呂趙劼，王志浩，盧淑嫻，劉沛蓉，田靜

短指(趾)癥及指(趾)骨發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制

呂趙劼，王志浩，盧淑嫻，劉沛蓉，田靜

西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實驗室，西安 710069

短指(趾)癥(brachydactyly, BD)是一類指(趾)骨或掌(跖)骨的異?？s短或缺失而造成的手/足畸形病變。從臨床表型上短指(趾)癥可以分為單純型短指(趾)癥以及包含短指(趾)癥狀的綜合征，其中單純型短指(趾)癥又分為5種類型：BDA、BDB、BDC、BDD和BDE，而每一類型又分為不同的亞型。作為一類重要的分子疾病家族，隨著對每種短指(趾)癥的深入研究，大多數(shù)單純型短指(趾)癥和部分綜合征的致病基因及其分子機(jī)制逐漸被發(fā)現(xiàn)。雖然短指(趾)癥在表型上高度多樣化，但在分子水平上這些致病基因主要影響Hedgehog、NOTCH、WNT和BMP等信號傳導(dǎo)通路。這些信號傳導(dǎo)通路組成了一個復(fù)雜的信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在指(趾)骨及關(guān)節(jié)的不同發(fā)育階段發(fā)揮著不同的作用，其中BMP信號傳導(dǎo)通路扮演著至為關(guān)鍵的角色。本文在目前對短指(趾)癥的分類基礎(chǔ)上，詳細(xì)綜述了短指(趾)癥相關(guān)致病基因及所影響的信號通路等方面的最新進(jìn)展，旨在探討指(趾)骨形成的分子機(jī)制，以期為短指(趾)癥的臨床診斷以及人類骨骼發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制研究提供參考。

短指(趾)癥；信號傳導(dǎo)通路；Hedgehog；NOTCH；WNT；BMP

人的手指(腳趾)是人類進(jìn)化過程中最復(fù)雜的骨骼結(jié)構(gòu)之一。手指的靈活操作使人類具有處理更精細(xì)物品的能力，腳趾的靈活則給人類帶來了更多的運(yùn)動姿勢。擁有精細(xì)復(fù)雜結(jié)構(gòu)的指(趾)骨發(fā)育和功能，如同人體其他組織結(jié)構(gòu)一樣，受一系列復(fù)雜的分子機(jī)制調(diào)控，并對不同的病理變化高度敏感。指(趾)骨疾病在日常生活有多種呈現(xiàn)形式，如短(趾)指、并(趾)指、多(趾)指、軟骨發(fā)育異常等，其中短指(趾)癥及其綜合征家族對研究指(趾)骨的正常發(fā)育有著極其重要的意義。

短指(趾)癥(brachydactyly, BD)是一類指(趾)骨或掌(跖)骨的異?？s短、缺失或融合而造成的畸形病變。近年研究表明關(guān)于短指(趾)癥的致病基因已達(dá)10余種并涉及到Hedgehog信號通路(hedgehog sig-naling pathway)、NOTCH信號通路(NOTCH signaling pathway)、WNT信號通路(wingless-related MMTV integration site signaling pathway)、BMP通路(bone morphogenetic protein signaling pathway)。本文結(jié)合Bell分類[1]和人類孟德爾遺傳目錄[2]對短指(趾)癥的分類以及所涉及的分子信號通路進(jìn)行討論，以期為短指(趾)癥的臨床診斷以及人類指(趾)骨發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制研究提供參考。

1 短指(趾)癥的分類及分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)

隨著短指(趾)癥的不斷研究，短指(趾)癥的分類也越來越詳細(xì)[3]。指(趾)骨畸形作為短指(趾)癥的典型表征可在人群中表現(xiàn)為單純型，也可成為復(fù)雜綜合征表征的一部分[3,4]。

