黃子瑩，李龍，李倩倩，劉向東,2，李長春,2

lncRNA TCONS_00815878對豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化的影響

黃子瑩1，李龍1，李倩倩1，劉向東1,2，李長春1,2

1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070 2. 廣西揚(yáng)翔股份有限公司生產(chǎn)中心，貴港 537131

豬骨骼肌發(fā)育是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，其中骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化是影響骨骼肌發(fā)育的重要環(huán)節(jié)。近年來發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA, lncRNA)在骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化中具有重要作用。為探究lncRNA TCONS_00815878對豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化的影響，本研究利用qRT-PCR技術(shù)檢測出生7 d內(nèi)大白仔豬6種組織(心臟、脾臟、肺臟、腎臟、背肌和腿肌)及從胚胎期到出生后5個不同時間點(diǎn)(35 d、45 d、55 d胚胎及產(chǎn)后第7 d和第200 d后腿肌肉組織) TCONS_00815878的表達(dá)情況；利用反義核苷酸(antisense oligonuc-leotides, ASO)在豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中敲低TCONS_00815878，檢驗(yàn)分化標(biāo)記基因和表達(dá)情況；通過生物信息學(xué)分析預(yù)測TCONS_00815878靶基因，并利用DAVID軟件在線預(yù)測其靶基因的功能與通路。結(jié)果表明：TCONS_00815878在豬心肌和腿肌中高表達(dá)；仔豬出生后7 d內(nèi)，TCONS_00815878在豬肌肉組織中表達(dá)量不斷升高，第7 d達(dá)到高峰；在豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化過程中，TCONS_00815878在分化期表達(dá)量不斷上升，且在分化30 h表達(dá)量達(dá)到峰值；敲低TCONS_00815878后，和基因表達(dá)量降低，其中表達(dá)量顯著下降(0.05)。此外，功能預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其靶基因富集到糖酵解和丙酮酸代謝等與骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化相關(guān)的多個生物學(xué)過程。本研究推測，lncRNA TCONS_00815878可能對豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分化起促進(jìn)作用。

lncRNA TCONS_00815878；豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞；分化；敲低；靶基因

豬()骨骼肌生長發(fā)育與其產(chǎn)肉量高低直接相關(guān)。此外，因與人具有相似的解剖學(xué)和生理學(xué)特征，研究豬骨骼肌的發(fā)育規(guī)律對人類相關(guān)研究也大有裨益[1]。骨骼肌發(fā)育是一個復(fù)雜且有序的過程，是各種遺傳因素及調(diào)控因子共同作用的結(jié)果。骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞是位于肌肉組織基膜和肌細(xì)胞膜之間的骨骼肌干細(xì)胞，在骨骼肌發(fā)育與再生過程中發(fā)揮著重要作用[2,3]。骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞被激活后首先形成單核成肌細(xì)胞，增殖分化，隨后融合成多核肌細(xì)胞，進(jìn)一步相互連接形成肌纖維，最終并排形成肌肉組織[4,5]。

長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA, lncRNA)是一類長度大于200 nt的非編碼RNA。研究證實(shí)，lncRNA在骨骼肌發(fā)育、肌細(xì)胞增殖與分化過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用[6~8]。有關(guān)lncRNA參與骨骼肌發(fā)育的研究已有很多，但多集中對小鼠()的研究[9,10]。近年來，隨著生物信息學(xué)及生物檢測技術(shù)的發(fā)展，已在豬上獲得大量與肌肉發(fā)育潛在相關(guān)的lncRNA，但多數(shù)lncRNA作用還尚不明確[11]。TCONS_ 00815878是Tang等[12]對貴州小型豬9個組織和3個骨骼肌樣本進(jìn)行高通量測序鑒定得到的肌肉組織特異性lncRNA，位于15號染色體，全長1089 nt，包含2個外顯子。為進(jìn)一步探究TCONS_00815878在豬骨骼肌發(fā)育過程中的作用，本研究檢測了出生7 d內(nèi)大白仔豬6種組織及從胚胎期到出生后5個不同時間點(diǎn)TCONS_00815878的表達(dá)情況，進(jìn)一步在豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中對TCONS_00815878進(jìn)行敲低處理，檢測其對豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化產(chǎn)生的影響。最后通過生物信息學(xué)分析，預(yù)測TCONS_ 00815878的靶基因及其靶基因可能參與的生物學(xué)過程和通路。通過以上研究，推測TCONS_00815878可能對豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化過程產(chǎn)生的影響，旨在為豬骨骼肌生長發(fā)育相關(guān)lncRNA的功能研究提供更有價值的參考。

