǎn)生Nisin菌株的方法上尚不夠嚴謹。因此，能夠快速、準確地篩選到產(chǎn)Nisin的乳酸菌株，為天然抑菌物質與乳酸菌在發(fā)酵食品相結合的應用方面開辟更廣闊的前景，為生物食品抑菌劑提供理論基礎[11]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品及指示菌

市售新鮮小白菜葉；Nisin標準品：Sigma公司；H103大孔吸附樹脂：陜西樂博生化科技有限公司；金黃色葡萄球菌：由本實驗室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

改良GM17培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基)：酪蛋白胨5 g，大豆蛋白胨2.5 g，牛肉粉5 g，酵母浸粉5 g，蔗糖5 g，抗壞血酸0.5 g，β-甘油磷酸鈉，硫酸鎂0.25 g, 蒸餾水1000 mL，自然pH，若配制固體培養(yǎng)基則加入1.5%瓊脂。

篩選培養(yǎng)基：在改良的GM17培養(yǎng)基中添加0.004%溴甲酚紫和1500 IU/mg的Nisin標準品。

指示菌培養(yǎng)基：1% K2HPO4牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基: 牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，K2HPO410 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，自然pH。

1.1.3 試劑

三乙胺(分析純)、磷酸：天津市富宇精細化工有限公司；乙腈(色譜純)：上海星可高純溶劑有限公司；pH 3.0的水為用鹽酸溶液將超純水調至 pH (3.0±0.1)而得。

1.2 儀器與設備

ZHJH-C1214C垂直流超凈工作臺 上海智城分析儀器制造有限公司； BPH-9042恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司；HVE-50全自動高壓滅菌鍋 華粵集團有限公司；Rotavapor R-210 型旋轉蒸發(fā)儀 瑞士 Buchi 公司；LC-VP島津液相儀 日本島津公司；Inertsil ODS-3 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm ) 日本GL Sciences公司；實驗用水為 Milli-Q 純水儀制備的超純水。

1.3 方法

1.3.1 乳酸鏈球菌素母液的配制

稱取0.01 g Nisin標準品(原始效價為1000 IU/mg)，溶于20 mL 0.02 mol/L鹽酸溶液中，此時效價為5000 IU/mL, 使用前需經(jīng)孔徑為0.22 μL的微孔濾膜過濾除菌。

1.3.2 樣品處理

取市售新鮮小白菜葉，無菌水去除表面泥垢后，切片，大小在1 cm2為宜。

1.3.3 分離方法

將處理好的白菜葉片置于5 mL液體篩選培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h。將該富集培養(yǎng)液制備成10-4、10-5、10-6稀釋度的菌懸液，分別吸取0.1 mL涂布于固體篩選培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)48 h，挑取明顯使培養(yǎng)基變黃的單菌落，轉接到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液的酸度，將產(chǎn)酸的菌做革蘭氏染色鏡檢，最終得到革蘭氏陽性、球形、具有Nisin耐受性的乳酸菌菌株，以進行下一步的抑菌活性測定。

1.3.4 抑菌活性的測定1.3.4.1 指示菌懸液的制備

將金黃色葡萄球菌于1% K2HPO4牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，取生長量為107CFU/mL的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液作為指示菌懸液。

1.3.4.2 菌株發(fā)酵液的預處理

使用5 mol/L的HCl將30 ℃培養(yǎng)24 h的乳球菌發(fā)酵液調至pH 3，于90 ℃水浴30 min，6000 r/min離心8 min，去除沉淀，收集上清液備用。

1.3.4.3 牛津杯法測定抑菌活性

取0.2 mL指示菌懸液涂平板，待干燥后用無菌鑷子放置牛津杯(內徑6.0 mm,高8.0 mm)中。取經(jīng)預處理后的發(fā)酵上清液50 μL加入牛津杯內，并做陰性和陽性對照，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀測抑菌圈大小。