1.1 單純型短指(趾)癥

根據(jù)Bell分類并結(jié)合不同指(趾)骨的受累情況，單純型短指(趾)癥目前可分為A、B、C、D、E 5種分型[1,2]。BDA表現(xiàn)為中節(jié)指(趾)骨縮短，其中BDA1所有中節(jié)指(趾)骨均縮短或退化，偶爾與遠(yuǎn)節(jié)指(趾)骨融合，拇指和大腳趾的近節(jié)(趾)骨均有縮短；BDA2表現(xiàn)為第2指(趾)的中節(jié)指(趾)骨發(fā)育不全，表現(xiàn)出縮短或退化；BDA3的表現(xiàn)為第5指的中節(jié)指(趾)骨縮短，其余指(趾)骨均正常；BDA4表現(xiàn)為第2和第5指(趾)中節(jié)指(趾)骨短，且由于中節(jié)指(趾)骨形狀異常導(dǎo)致遠(yuǎn)節(jié)指(趾)骨橈側(cè)偏離，下肢受累的患者通常為第4趾中節(jié)趾骨缺失[1]。BDB具有兩種分型：BDB1和BDB2。BDB1主要表現(xiàn)為遠(yuǎn)節(jié)和(或)中節(jié)指(趾)骨縮短或發(fā)育不全，并伴有指甲缺失；BDB2表現(xiàn)遠(yuǎn)節(jié)指(趾)骨發(fā)育不全，伴有遠(yuǎn)端交感神經(jīng)管炎、腕/跗骨融合和局部皮膚性并指畸形[5,6]。BDC主要表現(xiàn)為第2、3、5指(趾)中節(jié)指(趾)骨縮短并伴有第2和/或3指(趾)指(趾)骨多節(jié)化，第1掌骨也出現(xiàn)縮短[7]。BDD型拇指(趾)遠(yuǎn)節(jié)指(趾)骨有不同程度的縮短，并且寬于正常表型[8]。BDE具體可分為BDE1和BDE2：BDE1限于第4掌(跖)骨的縮短；BDE2為多種掌(跖)骨縮短畸形，并且第1、3指(趾)遠(yuǎn)節(jié)指(趾)骨和第 2、5指(趾)中節(jié)指(趾)骨縮短[8,9]。

目前，已發(fā)現(xiàn)的單純型短指(趾)癥大多為常染色體顯性遺傳模式。除BDA3和BDD相對常見之外，其余單純型短指(趾)癥均極為罕見。短指(趾)癥的致病基因在肢端發(fā)育過程中具有極其重要的作用，目前的研究已對部分致病基因及其分子機(jī)制有一定了解(表1)。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)BDA1 (MIM:112 500)致病基因為(India Hedgehog)[10]、(Growth differ-entiation factor-5)[11]以及(Bone Morpho-genetic Protein Receptor 1B)[12]。BDA2 (MIM:112 600) 致病基因有[13][14]、(Bone Mor-phogenetic Protein 2)[15]等。BDB1 (MIM:113000)和BDB2 (MIM:611 377)的致病基因分別為(Re-ceptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2)和(Noggin)[5,6]。BDC (MIM:113 100)、BDD (MIM:113 200)的致病基因分別為[7]、(the ho-meobox D13)[8]。BDE1和BDE2(MIM:113 300)的致病基因分別為[8]和(parathyroid hormone like hormone)[9](表1)。

1.2 復(fù)雜短指(趾)癥綜合征

部分參與肢端形成的基因發(fā)生突變所引起的短指(趾)表型，可能也是某種綜合征的表型之一。具有肢端縮短癥狀的綜合征有很多，如Feingold綜合征(Feingold syndrome, MIM:164 280)、Du Pan綜合征(Du Pan syndrome，MIM:228900)、Robinow綜合征(Robinow syndrome, MIM:268 310)、Temtamy軸前短指(趾)綜合征(Temtamy preaxial brachydactyly synd-rome, TPBS, MIM:605282)等(表1)。

Robinow綜合征主要表現(xiàn)為短指與遠(yuǎn)節(jié)指(趾)骨短縮，指甲發(fā)育不良，第五指(趾)骨彎曲。Robinow綜合征有兩種遺傳模式，常染色體顯性遺傳和常染色體隱性遺傳，的無義突變和移碼突變可以導(dǎo)致該疾病[16,17]。TPBS是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類短指(趾)癥綜合征，臨床診斷多表現(xiàn)為先天性的骨骼發(fā)育異常，1、2、3指(趾)近節(jié)指(趾)骨部分增生，常伴有智力發(fā)育遲緩、身材矮小、小頭畸形、大眼、發(fā)育不良、牙齒異常、頜骨小和骨質(zhì)疏松癥。2010年，本課題組通過對近親婚配的約旦家系中的患者進(jìn)行DNA序列分析，發(fā)現(xiàn)硫酸軟骨素合成酶(chondroitin sulfate synthase1, CHSY1)基因的隱性突變是造成其先天性指(趾)骨發(fā)育異常的遺傳基礎(chǔ)，并將此疾病命名為Temtamy軸前短指(趾)綜合征[18]。隨著TPBS致病基因的發(fā)現(xiàn)，越來越多的TPBS綜合征在不同地區(qū)被發(fā)現(xiàn)，目前在埃及、土耳其、斯里蘭卡、巴基斯坦和約旦等地均有該病例的報道[19]。

2 短指(趾)癥相關(guān)信號通路

2.1 Hedgehog信號通路

Hedgehog信號通路由Hedgehog配體(HH)、膜蛋白受體復(fù)合物、核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子和下游靶基因等4個部分組成。在高等脊椎動物中，Hedgehog配體有3種同源蛋白IHH (indiana hedgehog)、SHH (sonic hedgehog)，DHH (desert hedgehog)。IHH主要表達(dá)在肥大軟骨細(xì)胞之類的軟骨細(xì)胞中，可以調(diào)控軟骨細(xì)胞的增殖和分化，是短指(趾)癥的主要致病基因之一。