1 材料與方法

1.1 豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分離和培養(yǎng)

出生7 d內(nèi)大白仔豬(購自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)種豬場)，取兩后腿全部肌肉，置于裝有20~30 mL PBS (美國GIBCO公司)的培養(yǎng)皿中，在PBS中漂洗3次去除肌肉表面筋膜，剪碎組織肉樣至肉糜狀；將肉糜移至T75培養(yǎng)瓶，吸凈上清，向肌肉組織中加入2倍體積0.2% Ⅰ型膠原酶(美國GIBCO公司)工作液；37℃、1200r/min水浴震蕩消化2.5 h后加等體積終止培養(yǎng)基終止消化；過100目篩、200目篩及400目篩，2000 r/min離心10 min，除上清，加培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，溶液移至10 cm培養(yǎng)皿；37℃、5% CO2貼壁培養(yǎng)2.5 h，將培養(yǎng)皿溶液上清移至新培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)；衛(wèi)星細(xì)胞在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)培養(yǎng)24 h，用PBS清洗2遍并更換培養(yǎng)基。

1.2 樣品采集

取3頭出生7 d內(nèi)大白仔豬(購自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)種豬場)，采集心臟、脾臟、肺臟、腎臟、背肌和后腿肌肉6種組織，用于檢測TCONS_00815878在不同組織中的表達(dá)量。

采集大白豬35 d、45 d、55 d胚胎及產(chǎn)后第7 d和第200 d的后腿肌肉組織，用于檢測TCONS_ 00815878從豬胚胎期到出生后不同時間點(diǎn)的表達(dá)量。上述所有組織樣品采集后，經(jīng)液氮速凍，保存于?80℃?zhèn)溆谩?/p>

收集增殖期12 h、24 h和分化期12 h、24 h的豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，檢測增殖期和分化期和的表達(dá)量，以確定豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖分化效果。

收集增殖期6 h、12 h、18 h、30 h、36 h和42 h及分化期0 h、6 h、12 h、24 h、30 h、36 h和42 h的豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，檢測TCONS_00815878在豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖與分化不同時期的表達(dá)量。

收集誘導(dǎo)分化24 h的豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，分離其細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核RNA，用于檢測TCONS_00815878在豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的表達(dá)量。

1.3 總RNA提取

組織總RNA提?。喝〃C80℃冰箱保存的組織樣品，從凍存管中取出適量迅速放入液氮預(yù)冷的研缽中，加入適當(dāng)液氮后研磨，待研磨成粉后轉(zhuǎn)移到1.5 mL無RNA酶的離心管中，按照RNA提取試劑盒(德國Epigentek公司)說明書提取上述組織樣本中的總RNA，取1 μL樣品于NanoDrop 2000 (美國Thermo Scientific公司)分光光度計(jì)檢測濃度，260/280值在1.8~2.0之間則表示RNA純度較高。

細(xì)胞總RNA提?。簩⒘装鍍?nèi)的豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞棄掉培養(yǎng)基后，用PBS沖洗兩次，每孔直接加入1 mL Trizol，用移液槍吹打數(shù)次，室溫裂解5 min，然后吸入1.5 mL無RNA酶離心管，于?80℃冰箱儲存，后續(xù)RNA提取步驟與組織樣品RNA提取方法一致。

細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)RNA分離與提取：豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞用預(yù)冷的PBS沖洗兩次，2187 r/min棄上清液。將沉淀重懸于0.2 mL裂解緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0、140 mmol/L NaCl、1.5 mmol/L MgCl2、0.5% IGEPAL、1 mmol/L DTT、1 U/μL RNase抑制劑)。將混合物冰上放置5 min，之后4℃、2187 r/min細(xì)胞懸液離心3 min。收集上清液到1.5 mL離心管(細(xì)胞質(zhì)部分)，14 000 r/min離心4 min。剩余沉淀用0.2 mL裂解液沖洗2次(細(xì)胞核部分)。最后用1 mL Trizol提取所有細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中RNA。

