山楂不同炮制方法對5-羥甲基糠醛含量及抗氧化活性的影響

劉暢，宮瑞澤，張磊，夏蘊實,2，華梅，孫印石※

（1.中國農業(yè)科學院特產研究所，長春 130112；2.吉林農業(yè)大學，長春 130118）

大部分中藥在加工和炮制過程中會產生5-羥甲基糠醛（5-HMF），其主要來源于加工過程中發(fā)生的美拉德反應（Maillard reaction）及焦糖化反應[1]。5-HMF 的產生與熱加工程度密切相關，可用于指示中藥的炮制程度，現(xiàn)已成為中藥炮制原理研究的指標性成分，并且是近年來中藥炮制研究的熱點之一[2,3]。

山楂的炮制品有4 種，分別是生山楂、炒山楂、焦山楂和山楂炭，均是通過熱加工炮制而成，熱加工程度的不同造就了不同的外觀形態(tài)和不同的藥用功效。生山楂的酸味最強，藥性較猛，其功效為活血散瘀、消化積食、降血脂；炒山楂顏色稍深，藥性比生山楂溫和，活血化瘀的能力較生山楂稍弱，用于積食停滯、脾虛食滯；焦山楂顏色更深，可消食導滯、治療伴有積食的瀉痢；山楂炭熱加工程度最高，顏色最深，具有收斂作用，能治療血積[4,5]。

不同山楂炮制品的不同功效與炮制加工過程中藥材成分的變化密切相關。有研究發(fā)現(xiàn)，山楂的炮制隨溫度和加熱時間的延長，總黃酮[5]、水溶性有機酸[6,7]、總磷脂含量下降[8]，亞硝酸鹽含量有所增加[8]?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，熱加工產生的5-HMF 具有抗氧化、改善血液微循環(huán)及流變性、改善心肌缺血、降血糖、影響甘草酸代謝等作用[1,5]。山楂中含有大量能夠參與生成5-HMF 的前體類物質，因此，探討山楂不同炮制品中5-HMF的產生和影響因素以及不同炮制品的抗氧化作用對研究山楂的加工炮制及藥理藥效具有重要意義。

1 材料、儀器與試劑

1.1 材料

原藥材山楂于2018 年10 月購自山東臨沂農貿市場，為薔薇科植物山里紅（Crataegus pinnatifida Bge uar. Major N.E.Br.）的成熟果實，參照《中國藥典》中的山楂炮制方法[9]對樣品進行炮制。生山楂：山楂切片后30℃烘干，放冷；炒山楂：取生山楂片置鍋內用文火炒制顏色加深后取出，放冷；焦山楂：取生山楂片置鍋內以武火炒至外表焦褐色，內部黃褐色后取出，放冷；山楂炭：取生山楂片，置鍋內以武火炒至外表黑色，內部焦褐色后取出，放冷。實驗前將4 種山楂炮制品分別進行粉碎過40 目篩后備用。

1.2 儀器與試劑

LC-16 型高效液相色譜儀〔島津企業(yè)管理（中國）有限公司〕；Berghof Speed Wave MSW-4 型微波消解儀（德國 BERGHOF 分析集團有限公司）；Hitachi L-8900 型全自動氨基酸分析儀〔日立（中國）有限公司〕；Perkin Elmer NexION 350X 型電感耦合等離子體質譜儀（美國珀金埃爾默股份有限公司）；752N型紫外可見分光光度計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；5-HMF 標準品（純度＞99%，上海源葉生物科技有限公司）；氨基酸混合標準液（H型，日本和光純藥株式會社）；甲醇〔色譜純，美國賽默飛世爾科技（中國）有限公司〕；其它試劑均為分析純（北京化工廠）。

2 方法

2.1 5-HMF 含量測定

2.1.1 供試品溶液的制備 參考標準GB/T 18932.18-2003[10]及文獻[11]的方法，準確稱取山楂炮制品樣品粉末2.0g，每個樣品3 份，置于5mL離心管中，加10%甲醇30 mL，超聲提取30 min，放冷，以10%甲醇補足減失的質量，4 000 min 離心5min，取上清，沉淀重復提取1 次，合并2 次上清液，用0.22m 濾膜濾過，作為供試品溶液。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取對照品5-HMF，以10%甲醇配成230g/mL 的對照品儲備液，4 ℃低溫保存。