表1 單純型短指(趾)癥和部分短指(趾)癥綜合征

在Hedgehog信號傳導(dǎo)通路中，當(dāng)IHH配體與受體PTC結(jié)合，解除PTC對SMO的抑制作用，SMO被激活，使轉(zhuǎn)錄因子GLI1磷酸化，從而啟動下游靶基因表達(dá)。IHH蛋白在關(guān)節(jié)周圍的軟骨膜中可誘導(dǎo)PTHLH(parathyroid hormone like hormone，甲狀旁腺激素樣激素)表達(dá)，PTHLH可抑制IHH的表達(dá)，與IHH形成負(fù)反饋環(huán)，從而調(diào)節(jié)Hedgehog信號通路。

IHH作為Hedgehog信號通路的配體，其突變可能會導(dǎo)致BDA1發(fā)生。St-Jacques等[20]通過同源重組技術(shù)敲除第一個外顯子，從而得到了Ihh無義突變小鼠，并觀察到小鼠肢端縮短并且出現(xiàn)各種成骨發(fā)育不良。上海交通大學(xué)賀林院士團(tuán)隊首先將BDA1的致病基因定位于染色體2q35~q36，并發(fā)現(xiàn)了3個錯義突變，分別為E95K、D100E和E131K[5]。隨后該團(tuán)隊Gao等[21]發(fā)現(xiàn)在突變體小鼠E95K/E95K中，Ihh與受體Ptch1和拮抗蛋白Hip1的結(jié)合減弱，下游轉(zhuǎn)錄因子Gli1激活減弱，從而下調(diào)Hedgehog信號通路。由于指(趾)骨遠(yuǎn)端祖細(xì)胞的募集減少，指(趾)骨的生長受損致使指(趾)骨的縮短。在信號通路水平上，IHH突變(E95K)導(dǎo)致IHH對PTC1和HIP1的結(jié)合降低，從而增加了IHH的信號范圍，但導(dǎo)致生長板軟骨細(xì)胞中短程IHH信號降低，但導(dǎo)致關(guān)節(jié)周圍軟骨膜中的遠(yuǎn)程IHH信號升高，導(dǎo)致PTHLH表達(dá)增加。增加的PTHLH又阻止了遠(yuǎn)端新形成的IHH表達(dá)，最終導(dǎo)致遠(yuǎn)端IHH急劇下降。這一系列的信號傳導(dǎo)及蛋白表達(dá)導(dǎo)致了中間指(趾)骨的縮短或缺失，即產(chǎn)生了BDA1的表型[21]。在對IHH的3個突變(E95K、D100E和E131K)的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)IHH的3個突變均可使Ptc1和Gli1的激活削弱。在最適誘導(dǎo)濃度下，突變型IHH對Gli蛋白的誘導(dǎo)能力大幅減弱[22]。2011年，Ma等[23]驗證了3個IHH錯義突變(E95K、D100E和E131K)對IHH蛋白結(jié)構(gòu)、功能和結(jié)合能力的影響，全面闡述了IHH的功能與BDA1突變之間的關(guān)系[22]。E95K改變了將其位點(diǎn)的表面電荷由負(fù)變?yōu)檎?，而不改變臨近結(jié)構(gòu)的表面電荷。E131K可能出現(xiàn)兩種構(gòu)象：一是與E95構(gòu)象一致；二是E95與K131之間形成鹽橋。這種表面電荷額度改變可能會影響IHH與PTC1的相互作用。D100E突變的表面電荷分布則沒有顯著改變，但在D100E結(jié)構(gòu)中，氨基酸殘基93~98之間的區(qū)域比正常結(jié)構(gòu)具有更高的靈活性。這3個突變并沒有對IHH整體結(jié)構(gòu)造成顯著破壞，但是對鈣離子的結(jié)合區(qū)域出現(xiàn)了細(xì)微的變化。E95K、D100E和E131K這3種突變均通過溶酶體途徑導(dǎo)致在胞內(nèi)出現(xiàn)不同程度的降解。IHH蛋白的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性可能與鈣結(jié)合槽內(nèi)的細(xì)微變化有關(guān)，當(dāng)鈣離子增多時，突變型IHH (E95K、E131K)的蛋白正常表達(dá)水平提高。這些突變可能會影響IHH的合成或分泌，是BDA1疾病機(jī)制重要的一部分。2019年，賀林院士團(tuán)隊Shen等[24]通過結(jié)合野生型IHH和E95K突變體進(jìn)行ChIP-chip和Microarray-based 基因表達(dá)分析，提出了BDA1的Gli1介導(dǎo)模型，并發(fā)現(xiàn)E95K突變體信號傳導(dǎo)改變了Gli1-DNA結(jié)合模式，削弱了下游基因表達(dá)，并導(dǎo)致細(xì)胞增殖和遷移減弱。Runx2是一種與短指(趾)癥相關(guān)的基因，并且Runx2在野生型IHH和突變型IHH之間存在差異表達(dá)。Runx2相關(guān)途徑是解釋E95K引發(fā)的BDA1和IHH下游信號調(diào)節(jié)變化的最相關(guān)基因之一[24]。