1.3.5 菌株鑒定

將具有抑菌特性的菌株提取基因組，由生工生物工程(上海)股份有限公司進行16S rDNA鑒定，數(shù)據(jù)提交美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information， NCBI)，通過基本本地隊列搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool， BLAST)進行同源性比較，用Mega 7.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.6 抑菌物質特性的初步探究與鑒定1.3.6.1 發(fā)酵時間對抑菌性的影響

將篩選的菌株接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃發(fā)酵培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)過程中分別在12～48 h期間，每4 h取發(fā)酵液，以牛津杯法做抑菌圈試驗(重復3次，取平均值)。

1.3.6.2 熱處理和pH對抑菌物質活性的影響

使用鹽酸溶液將30 ℃培養(yǎng)24 h的乳球菌發(fā)酵液分別調至pH 2～pH 9，于90 ℃水浴30 min熱處理，以未熱處理的發(fā)酵液做對照，以牛津杯法做抑菌圈試驗，測定抑菌物質的活性(重復3次，取平均值)。

1.3.7 高效液相色譜法(HPLC)分析1.3.7.1 發(fā)酵液濃縮純化

將30 ℃下培養(yǎng)24 h的發(fā)酵液調至pH 3.0，于90 ℃熱處理30 min并于冰上迅速放涼，離心10 min去除沉淀。然后通過搖瓶吸附的方法[12]，加入1%的H103大孔吸附樹脂，于37 ℃下?lián)u動吸附8 h后裝入層析柱。使用pH 3的75%乙醇溶液進行洗脫，洗脫液用 Nisin 活性 Buffer(pH 3的鹽酸水溶液)稀釋2倍，于旋轉蒸發(fā)儀上在低溫(30 ℃)懸蒸30 min，待乙醇除凈后，將溫度調至50 ℃將多余的水分懸蒸出去，最終得到稀釋前溶液體積的1/3，該溶液即為Nisin純化液。

1.3.7.2 流動相配制

緩沖液A：48 mmol/L三乙胺水溶液，用磷酸調至pH 3.0。

緩沖液B：緩沖液A與乙腈的混合液(緩沖液A體積含量為22.5%)。

1.3.7.3 標準品和樣品前處理

精確稱取0.01 g Nisin標準品，用0.02 mol/L鹽酸溶液溶解，使效價為10000 IU/mL，用孔徑0.22 μm的水相微孔濾膜過濾。純化液樣品，同樣用孔徑0.22 μm的水相微孔濾膜過濾。

1.3.7.4 色譜條件

流動相A，B兩相：0～15 min，緩沖液B由30%上升到50%；15～20 min，緩沖液B維持50%。

色譜柱：反向C18柱；柱溫：35 ℃；流速：1 mL/min；檢測波長：235 nm；進樣量：20 μL。

2 結果與分析

2.1 Nisin產(chǎn)生菌的平板初篩

在初篩過程中，通過設定4個篩選條件從樣品中定向篩選Nisin產(chǎn)生菌，以盡可能減少雜菌對試驗的影響。首先，基于Tsai H J等[13]的研究，編碼乳酸鏈球菌素前體的基因(nip+)和其抗性基因(nis+)以及蔗糖發(fā)酵基因(suc+)緊密連鎖。因此，以蔗糖作為唯一碳源，用于Nisin產(chǎn)生菌的篩選。其次，將培養(yǎng)基中添加一定效價的Nisin，可以減少部分革蘭氏陽性菌的生長，減少雜菌污染，而對于要篩選的產(chǎn)Nisin的乳酸乳球菌來講，由于其本身可以產(chǎn)生Nisin，因此，可以在具有一定效價的培養(yǎng)基上正常生長。再者，由于Nisin是由乳酸乳球菌產(chǎn)生的，因此，配以溴甲酚紫作指示劑，可以快速找到產(chǎn)酸的單菌落，將其挑出，劃線培養(yǎng)，見圖1。最后，通過革蘭氏染色，鏡檢(見圖1中B)，篩選革蘭氏陽性、細胞形態(tài)為球形的菌株。綜上，選擇同時具備上述4個條件特征的菌株進行下一步的抑菌試驗。

