高越穎，劉 蕾，惠人杰

(江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122 )

0 引 言

制藥工程專業(yè)是培養(yǎng)具有新藥研究與開發(fā)的基本能力，能夠解決制藥工程實(shí)際問題能力的人才，注重的問題是如何評(píng)價(jià)所產(chǎn)生藥品的藥學(xué)質(zhì)量。藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)正是培養(yǎng)這種能力的主要學(xué)科之一。近年來(lái)，我院藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)不斷更新實(shí)驗(yàn)教學(xué)項(xiàng)目，增加開放設(shè)計(jì)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)，以培養(yǎng)學(xué)生藥物評(píng)價(jià)能力、科研創(chuàng)新能力及解決制藥工程實(shí)際問題的能力[1-3]。

藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究是藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)的重要內(nèi)容，對(duì)藥物研究開發(fā)、臨床合理用藥和藥品質(zhì)量控制具有重大的理論和實(shí)用價(jià)值[4-5]，但傳統(tǒng)教材中的研究對(duì)象(如溴磺酞鈉/水楊酸鈉)及血藥濃度分析方法(紫外分光光度法)較為陳舊，不利于激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)興趣及科研創(chuàng)新能力的培養(yǎng)。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)為現(xiàn)代分析技術(shù)中的成熟技術(shù)，廣泛應(yīng)用于科研及制藥行業(yè)[6-9]，一般本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中對(duì)該類技術(shù)的介紹較少。為此，課程結(jié)合學(xué)院科研成果，引入現(xiàn)代分析技術(shù)，設(shè)計(jì)了題為“化合物X在小鼠體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究”實(shí)驗(yàn)。以學(xué)院自主研發(fā)的一種新型抗血吸蟲化合物——吡喹酮類似物為研究對(duì)象，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)作為血藥濃度分析方法，研究了該化合物在小鼠體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征。通過(guò)該實(shí)驗(yàn)，學(xué)生不僅能鞏固藥理學(xué)基礎(chǔ)理論知識(shí)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基本實(shí)驗(yàn)操作技能，也能深入、全面、系統(tǒng)地掌握一般化學(xué)藥物的藥物代謝動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)原則與研究方法，了解和掌握前沿分析測(cè)試技術(shù)，切實(shí)提高了學(xué)生綜合運(yùn)用知識(shí)的能力。

1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

1.1 儀 器

Quattro LC MicroMass三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，2695型液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；vortex3000渦旋震蕩混勻儀，德國(guó)WIGGENS公司；TGL-16G離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 材料與試劑

吡喹酮類似物為本實(shí)驗(yàn)自制；吡喹酮(PZQ)對(duì)照品(濰坊三江醫(yī)藥化工公司)；甲醇、乙腈(色譜純，TEDIA)；超純水。

1.3 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

ICR小鼠，雄，SPF級(jí)，體質(zhì)量(18～22 g)，由揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件及質(zhì)譜條件

(1)色譜條件。色譜柱：Luna 3u C18(2)柱 (2×100 mm，3 micron)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)；流速：0.3 mL/min；柱溫：35 ℃。流動(dòng)相梯度洗脫比例見表1。

表1 HPLC-MS/MS流動(dòng)相梯度洗脫條件

(2)質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧離子化源(ESI)；正離子模式；毛細(xì)管電壓3.32 kV；錐孔氣流量45 L/h；脫溶劑氣溫度：350 ℃；離子源溫度：100 ℃；脫溶劑氣流量550 L/h。質(zhì)譜檢測(cè)器選擇性監(jiān)測(cè)條件見表2。

表2 HPLC-MS/MS質(zhì)譜檢測(cè)器監(jiān)測(cè)參數(shù)

2.2 溶液制備

(1)對(duì)照品溶液。精密稱取吡喹酮類似物50 mg，置于50 mL容量瓶中，加入100%甲醇溶解并定容，得到1 g/L母液，精密吸取母液用乙腈稀釋成 7.0，5.0，3.0，1.0，0.10 mg/L的系列樣品。

(2)內(nèi)標(biāo)溶液。精密稱取內(nèi)標(biāo)5.0 mg置于25 mL容量瓶中，加入100%乙腈溶解并定容，得到0.2 μg/mL 的內(nèi)標(biāo)母液。

2.3 血漿樣品處理

取血漿樣品100 μL，置2 mL離心管中，加入吡喹酮內(nèi)標(biāo)溶液10 μL(0.2μg/mL)，乙腈240 μL，渦旋60s，離心8 min(12 000 r/min)，取上清經(jīng)自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣10 μL，進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取7.0，5.0，3.0，1.0，0.10 mg/L乙腈溶解的吡喹酮類似物 10 μL，加入到90 μL小鼠空白血漿中，按“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理測(cè)定。以吡喹酮類似物的峰面積A1/內(nèi)標(biāo)峰面積A2為縱坐標(biāo)，濃度C (μg/L)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.5 藥物代謝動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)