近年來，IHH突變引發(fā)BDA1的報道也逐漸增多。2015年，Dong等[25]在3例BDA1表型中國家系中分別發(fā)現(xiàn)3個IHH錯義突變(E95del、D100E和D100N)。2017年，Salian等[26]發(fā)現(xiàn)1例手足中指(趾)骨完全缺失的BDA1兒童，并發(fā)現(xiàn)其攜帶有IHH具有錯義突變(D100N)。

PTHLH是Heghehog信號通路的拮抗劑，突變會導(dǎo)致BDE2的發(fā)生。Klopocki等[9]在5個無關(guān)聯(lián)的家系中均發(fā)現(xiàn)PTHLH功能缺失會導(dǎo)致手部及足部的掌骨、跖骨、指(趾)骨縮短，第4和第5掌骨表現(xiàn)最為嚴(yán)重，即典型BDE2臨床表型。此外BDE2患者也可能表現(xiàn)為身材矮小、遲發(fā)性牙萌出或少牙。Thomas-Teinturier等[27]在3個無血緣關(guān)系的患者中發(fā)現(xiàn)2種的突變。第一種為c.47_ 101t73del128，該突變破壞了原先5號外顯子的剪接位點(diǎn)。第二種突變?yōu)閏.101_3delAAGT，該突變導(dǎo)致剪接位點(diǎn)出現(xiàn)異常。這兩種突變均使轉(zhuǎn)錄異常，并過早出現(xiàn)終止密碼子。3位患者均具有掌骨和跖骨縮短癥狀。

2.2 NOTCH信號通路

哺乳動物中有4種NOTCH受體，即NOTCH1~4。NOTCH配體在哺乳動物中分為2類，Delta-like (DLL)和Jagged。DLL有3種(DLL-1,3,4)，Jagged有兩種(Jagged-1,2)。當(dāng)細(xì)胞膜上的NOTCH配體與跨膜的NOTCH受體結(jié)合，腫瘤壞死因子α轉(zhuǎn)化酶(tumornecrosis factor convetingenzyme，TACE)在胞外第一次水解，NOTCH受體N端被配體表達(dá)細(xì)胞胞吞，C端則進(jìn)入細(xì)胞在γ-secretase作用下二次水解，釋放NOTCH受體活化形式(NICD)，NOTCH信號通路被激活。激活后，NICD轉(zhuǎn)運(yùn)入核并在CSL蛋白作用下與DNA結(jié)合，通過調(diào)控HES1/5等轉(zhuǎn)錄因子，從而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞的發(fā)育及分化。

關(guān)于NOTCH通路異常引起短指(趾)癥的研究不多。目前研究發(fā)現(xiàn)，TPBS的致病基因可以通過調(diào)控NOTCH信號通路影響軟骨的發(fā)育[18]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在突變的人類成纖維表皮原代細(xì)胞中，JAG1蛋白的表達(dá)顯著增高，而在胚胎發(fā)育過程中的JAG1蛋白的異?？赡軙饘OTCH信號通路的異常調(diào)控，故表明CHSY1缺失會導(dǎo)致NOTCH信號通路上調(diào)[18]。本課題組通過在斑馬魚胚胎中將敲低發(fā)現(xiàn)Notch信號通路上調(diào)，而且敲低斑馬魚表現(xiàn)出與人類TPBS相似的表型，骨骼和胸鰭的發(fā)育異常，同時也會引起視網(wǎng)膜的過度生長。Wilson 等[28]利用同源重組技術(shù)敲除第1個外顯子，從而得到–/–小鼠。Chsy1小鼠表現(xiàn)出軟骨發(fā)育不良、骨密度降低、遠(yuǎn)節(jié)指間關(guān)節(jié)移位致使遠(yuǎn)節(jié)指(趾)骨縮短并出現(xiàn)分節(jié)。Filipek-Górniok等[29]通過對不同時期的斑馬魚進(jìn)行阿利新蘭染色，發(fā)現(xiàn)在早期發(fā)育階段硫酸軟骨素(chondroitin sulfate, CS)沉積于脊索鞘，通過原位雜交發(fā)現(xiàn)及其他硫酸軟骨素糖基轉(zhuǎn)移酶基因在軟骨形成部位均有表達(dá)，如咽軟骨、耳囊和胸鰭。目前有研究表明可能與也有密切關(guān)系。通過熒光素酶報告系統(tǒng)和實時定量PCR發(fā)現(xiàn)，的過表達(dá)會引起上調(diào)[30]。