圖1 菌落形態(tài)A和細胞形態(tài)BFig.1 Colony morphology A and cell morphology B

2.2 菌株抑菌活性檢測

將初步篩選到的菌株進行抑菌圈試驗，驗證其發(fā)酵產(chǎn)物是否具有抑菌特性，見圖2。4個樣品均通過相同的處理， 1號為發(fā)酵培養(yǎng)基做陰性對照，4號是發(fā)酵培養(yǎng)基中加入了Nisin標準品的陽性對照?？梢钥吹讲缓蠳isin的1號沒有產(chǎn)生抑菌圈，而加入Nisin的3號產(chǎn)生了最大的抑菌圈，2號和4號為篩選到的具有較好抑菌效果的兩株菌，其中4號的抑菌圈更大，表現(xiàn)出更好的抑菌效果，將其命名為L-217。

圖2 兩株菌株的抑菌效果圖Fig.2 Antibacterial effect of two strains

2.3 菌種鑒定

將篩選到的具有較好抑菌效果的L-217菌株提基因組，PCR純化后，送到生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序分析，將得到的測序結果在NCBI中進行同源性比較，同源性較高的為乳酸乳球菌屬(Lactococcuslactis)，同源性大于99%。將其與搜索到的同源性大于97%的菌株，用Mega 7.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖3。發(fā)現(xiàn)L-217菌與乳酸乳球菌屬(Lactococcuslactis)最近，與山羊奶乳球菌屬(Lactococcushircilactis)、富士山乳球菌(Lactococcusfujiensis)和象白蟻乳球菌(Lactococcusnasutitermitis)親緣關系則較遠，結合菌株形態(tài)和生理生化特征等綜合分析， 鑒定該菌為乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)。

圖3 菌株L-217的16S rDNA 的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rDNA of strain L-217

2.4 產(chǎn)物的初步探究與鑒定

2.4.1 發(fā)酵時間對抑菌效果的影響

圖4 發(fā)酵時間對抑菌效果的影響Fig.4 Effect of fermentation time on antibacterial effect

由圖4可知，該菌在培養(yǎng)至12 h時開始產(chǎn)生抑菌物質，隨時間增加，抑菌活性快速提高，在生長至24 h時，表現(xiàn)出最大的抑菌活性。隨后，其抑菌活性呈現(xiàn)緩慢下降趨勢，這可能是培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質不足，該菌開始利用自身產(chǎn)生的抑菌物質。因此，將發(fā)酵培養(yǎng)24 h作為該菌抑菌活性測定的最佳發(fā)酵時間。

2.4.2 熱處理和酸處理對抑菌物質活性的影響

Nisin具有親水和疏水兩重性，即在N-末端存在大量的疏水殘基，在C-末端存在著親水基團，其表現(xiàn)出陽離子多肽的特性，等電點在堿性范圍；其溶解度和穩(wěn)定性等與溶液的pH值密切相關[14]。Nisin的溶解度隨pH值的下降而提高，而在堿性條件下幾乎不溶解。熱穩(wěn)定性與其在不同pH值下的溶解度有關。溶液在pH 2.5或更低值的鹽酸溶液中煮沸，其活性不發(fā)生變化，即使在115 ℃加熱一定時間還很穩(wěn)定。121 ℃加熱30 min，尚未完全失去活性。當pH值超過4時，溫度升高會使它在水溶液中迅速失活。根據(jù)這一特點，對篩選到的菌株產(chǎn)生的抑菌物質進行研究，可對抑菌物質是否為Nisin 進行初步的鑒定。

圖5 pH和熱處理對發(fā)酵液中抑菌物質的影響Fig.5 Effects of pH and heat treatment on bacteriostatic substances in fermentation broth