2.1.3 色譜條件[12]Hypersil ODS2 色譜柱（250 mm 4.6 mm，5m）；流動相：水（A）-甲醇（B）；梯度洗脫（0～5 min，5% A；5～15 min，5%～15% A；15～20 min，15%～0% A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：284 nm；柱溫 30 ℃；進樣量：20L。色譜圖見圖1。

圖1 5-HMF 對照品（A）和山楂樣品（B）的色譜圖Fig.1 HPLC of 5-hydroxymethylfurfural reference substances(A),C.pinnatifida sample(B)

2.1.4 線性關系考察 準確吸取5-HMF 對照品儲備液適量，并進行梯度稀釋成不同濃度的對照品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件進行測定，以色譜峰峰面積為縱坐標（Y）、對照品濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線，得回歸方程為Y ＝132 025 X－239 961，R2＝0.999，結果表明，5-HMF 在2.3～230g/mL 線性關系良好。

2.1.5 精密度試驗 準確吸取5-HMF對照品溶液20L，按“2.1.3”項下色譜條件進行分析，連續(xù)進樣6 次，測定并計算5-HMF 峰面積的RSD 為2.05%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 準確吸取“2.1.1”項下焦山楂供試液20L，分別在 0、2、4、6、8、10 h 按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，計算5-HMF 峰面積的RSD 為1.84%，表明該儀器在10 h 內穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復性試驗 準確稱取焦山楂6 份，每份2.0 g，按“2.1.1”項下制得供試品溶液，精密吸取6 份供試品溶液各20L，按“2.1.3”項下色譜條件進樣分析，測定峰面積RSD 為2.52%，表明本方法重復性良好。

2.1.8 回收率試驗 精密稱取6 份已知5-HMF 含量的焦山楂粉末1.5 g，加入適量的5-HMF對照品溶液，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件測定峰面積并計算含量及回收率。結果5-HMF的平均加樣回收率為101.09%，RSD為1.82%，表明本方法加樣回收率良好。

2.2 氨基酸含量測定

2.2.1 樣品的前處理 參考標準GB/T5009.124-2016[13]，精密稱取山楂炮制樣品500mg，加入6mol/LHCl20mL，110 ℃下水解22 h，冷卻至室溫。各取800L 于 70 ℃揮干溶劑。以0.02 mol/L HCl 溶解并定容2 mL，以0.22m 水系過濾器濾至樣品瓶，上機備用。

2.2.2 氨基酸標準譜圖的繪制 氨基酸混合標準液濃度2.5 mmol/L。以0.1 mol/L HCl 將混合標準液稀釋1 000 倍，參考標準GB/T 5009.124-2016 對標準品進行上機測試。檢測波長：570 nm 和440 nm。

2.3 總糖和還原糖含量的測定

2.3.1 供試品溶液的制備 準確稱取山楂炮制品樣品粉末0.50 g，加入30 mL 去離子水，于80 ℃水浴中提取30 min，放冷至室溫后加入去離子水定容至50 mL，作為測定還原糖供試品溶液。準確稱取山楂炮制品粉末0.5 g，加入10 mL 6 mol/L HCl 及15 mL 去離子水，沸水浴中提取30 min，滴1 滴酚酞指示劑，以6 mol/L NaOH 調至 pH 7.0，定容至 100 mL，以 I2-KI 判斷是否水解完全，作為測定總糖供試品溶液。

2.3.2 對照品溶液的配制 105 ℃烘葡萄糖對照品至恒重，精密稱取一定質量，以蒸餾水配制成0.1～1.0mg/mL的對照品溶液。

2.3.3 標準曲線的繪制 精密吸取1.0 g/L 的葡萄糖對照品溶液 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 于 5 mL 離心管中，加蒸餾水至0.5 mL，加0.5 mL DNS 顯色液，渦旋混勻后置沸水浴保持5 min，迅速冷卻，各加入4 mL去離子水，搖勻后以空白管為對照，測定540 nm 波長處的吸光度（A）。以葡萄糖質量濃度為橫坐標（X）、A 值為縱坐標，繪制標準曲線，計算線性回歸方程為Y=0.812 7 X+0.012 1，R2=0.999 1，線性范圍為0.2～1.0 mg/mL。