本課題組在對1例罕見并指(趾)癥家系CLS并指(趾)癥(Cenani-Lenz syndactyly syndrome, MIM: 212780)的研究中也發(fā)現(xiàn)，其致病基因可通過NOTCH信號通路調(diào)控肢端及骨的發(fā)育[31]，進(jìn)一步證明了NOTCH信號通路在指(趾)骨發(fā)育中的重要作用。

2.3 WNT信號通路

WNT信號通路在物種進(jìn)化上高度保守，對早期胚胎發(fā)育具有極大影響，也參與誘導(dǎo)骨的增殖、分化，是調(diào)控骨代謝的重要途徑之一。WNT信號通路可以分為經(jīng)典WNT/β-catenin信號通路、非經(jīng)典WNT/PCP信號通路以及WNT/Ca2+信號通路。

經(jīng)典WNT/β-catenin信號通路的傳導(dǎo)由WNT配體與低密度脂蛋白受體5/6 (LRP5/6)、Frizzled受體結(jié)合，Dishevelled蛋白(DvL)接收信號，通過抑制APC-AXIN-GSK3β復(fù)合體，使β-catenin磷酸化水平減少，非磷酸化的β-catenin水平增加，在細(xì)胞核內(nèi)與TCF/LEF結(jié)合，調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄過程。經(jīng)典WNT/β-catenin信號通路通過調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化而使這個過程處于動態(tài)平衡。但通路的過度激活或抑制均會打破這種平衡，導(dǎo)致部分骨類疾病，如硬骨病和骨質(zhì)疏松等[32]。

由WNT信號通路傳導(dǎo)異常而引起的短指(趾)癥目前主要為BDB1和Robinow綜合征，是由基因的缺失導(dǎo)致[15,16]。Huang等[33]發(fā)現(xiàn)了一個具有BDB1表型的三代中國家系，并發(fā)現(xiàn)1個新的雜合子堿基缺失(c.1396–1398delaa)。這種突變導(dǎo)致出現(xiàn)一種截短的ROR2蛋白和一種具有57個氨基酸的多肽片段。Dong等[25]在1例BDB1表型中國家系發(fā)現(xiàn)了基因的一種新的雜合突變(S758x)。此外，基因突變導(dǎo)致BDB1也在土耳其、德國、巴基斯坦、中國、葡萄牙、威爾士、約旦和沙特阿拉伯等地均有報道[33]。

基因編碼酪氨酸激酶受體，在WNT信號通路中主要與WNT/Ca2+信號通路中的WNT5A結(jié)合調(diào)控經(jīng)典WNT/β-catenin信號通路和WNT/Ca2+信號通路平衡與正常傳導(dǎo)。ROR2的半胱氨酸富集區(qū)與WNT5A結(jié)合，對WNT/β-catenin信號通路起負(fù)調(diào)節(jié)作用。Oishi等[34]發(fā)現(xiàn)–/–小鼠身材矮小，四肢和尾部均縮短，肺部和生殖器官發(fā)育不良，并且出現(xiàn)室間隔缺損。Oldridge等[35]在小鼠基因中插入，導(dǎo)致小鼠基因功能異常，軟骨無法正常生成以及中間指(趾)骨缺失。德國學(xué)者Witte等[36]在W79X/W79X小鼠突變體的BDB1模型中發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化受阻，導(dǎo)致指(趾)骨無法正常延長。在指(趾)骨形成區(qū)處，BMP/pSMAD1/5/8信號減少，并且在突變體小鼠E13.5胚胎中發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)節(jié)指(趾)骨間充質(zhì)細(xì)胞中Ihh表達(dá)減少，表明基因與BMP信號通路和IHH信號通路也存在密切關(guān)系。

2.4 BMP信號通路

BMP信號通路在骨的發(fā)育中占據(jù)重要的中心位置，位于指(趾)骨發(fā)育調(diào)控信號分子網(wǎng)絡(luò)的中樞。BMP是TGF-β (轉(zhuǎn)化生長因子)超家族中最大的蛋白家族，正向調(diào)節(jié)骨的增殖、分化以及形成。BMPs蛋白是BMP信號通路中的配體，包括BMP1~15。BMP受體有兩種類型，Ⅰ型BMP受體(BMPR1)和Ⅱ型BMP受體(BMPR2)。Noggin(NOG)和Chordin (CHRD)是BMP信號通路上主要的抑制劑。在BMP信號通路傳到中，BMPs與位于細(xì)胞膜上的BMPR1和BMPR2結(jié)合，使BMPR1和BMPR2激活。活化的BMPR1與下游SMAD1/5/8 蛋白作用并使其磷酸化。SMAD1/5/8 蛋白磷酸化后與SMAD4結(jié)合入核并在核中積累，在ID等轉(zhuǎn)錄因子作用下調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)。