雄性昆明種小鼠24只，隨機(jī)分成3組，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水，按20 mg/kg灌胃吡喹酮類似物溶液。于給藥后0.5、1、2、2.5、3、4、5、6 h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別從各組取1只小鼠，摘眼球取血，置于1.5 mL離心管中(肝素預(yù)處理抗凝)，離心(3 500 r/min,5 min)，取血漿，按“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理測(cè)定，計(jì)算血漿吡喹酮類似物濃度。將各時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)用DAS2.0軟件計(jì)算藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按“2.4”項(xiàng)下方法分析結(jié)果，計(jì)算出相應(yīng)的回歸方程：A1/A2=0.046 9C+2.324 8，R2=0.998 2，結(jié)果表明吡喹酮類似物在10～700 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見圖1。

圖1 吡喹酮類似物的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)

小鼠灌胃吡喹酮類似物溶液后，各時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的平均血藥濃度見圖2。用DAS2.0軟件擬合，其藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征用統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)表示，結(jié)果見表3。研究結(jié)果顯示，吡喹酮類似物單次給藥在1.667 h左右達(dá)到最大濃度，其最大濃度為61.067 μg/L，血漿消除半衰期T1/2為9.569 h。

圖2 血漿中吡喹酮類似物的濃度-時(shí)間曲線(n=3)

表3 吡喹酮類似物的主要藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)

4 討 論

4.1 課程設(shè)計(jì)

本設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)由學(xué)生根據(jù)已有資料及實(shí)驗(yàn)室條件自行設(shè)計(jì)，老師組織學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行論證，選取最優(yōu)方案進(jìn)行實(shí)施，實(shí)驗(yàn)實(shí)施過(guò)程中教師進(jìn)行適當(dāng)指導(dǎo)。

臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)主要研究?jī)?nèi)容包括：血藥濃度-時(shí)間曲線、吸收、分布、排泄、與血漿蛋白的結(jié)合、生物轉(zhuǎn)化、對(duì)藥物代謝酶活性的影響等內(nèi)容。本文選擇“血藥濃度-時(shí)間曲線”進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)過(guò)程大致如下：將目標(biāo)化合物通過(guò)適當(dāng)方式給予受試動(dòng)物，然后按照一定的時(shí)間間隔采集血樣，采用合適的分析方法測(cè)定血樣中的藥物濃度，由此得到一系列的血藥濃度對(duì)時(shí)間變化的數(shù)據(jù)，從而求出藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。全班分3大組，每組負(fù)責(zé)完成一條藥-時(shí)曲線的樣本采集，即每個(gè)時(shí)間點(diǎn)從一只小鼠取血、取材，則全班每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的重復(fù)數(shù)為3(n=3)，給藥、取血、血漿樣品處理及血藥濃度測(cè)定等步驟分別由同一位學(xué)生完成，以保證給藥、取血時(shí)間的一致性，以及檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，減少由不同學(xué)生取血造成的組內(nèi)誤差，由表3可見存在一定的組間誤差，有可能由于不同組間取血人員的不同造成。但實(shí)驗(yàn)過(guò)程中小組成員既有分工又有合作，每位學(xué)生均能參與操作并能了解到完整的實(shí)驗(yàn)過(guò)程，對(duì)學(xué)生的團(tuán)隊(duì)協(xié)助精神很有幫助。

樣品測(cè)定前由帶教老師先調(diào)試好儀器，由同一位學(xué)生完成標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配置及檢測(cè)，并用同一臺(tái)儀器進(jìn)行檢測(cè)；各組學(xué)生只需進(jìn)行血漿樣本的處理，并通過(guò)0.45 μm濾器過(guò)濾到進(jìn)樣瓶中，放到自動(dòng)進(jìn)樣器中，等待自動(dòng)進(jìn)樣分析。

4.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的拓展

考慮到實(shí)驗(yàn)課時(shí)的限制，在完成教學(xué)任務(wù)、保證教學(xué)質(zhì)量的基礎(chǔ)上，課堂上選擇重點(diǎn)、有代表性的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容完成，其他內(nèi)容作為選做實(shí)驗(yàn)或開放實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)，供學(xué)生課后完成。

藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究?jī)?nèi)容中的“組織分布”內(nèi)容，課堂上完成心、肝、脾、肺、腎、胃腸道、腦等組織的取材，供學(xué)生課后進(jìn)行組織中藥物濃度的測(cè)定，以了解藥物在體內(nèi)的主要分布組織。