2.4 總有機酸測定

采用中和滴定方法，參照文獻[5]，以酚酞指示劑確定滴定終點。準確稱取各山楂炮制品粉末1.0 g，加入去離子水100 mL，浸泡4 h，期間不時搖晃。過濾后各取25 mL，加入50 mL 去離子水，加入2 滴酚酞，以0.1 mol/L NaOH 滴定。總有機酸以NaOH 相當于枸櫞酸的量表示[14]。

2.5 總黃酮的測定

2.5.1 供試品溶液的制備 精密稱取各山楂炮制品粉末1.0 g，加入35 mL 乙醇-水溶液（乙醇與水的體積比為 75∶100），80 ℃回流提取 1.5 h，提取 3 次，合并提取液，于蒸發(fā)皿蒸干。各蒸干樣品加入40 mL 水溶解，過0.45m 濾膜待用。

2.5.2 標準溶液的制備 配置蘆丁標準溶液2 mg/mL待用。

2.5.3 標準曲線的繪制 采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 法。參照2015 版藥典方法[9]（稍有改動），精密吸取 2.0mg/mL蘆丁對照品溶液0、0.6、1.2、1.8、2.4、3.0、3.6 mL 于25 mL 容量瓶中，加入去離子水至6 mL，分別加入5%NaNO2溶液1mL搖勻，放置6 min，分解加入1% Al（NO3）3 溶液1 mL，搖勻，放置6 min，分別加入4%NaOH溶液10 mL，再加水至刻度，放置15 min，在波長500 nm 下測定吸光度，繪制標準曲線。

2.5.4 供試樣品的測定 精密吸取待測樣5 mL，按“2.5.3”項下的方法測定供試樣品的吸光度?？傸S酮含量按蘆丁計算。

2.6 1,1 一二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）測定[15]

將19.7 mg DPPH溶解于無水乙醇中，定容至100 mL容量瓶中，避光。臨用前用乙醇稀釋，在525 nm 處測定其吸光度滿足0.70 ± 0.05 為工作液。取各濃度供試溶液（0～20 mg/mL）0.2mL，加入DPPH 溶液3.8mL，搖勻，避光反應30 min后，以80%乙醇為空白調零，在525 nm 處測定其吸光度。按照清除率=（A0 A1）/A0 100%計算DPPH 自由基清除率。

3 結果與分析

3.1 山楂炮制品中5-HMF的含量

不同山楂炮制品中的5-HMF 含量見表1，由表1可知，生山楂中5-HMF含量未檢測出，炒山楂、焦山楂、山楂炭中5-HMF 的含量分別為1.10、1.59、4.41g/kg。通過比較發(fā)現(xiàn)，不同山楂炮制品中5-HMF含量存在一定規(guī)律，即隨著熱加工程度的提高，5-HMF 的含量也隨之提高。生山楂中5-HMF 含量未檢測出，而熱加工程度較高的山楂炭中5-HMF含量最高，這說明炮制過程中的高溫處理是5-HMF 產生的主要原因。高溫不僅加快了糖類物質的脫水縮合，也加劇了山楂中糖類與氨基酸發(fā)生美拉德反應的程度。

3.2 不同山楂炮制品的氨基酸含量

山楂不同炮制品的氨基酸含量見表2，由表2 可知，生山楂、炒山楂、焦山楂、山楂炭中總氨基酸含量為1 022.57、1 149.04、689.47、146.35 mg/100g，含量較高的有天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、賴氨酸，含量下降較明顯的有天冬氨酸、絲氨酸、甘氨酸、精氨酸、賴氨酸、組氨酸。4 種山楂炮制品隨熱加工程度的提高，氨基酸總量呈現(xiàn)銳減的趨勢，推測熱加工過程中發(fā)生美拉德反應并生成了5-HMF 等產物是造成氨基酸含量降低的主要原因。其中，組氨酸、賴氨酸、精氨酸為堿性氨基酸，在美拉德反應中反應速度比其它氨基酸快，因此其含量下降最為明顯，對山楂炮制品中5-HMF的生成貢獻較大。