BMP信號通路上的多數(shù)元件均與短指(趾)癥密切相關(guān)。下游調(diào)控區(qū)突變的重復(fù)序列會引發(fā)BDA2。Dathe等[10]在德裔巴西家系和歐洲家系中檢查了21名患者，發(fā)現(xiàn)基因下游110 kb處有高度保守的重復(fù)序列。Su 等[37]在一個中國BDA2家系中確定了基因下游110 kb處存在4.6 kb的雜合重復(fù)序列。Liu等[38]通過全基因組連鎖分析在一個中國BDA2家族定位到了致病基因，在基因下游調(diào)控區(qū)發(fā)現(xiàn)一個4671 bp的重復(fù)序列。2018年，Wang等[39]在一個BDA2表型的中國家系中同樣發(fā)現(xiàn)了基因下游具有4671 bp重復(fù)序列，但在該家系未患病的人和正常人群中并未發(fā)現(xiàn)，并且該家系所有成員的基因、和的所有外顯子并無突變。這些均說明位于下游的保守重復(fù)序列對于基因功能存在遠(yuǎn)程調(diào)控作用。

GDF5蛋白是BMP信號通路中的配體，也稱為BMP14。GDF5蛋白廣泛表達(dá)于指(趾)間關(guān)節(jié)細(xì)胞以及關(guān)節(jié)周圍的祖細(xì)胞中，參與關(guān)節(jié)形成。突變會引發(fā)BDA1、BDA2、BDB2和BDC。Byrnes等[11]在一個法國加拿大家庭中發(fā)現(xiàn)了3個BDA1患者，其致病基因為的純合錯義突變R399C。Degenkolbe等[40]在一個墨西哥家庭的3代人中發(fā)現(xiàn)Ⅱ型多發(fā)性骨性連接綜合征(multiple synostoses syndrome 2, SYNS2, MIM:610017)和BDA1的患者，均為錯義突變W414R，該突變位于GDF5與NOG、BMPR1的結(jié)合部位，致使信號缺失，而信號減少。

突變也可能導(dǎo)致BDA2。Seemann等[14]在一個具有BDA2遺傳的家族中鑒定基因的錯義突變L441P，他們認(rèn)為BDA2的表型是由配體GDF5和受體BMPR1的結(jié)合作用受抑制引起的。Pl?ger等[41]在一個BDA2家族六代14名患者中發(fā)現(xiàn)的錯義突變R380Q。他們認(rèn)為R380Q突變導(dǎo)致蛋白剪切異常，致使GDF5功能降低。Kjaer等[42]通過對一個曾發(fā)現(xiàn)患BDA2的丹麥/挪威大型家族更新族譜并在37位患者中進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)錯義突變I441P，并且預(yù)測該突變存在于與BMPR1的結(jié)合位點(diǎn)。2018年，Khan等[43]也在巴基斯坦BDA2家系中發(fā)現(xiàn)基因突變[43]。

突變也往往導(dǎo)致BDC型短指(趾)癥由于突變所引發(fā)的BDC，往往會表現(xiàn)出分化多個關(guān)節(jié)的癥狀。Everman等[44]在一個BDC家族中發(fā)現(xiàn)12號染色體基因上插入了23 bp。Schwabe等[7]在一個大型近親結(jié)婚的土耳其家庭中發(fā)現(xiàn)該家族內(nèi)所有的BDC患者均為M173V雜合突變。

BMPR1和BMPR2作為BMP信號通路的受體，在軟骨細(xì)胞的聚集處有較高的表達(dá)。的突變也可能導(dǎo)致BDA1和BDA2表型。Racacho等[12]在2名類似BDA1的無親緣關(guān)系的兒童中未發(fā)生突變，但發(fā)現(xiàn)基因突變，一例為雜合錯義突變K325N，另一例為雜合剪切突變。突變也會導(dǎo)致BDA2發(fā)生。Lehmann等[13]在兩個無親緣關(guān)系的患有BDA2的德國家庭中發(fā)現(xiàn)了基因的雜合突變I200K和R486W。他們通過用微團(tuán)培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行功能分析表明，兩種突變受體都能強(qiáng)烈抑制軟骨形成。通過逆轉(zhuǎn)錄病毒感染雞胚得到過表達(dá)的雞胚，其表現(xiàn)出與人類指(趾)骨縮短極其相似的短指(趾)表型或會導(dǎo)致整個肢體的嚴(yán)重發(fā)育不足。

NOG蛋白是BMP信號通路的拮抗劑，基因的突變會引起B(yǎng)DB2。Lehmann等[6]在德國、土耳其、丹麥、伊朗、英國及北美6個BDB2家系中發(fā)現(xiàn)致病基因為，并鑒定出6種不同的雜合錯義突變P35A、P35S、A36P、E48K、R167G和P187S。2015年，Ishino等[45]在一個五代日本家系中發(fā)現(xiàn)所有BDB2患者均為的錯義突變C228G，該突變破壞了NOG蛋白的FingerⅡ中半胱氨酸之間連結(jié)，致使FingerⅡ結(jié)構(gòu)發(fā)生嚴(yán)重破壞。此外，在巴基斯坦的BDB2家系中也發(fā)現(xiàn)其致病基因為[43]。在BDB2中，的突變使NOG與BMP和GDF5的結(jié)合能力發(fā)生異常，從而破壞了BMP信號通路的穩(wěn)定，使得指(趾)骨的軟骨發(fā)育異常，表現(xiàn)出短指(趾)的表型。Brunet等[46]通過同源重組技術(shù)得到突變體小鼠表現(xiàn)為在椎骨、肋骨和四肢上均有明顯的缺陷，四肢短粗，關(guān)節(jié)出現(xiàn)融合，表型與人類BDB2相似。