液質(zhì)聯(lián)用分析方法學(xué)部分，將線性關(guān)系考察、樣品前處理及樣品測(cè)定作為重點(diǎn)掌握的內(nèi)容。儀器結(jié)構(gòu)介紹、工作原理、使用注意事項(xiàng)、等相關(guān)知識(shí)點(diǎn)作為學(xué)生課前預(yù)習(xí)內(nèi)容。一般方法學(xué)分析包括：線性關(guān)系的考察、色譜、質(zhì)譜條件的優(yōu)化，專屬性、穩(wěn)定性、精密度、回收率等實(shí)驗(yàn)[10-12]。課題組前期通過(guò)大量預(yù)實(shí)驗(yàn)完成了該化合物含量測(cè)定的方法學(xué)研究，檢測(cè)方法靈敏、穩(wěn)定、可靠。為了讓學(xué)生完整、系統(tǒng)了解分析方法的建立，線性關(guān)系內(nèi)容之外的部分由學(xué)生課后參與或獨(dú)立完成。

4.3 數(shù)據(jù)分析及報(bào)告撰寫

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制及樣品血藥濃度的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果由帶教老師整理，學(xué)生根據(jù)吡喹酮類似物及內(nèi)標(biāo)的峰面積，通過(guò)Excel、Graphpad Prism 5等軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并建立線性回歸，各時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得。通過(guò)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果的分析，學(xué)生可以探討標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍及梯度設(shè)置是否合理,通過(guò)何種指標(biāo)判斷線性關(guān)系是否良好，跟哪些操作過(guò)程有關(guān)。

(2)藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算。學(xué)生可以根據(jù)所學(xué)理論知識(shí)利用公式進(jìn)行計(jì)算，該方法的優(yōu)勢(shì)在于可以幫助學(xué)生加深藥物代謝動(dòng)力學(xué)概念的理解及公式的推導(dǎo)計(jì)算過(guò)程。此外，也可以通過(guò)藥物代謝動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)處理軟件DAS2.0等進(jìn)行計(jì)算，該方法可以幫助學(xué)生掌握藥物代謝動(dòng)力學(xué)軟件的使用，迅速得到相應(yīng)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)，另一方面可以驗(yàn)證公式推導(dǎo)的計(jì)算結(jié)果是否正確，準(zhǔn)確分析藥物的體內(nèi)過(guò)程，大大提高教學(xué)效率及質(zhì)量。

(3)實(shí)驗(yàn)報(bào)告。實(shí)驗(yàn)完成后學(xué)生需撰寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告，并就實(shí)驗(yàn)中存在的問題進(jìn)行交流和討論，總結(jié)實(shí)驗(yàn)的得失。例如，按照新藥指導(dǎo)原則，采樣時(shí)間點(diǎn)的設(shè)計(jì)應(yīng)兼顧藥物的吸收相、平衡相(峰濃度附近)和消除相。一般在吸收相至少需要2～3個(gè)采樣點(diǎn)，整個(gè)采樣時(shí)間至少應(yīng)持續(xù)到3～5個(gè)半衰期，或持續(xù)到血藥濃度為Cmax的1/10～1/20。從圖2來(lái)看，取血時(shí)間點(diǎn)欠佳，應(yīng)考慮增加吸收相的取血點(diǎn)；由表3可見，藥物血漿半衰期t1/2z=9.569±8.077 h，而取樣時(shí)間只到6 h，應(yīng)延長(zhǎng)采血時(shí)間，保證結(jié)果的可靠性。該過(guò)程需要學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程進(jìn)行深層次的思考，綜合運(yùn)用知識(shí)分析問題，對(duì)學(xué)生的思維能力、信息處理能力及表達(dá)能力有較好的鍛煉。

5 結(jié) 語(yǔ)

隨著素質(zhì)教育的提出，以大型精密儀器為教學(xué)平臺(tái)，結(jié)合科學(xué)研究熱點(diǎn)內(nèi)容，引入新技術(shù)新方法，不斷優(yōu)化教學(xué)內(nèi)容，探索新的教學(xué)方法，已成為高校教學(xué)改革的趨勢(shì)[13-15]。該類型設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)已在我院本科教學(xué)過(guò)程中順利開展，取得了不錯(cuò)的教學(xué)效果。課程結(jié)合學(xué)院在藥物化學(xué)方面的科研成果，以評(píng)價(jià)新化合物的臨床前藥理學(xué)研究為內(nèi)容，更好地激發(fā)了學(xué)生的學(xué)習(xí)熱情。通過(guò)引入液相、串聯(lián)質(zhì)譜、高速冷凍離心機(jī)等大型、精密分析儀器進(jìn)行實(shí)驗(yàn)教學(xué)，不僅提高了大型儀器利用率，更拓展了學(xué)生視野，為培養(yǎng)高素質(zhì)掌握現(xiàn)代分析技術(shù)的藥學(xué)人才創(chuàng)造了條件[16]。通過(guò)實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)、分析解決實(shí)驗(yàn)過(guò)程中遇到的問題，以及對(duì)結(jié)果的處理分析等環(huán)節(jié)的鍛煉，切實(shí)提高了學(xué)生科研創(chuàng)新能力及解決制藥工程實(shí)際問題的能力。