表1 不同山楂炮制品中5-HMF 含量Table 1 5-hydroxymethylfurfural content of C.pinnatifida with different processing method

表2 不同山楂炮制品中氨基酸含量Table 2 Amino acids content of C.pinnatifida with different processing method

3.3 不同山楂炮制品的總糖和還原糖含量

不同山楂炮制品的總糖和還原糖含量見表3，由表3 可知，生山楂、炒山楂、焦山楂、山楂炭的總糖含量分別為 7.94、7.93、7.18、6.48 mg/kg，還原糖含量分別為6.05、5.66、4.84、4.00 mg/kg。5-HMF 的形成與糖含量豐富食品的熱加工過程密切相關，主要由以下2 種途徑產生：一是糖類成分在酸性環(huán)境中受熱分解產生，且含量隨著溫度的升高而增加[16]；二是羰基化合物（還原糖類）與氨基化合物（蛋白質和氨基酸）發(fā)生美拉德反應而產生[17]。通過對山楂炮制品中總糖和還原糖的檢測發(fā)現(xiàn)，隨著熱加工程度的提高，山楂炮制品中總糖與還原糖的含量均出現(xiàn)顯著降低（P ＜0.05），這與各山楂炮制品中5-HMF 的變化規(guī)律相吻合，且還原糖降幅更大，這是因為參與美拉德反應的糖主要是還原糖。

表3 不同山楂炮制品的總糖和還原糖含量Table 3 Total sugar and reducing sugar content of C.pinnatifida with different processing method

3.4 不同山楂炮制品中有機酸含量

不同山楂炮制品中有機酸含量見表4，由表4 可知，生山楂、炒山楂、焦山楂、山楂炭中有機酸含量分別為相當于枸櫞酸含量87.08、79.40、71.72、58.92 mg/g。中藥炮制過程中有機酸對5-HMF生成影響較復雜，有研究者發(fā)現(xiàn)，在高溫液態(tài)水中部分有機酸的存在能促進果酸→5-HMF→乙酰丙酸的反應速度，有些種類的酸（例如：乙酸）主要促進中間產物5-HMF 的生成，有些種類的酸（例如：甲酸）既能促進5-HMF 的生成，又能促進其分解[18]。山楂中有機酸的種類較多，主要是檸檬酸[19]，檸檬酸是一種三羧酸化合物，受熱易分解。有研究表明，檸檬酸對于美拉德反應體系中5-HMF的產生具有催化作用[20]，但也有研究表明，在富含有機酸的中藥（如：五味子）的炮制中，有機酸的含量對于5-HMF 的產生并無明顯影響[21,22]。

表4 不同山楂炮制品中總有機酸含量Table 4 The total organic acids content of C.pinnatifida with different processing method

3.5 不同山楂炮制品中總黃酮的含量

不同山楂炮制品中總黃酮含量見表5，由表5 可知，生山楂、炒山楂、焦山楂、山楂炭中總黃酮含量分別為 166.75、160.17、55.85、49.45 mg/g。隨加熱程度的提高，總黃酮含量呈現(xiàn)明顯的下降趨勢。這是因為，以蘆丁為代表的黃酮類化合物，在高溫加熱時會發(fā)生分解，尤其是焦山楂和山楂炭，加熱溫度均可達到200 ℃以上，在此溫度下，黃酮類化合物的分解加速[23]，因此測得相應樣品的總黃酮含量降低。劉黃友等[24]的研究表明，幾種最常見的天然黃酮在一定溫度和時間范圍對5-HMF的產生具有抑制作用，推測可能高溫導致黃酮類的降解，使其濃度低于美拉德反應生成5-HMF的最佳抑制濃度，因此，有利于5-HMF 含量的積累。但山楂總黃酮對5-HMF的抑制作用作用未見報道，尚需進一步研究?？傸S酮中的黃酮苷水解產生的糖類化合物則可能為5-HMF的產生提供反應原料，盡管其含量不高，但這部分糖類化合物對于5-HMF的產生可能發(fā)揮的促進作用不應被忽視。