由圖5可知，未熱處理過的樣品，隨著pH的升高，抑菌物質的活性呈下降趨勢，在中性環(huán)境甚至是堿性環(huán)境下，不再具有抑菌活性，這與Nisin的溶解性特點相符合，隨著pH的升高，溶解度降低，其活性也不穩(wěn)定。此外，在pH 6時的抑菌圈直徑并沒有太大幅度的降低，從這一點可以排除是某些有機酸干擾下造成的假陽性，側面驗證了起到抑菌效果的物質就是細菌素。而在熱處理條件下，可以發(fā)現(xiàn)在pH 2、pH 3的條件下，90 ℃熱處理30 min，抑菌物質的活性和未熱處理過的樣品活性基本一致，說明該物質在pH 2～3的條件下，具有極高的耐熱性。這一點可以說明不是由乳酸乳球菌產(chǎn)生的不具有耐熱性的大分子雙球菌素，進一步證實該抑菌物質極有可能就是具有熱穩(wěn)定性的Nisin。同時熱處理的發(fā)酵液也可以排除過氧化氫對抑菌效果造成的假陽性干擾。

2.4.3 發(fā)酵液中抑菌物質的初純化

通過大孔樹脂動態(tài)吸附純化后，得到純化液中抑菌物質的濃度增大，表現(xiàn)出更好的抑菌活性，見圖6。

圖6 發(fā)酵液純化過程中各樣品抑菌效果圖Fig.6 Antimicrobial effect of each sample in the purificationprocess of fermentation broth

A，B，C，D對應的樣品分別是發(fā)酵液、吸附殘液、洗脫液、旋蒸濃縮液，將4個樣品做抑菌圈試驗，可以看到發(fā)酵液本身存在抑菌物質，表現(xiàn)出抑菌特性；經(jīng)大孔樹脂吸附后的殘液中不再具有抑菌活性，說明大孔樹脂將抑菌物質全部吸附；而用pH 3.0的75%酒精洗脫后，加入Nisin活性Buffer稀釋得到的洗脫液，產(chǎn)生了抑菌圈，說明抑菌物質被洗脫下來；最后通過旋蒸濃縮，去除溶液中酒精的同時，提高了樣品中抑菌物質的濃度。由圖6可知，旋蒸濃縮后的樣品，抑菌圈又顯著增大，為HPLC檢測做好了準備。

2.4.4 HPLC對產(chǎn)物的分析鑒定

目前國內外關于 Nisin 的檢測方法主要包括瓊脂擴散法、生物熒光法、電泳法、比濁法和免疫吸附法等[15-19]，而HPLC法用于測定Nisin含量不僅簡便快速、精密度高而且重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好，因此，本文釆用的檢測方法是Chan等[20]利用48 mmol/L三乙基胺磷酸鹽在232 nm下對Nisin的檢測方法。

圖7 濃縮純化液與Nisin標準品對比圖譜Fig.7 Contrast map of concentrated purified solution and Nisin standard sample

由圖7可知，Nisin標準品在11.4 min左右出現(xiàn)了吸收峰，出峰時間與所提供方法的出峰時間基本一致。因此，確定了Nisin的出峰時間；通過樣品與Nisin標準品的對比可以看出，在純化的樣品中雖然仍存在著許多雜質，但是它與標準品出現(xiàn)了同樣的吸收峰，證明該樣品中確實存在Nisin，印證了篩選到的就是產(chǎn)Nisin的乳酸乳球菌。

3 結論

本文根據(jù)乳酸乳球菌的特點先快速、準確篩選到具有抑菌特性的菌株，根據(jù)形態(tài)特征和生理生化特性，并通過16S rDNA序列分析技術，將其確定為乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)，命名為L-217。再進一步通過熱處理和酸處理試驗對抑菌物質性質進行初步的探究，最后通過HPLC法與Nisin標準品進行比對發(fā)現(xiàn)：該菌株產(chǎn)生的抑菌物質與Nisin標準品在同樣的時間具有吸收峰。綜合這兩方面的結果，可以認定該菌株為具有產(chǎn)Nisin特性的乳酸乳球菌。本文從乳酸菌的篩選、Nisin的吸附、濃縮、純化，HPLC檢測進行分析，建立了一套快速、準確篩選Nisin產(chǎn)生菌株的方法，為從自然界中Nisin產(chǎn)生菌株的篩選和鑒定提供了有效依據(jù)，為天然食品添加劑Nisin的生產(chǎn)以及以此菌株為基礎的功能食品、醫(yī)用食品等領域提供了重要的菌株資源。