有報道認(rèn)為TPBS短指(趾)綜合征的致病基因也參與BMP信號通路的調(diào)控，但參與BMP信號通路的具體細(xì)節(jié)仍尚未可知[47]。

3 短指(趾)癥及指(趾)骨發(fā)育中的信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

Hedgehog、NOTCH、WNT、BMP信號通路均與骨骼發(fā)育密切相關(guān)，并且構(gòu)成了一個復(fù)雜又龐大的信號通路網(wǎng)絡(luò)。BMP信號通路在指(趾)骨發(fā)育中處于中樞位置，Hedgehog、NOTCH和WNT信號通路均與BMP信號通路相互作用(圖1)。

Hedgehog信號通路作為指(趾)骨延長以及調(diào)控軟骨細(xì)胞分化和增殖的不可或缺的一部分，與BMP信號通路的緊密交流也成為了骨骼正常發(fā)育的基礎(chǔ)。IHH在BMP信號通路中具有多種調(diào)節(jié)功能。當(dāng)軟骨膜中進(jìn)行骨生成過程中，IHH信號通路可以通過GLI激活BMPs定向的骨-軟骨生成作用[48]。IHH的缺失則會減少BMP的表達(dá)量。另一方面，BMP信號通路也參與到IHH信號通路的調(diào)節(jié)中。在成骨細(xì)胞分化過程中，BMP2也可誘導(dǎo)IHH的表達(dá)，并下調(diào)PTC1的表達(dá)[49]。BMP/Smad信號可以直接激活I(lǐng)HH啟動子。在生長板的發(fā)育過程中，IHH信號通路與PTHLH的調(diào)節(jié)保持軟骨細(xì)胞正常增殖，有利于長骨的延伸。Zhang等[50]發(fā)現(xiàn)，在Smad4的t突變體小鼠中，Ihh、Ptc1和Pth1r的表達(dá)量均降低。Zhang等[51]在組成性激活突變型、組成性激活突變型、以及組成性激活突變型的過表達(dá)的雞胚的肢芽中發(fā)現(xiàn)和的表達(dá)量上升。Minina等[52]在培養(yǎng)小鼠肢體的外植體中發(fā)現(xiàn)，Bmp2可以誘導(dǎo)的表達(dá)，而Noggin則會抑制的表達(dá)。

圖1 短指(趾)癥致病基因參與信號通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

短指(趾)癥致病基因參與的信號通路主要為Hedgehog、WNT、NOTCH、BMP4條信號通路。信號通路相互調(diào)控的解釋見正文。大部分短指(趾)癥致病基因存在于BMP信號通路中，而不直接參與BMP信號通路的短指(趾)癥致病基因可通過分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控將4條信號通路聯(lián)系起來，最終共同影響指(趾)骨發(fā)育進(jìn)程。文中對信號通路具有抑制作用的部分用紅色線條表示；對信號通路具有促進(jìn)作用的用綠色箭頭表示。

WNT信號通路除參與骨骼發(fā)育外，也參與到骨細(xì)胞的分化、增殖、凋亡以及維持骨量穩(wěn)定等多個生理過程。WNT信號通路與BMP信號通路在指(趾)骨發(fā)育也有著緊密的聯(lián)系。BMPs蛋白對WNT信號通路的調(diào)節(jié)具有雙重作用。BMP蛋白可以通過MAPK和SMAD信號通路傳導(dǎo)，從而抑制WNT信號通路傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)骨的正常生理發(fā)育，并在成骨細(xì)胞中對骨量進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)[53,54]。在WNT信號通路中Dvl起到接收受體傳導(dǎo)的信號，并將其信號傳導(dǎo)至下游引起β-catenin磷酸化水平降低。而BMP2則可誘導(dǎo)Smad1-Dvl1復(fù)合物形成，限制了WNT信號通路的傳導(dǎo)[55]。當(dāng)ROR2與WNT5A結(jié)合后調(diào)節(jié)WNT/β-catenin信號通路，同時在軟骨形成中拮抗BMP信號傳導(dǎo)。此外，ROR2通過抑制Smad1/5/9信號傳導(dǎo)和激活Smad非依賴性途徑來調(diào)節(jié)GDF5信號傳導(dǎo)。因此當(dāng)ROR2功能異常時，往往致使指(趾)骨發(fā)育異常，從而導(dǎo)致短指(趾)癥BDB2或Rinbown綜合征的發(fā)生。BMPs同時也可以與WNT信號協(xié)同作用，共同促進(jìn)成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的分化，保證骨骼，尤其是指(趾)骨的正常發(fā)育。BMP2可以通過誘導(dǎo)WNT蛋白的表達(dá)促進(jìn)經(jīng)典WNT信號通路[56]。Smad和Tcf/Lef/β-catenin復(fù)合體在核內(nèi)啟動子上相互作用，使基因、和表達(dá)增高，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[57]。