表5 不同山楂炮制品中總黃酮含量Table 5 The total flavones content of C.pinnatifida With different processing method

圖2 不同山楂炮制品提取液DPPH 自由基清除率Fig.2 DPPH free radical scavenging rate of C.pinnatifida with different processing method

3.6 4種山楂炮制品提取液的DPPH抗氧化活性

不同濃度提取液的DPPH自由基清除率結果見圖2。隨著山楂各炮制品提取液濃度的提高，DPPH 自由基清除率呈現(xiàn)上升的趨勢。生山楂20.0 mg/mL 提取液的DPPH自由基清除率為95.60%，隨著熱加工程度的提高，DPPH自由基清除活性出現(xiàn)下降；相同提取液濃度下炒山楂的DPPH自由基清除率為94.90%、焦山楂為85.65%；山楂炭雖然熱加工程度進一步提升，但其相同濃度提取液的DPPH 自由基清除率（88.16%）反而略有提升。4 種山楂炮制品的IC50 分別為5.20、5.69、7.70 mg/mL 和6.77 mg/mL。IC50 的數(shù)值反應了山楂炮制品提取物的抗氧化活性，生山楂的抗氧化能力最強，炒山楂和焦山楂依次下降，山楂炭抗氧化能力較焦山楂略有提升。

隨著熱加工程度的提高，生山楂、炒山楂、焦山楂和山楂炭DPPH 自由基的清除活性存在一定規(guī)律，即先下降后上升。黃酮及多酚等對于植物樣品的抗氧化作用起著主要作用，許多研究者證實，樣品中黃酮含量與抗氧化能力正相關[25,26]，且差異顯著。魯青松等[27]的研究結果也證實了有機酸具有較強的抗氧化活性。在本研究中，隨著熱加工程度的提高，總黃酮和有機酸破壞程度提高，其含量出現(xiàn)大幅下降，這可能與生山楂、炒山楂、焦山楂的抗氧化活性依次下降有關，而熱加工程度最高的山楂炭的 DPPH 自由基清除活性卻相對焦山楂略有提高。盡管許多研究者證實了美拉德反應產物的抗氧化活性[28-29]，王淳等[29]的研究表明，在中藥黃精炮制過程中美拉德反應產物對DPPH自由基的清除率雖然隨炮制時間延長呈增加趨勢，但因山楂中的成分復雜，仍然不能確認山楂炭提取物的抗氧化能力的提升是由美拉德反應產物所引起的，因此，山楂炮制品抗氧化能力變化的物質基礎仍然需要進一步研究驗證。

表6 不同山楂炮制品提取液的IC50Table 6 IC50 of C.pinnatifida with different processing method

4 結論

5-HMF 廣泛存在于中藥材的加工炮制品中。本研究首次報道了不同山楂炮制品5-HMF的含量，對研究各山楂炮制品成分和藥理藥效的關系具有重要意義。隨著熱加工程度的提高，山楂炮制品中5-HMF 含量顯著增加，山楂炭中5-HMF 的含量達到最高。

通過檢測山楂炮制加工過程中一些化學成分的變化，探討山楂炮制過程中影響5-HMF 產生的因素。炮制品中的氨基酸、總糖、還原糖、有機酸、黃酮類物質隨著熱加工程度的提高均呈現(xiàn)出有規(guī)律的變化，本試驗得到的變化規(guī)律同已有研究結果[8]相吻合。其中，5-HMF 的生成消耗了氨基酸、總糖及還原糖，使其含量下降，尤其是堿性氨基酸和還原糖。在山楂的炮制中，熱加工導致有機酸和黃酮類物質破壞程度加大，其與5-HMF 的生成關系，有待進一步研究。

加工炮制使得多種成分發(fā)生變化，其抗氧化活性也具有規(guī)律性的變化。山楂中本身含有許多抗氧化物質，如黃酮類成分和有機酸等。熱加工程度的提高對這些物質的破壞逐漸增加，導致抗氧化能力的下降。山楂炭的熱加工程度最高，而抗氧化能力較焦山楂略有提高，可能由于熱加工產生了新的物質，如美拉德反應產物，但其物質基礎仍然需要進一步實驗驗證。