NOTCH信號通路與BMP信號通路也存在著密切的聯(lián)系，但NOTCH信號通路與BMP的在骨骼發(fā)育，尤其是指(趾)骨發(fā)育中的關(guān)聯(lián)研究不多。2010年，本課題組在TPBS中發(fā)現(xiàn)，CHSY1可以通過抑制NOTCH信號通路影響指(趾)骨的發(fā)育[18]。Li等[47]在TPBS中則發(fā)現(xiàn)CHSY1可以通過抑制BMP信號通路影響指(趾)骨發(fā)育。因此，CHSY1很可能在BMP信號通路和NOTCH信號通路之間，起到重要的溝通作用。

4 結(jié)語與展望

在對短指(趾)癥百年的研究過程中，短指(趾)癥的分類、發(fā)病機(jī)制大多已被清楚認(rèn)識，并建立起了短指(趾)癥相關(guān)的研究體系。在短指(趾)癥的治療方面，尚無針對所有短指(趾)癥類型的標(biāo)準(zhǔn)術(shù)式[58]。在能改善患者手腳功能及外形的前提下僅可以通過整形外科手術(shù)進(jìn)行治療，但在通常情況下，該類手術(shù)并非絕對必要[58]。目前對于單純型短指(趾)癥的分類，主要為Bell分類。由于Bell分類主要是以解剖學(xué)為基礎(chǔ)，但部分短指(趾)癥的分類與分子遺傳學(xué)可能不完全相符，因此，在Bell分類的基礎(chǔ)上結(jié)合指(趾)骨發(fā)育的分子遺傳背景可能進(jìn)一步優(yōu)化短指癥的診斷和分類。短指(趾)癥是由于指(趾)骨的發(fā)育異常引起的縮短畸形，因此短指(趾)癥在研究指(趾)骨發(fā)育方面是一個極好的模型。短指(趾)癥作為由基因突變引起的先天性遺傳病，各類短指(趾)癥的致病基因以BMP信號通路為核心，并通過Hedgehog、NOTCH、WNT等信號通路對指(趾)骨發(fā)育起到?jīng)Q定性影響。隨著短指(趾)癥在分子水平上的研究，指(趾)骨發(fā)育的過程有望得到近一步細(xì)致的探索，并且可以通過更多分子水平上的手段得到更多對于短指(趾)癥治療的新思路和新方法。

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Brachydactyly and the molecular mechanisms of digit formation

Zhaojie Lyu, Zhihao Wang, Shuxian Lu, Peirong Liu, Jing Tian

Brachydactyly (BD) is a type of hand/foot malformation caused by the abnormal shortening or missing phalanges and/or metacarpals/metatarsals. BD most often occurs as an isolated trait, but can also occur as part of complex malformation syndromes. According to the patterns of affected digits, isolated BD can be divided into five groups: BDA, BDB, BDC, BDD, and BDE with individual subtypes. As an important molecular disease family, the pathogenic genes and molecular mechanisms of most isolated BD forms and some complicated syndromes are elucidated. Although BDs are highly diversified in phenotypes, at the molecular levels these pathogenic genes mainly affect several important signaling pathways: Hedgehog, NOTCH, WNT and BMP. These pathways form a complex signaling network and play different roles in different stages of the digit and joint development, in which BMP signaling pathway occupies a central position. Based on the current classification of BDs, this review summarizes the latest progress in the pathogenesis of BDs and the signaling pathways involved. The purpose of this review is to explore the molecular mechanisms of digit formation, which will provide references for the clinical diagnosis of BD, and the understanding of molecular mechanism of human bone development.

brachydactyly; signaling pathways; Hedgehog; NOTCH; WNT; BMP

2019-06-27;

2019-08-09

西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實驗室開放研究基金項目(編號：ZSK2018010)資助[Supported by the Opening Foundation of Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China (Northwest University), Ministry of Education (No. ZSK2018010)]

呂趙劼，碩士研究生，專業(yè)方向：人類遺傳與發(fā)育生物學(xué)。E-mail: ZhaojieLyu@outlook.com

田靜，博士，教授，研究方向：人類遺傳與發(fā)育生物學(xué)。E-mail: tianjing@nwu.edu.cn

10.16288/j.yczz.19-100

2019/10/14 18:44:00

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20191014.1535.001.html

(責(zé)任編委: 謝小冬)