1.4 引物及反義核苷酸(antisense oligonucleo-tides, ASO)片段的設(shè)計(jì)、合成

lncRNA TCONS_00815878序列參考文獻(xiàn)[9]；和18S rRNA的mRNA序列由NCBI數(shù)據(jù)庫獲得。本研究采用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物信息詳見表1。

通過網(wǎng)站(http://sfold.wadsworth.org/cgi-bin/index.)在線設(shè)計(jì)敲低TCONS_00815878的ASO片段，由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行全鏈硫代修飾。ASO序列為GGATCTGGATTATGAACTTG。

1.5 cDNA合成和qRT-PCR擴(kuò)增

參照SMARTerTMPCR cDNA Synthesis Kit試劑盒(日本TaKaRa公司)操作說明書反轉(zhuǎn)錄合成所有組織和豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中的cDNA，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于?20℃保存?zhèn)溆?，?8S rRNA為內(nèi)參，qRT-PCR檢測TCONS_00815878表達(dá)量。反應(yīng)總體系為10 μL：SYBR Green 5 μL，ddH2O 3.6 μL，引物各0.2 μL，cDNA 1 μL。反應(yīng)條件：95℃ 2 min；95℃ 15 s， 56℃/60℃ 20 s，72℃ 15 s，40個循環(huán)；95℃ 5 s，58℃ 5 s，95℃ 50 s，1個循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行溶解曲線分析。

1.6 TCONS_00815878靶基因及功能預(yù)測

根據(jù)參考文獻(xiàn)[9]測序結(jié)果中的蛋白編碼基因表達(dá)量數(shù)據(jù)，計(jì)算TCONS_00815878與蛋白編碼基因之間的Pearson相關(guān)系數(shù)，預(yù)測TCONS_00815878靶基因。選擇0.05、Pearon相關(guān)系數(shù)0.95的基因作為靶基因[13](附表1)。利用DAVID功能注釋生物信息學(xué)芯片分析預(yù)測靶基因功能與通路，取結(jié)果0.05為有效功能預(yù)測結(jié)果。

表1 本文所用引物信息

1.7 lncRNA TCONS_00815878敲低實(shí)驗(yàn)及靶基因驗(yàn)證

1.7.1 豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞轉(zhuǎn)染及TCONS_ 00815878敲低實(shí)驗(yàn)

在10 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，接種至六孔板，ASO敲低組(ASO)和對照組(NC)均設(shè)3個重復(fù)，待細(xì)胞密度達(dá)到80%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，每孔ASO轉(zhuǎn)染量為200 pmol。待細(xì)胞密度達(dá)到90%~ 100%更換分化培養(yǎng)基，分別于誘導(dǎo)分化后18 h、30 h收取細(xì)胞，進(jìn)行RNA提取。qRT-PCR檢測TCONS_00815878及和在不同分化時期表達(dá)量。

1.7.2 免疫熒光分析

將細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌2次，用預(yù)冷的4%多聚甲醛(廣州賽國生物科技有限公司)室溫靜置固定15 min。PBS洗滌后，用預(yù)冷的0.25% TritonX-100 (廣州賽國生物科技有限公司)室溫靜置處理10 min。PBS洗滌，封閉液4℃封閉1~2 h (封閉液：3%BSA, 0.3%T TritonX-100, 10%FBS，PBS)。PBS洗滌細(xì)胞，4℃孵育一抗過夜(抗體稀釋液：3%BSA，0.3% TritonX-100, PBS)。之后37℃孵育二抗1 h。最后使用DAPI對細(xì)胞進(jìn)行染色，熒光顯微鏡下觀察熒光。

1.7.3 靶基因功能驗(yàn)證

使用敲低TCONS_00815878后的細(xì)胞樣品。以18S rRNA為內(nèi)參，qRT-PCR檢測靶基因和的表達(dá)量。反應(yīng)總體系為10 μL：SYBR Green 5 μL，ddH2O 3.6 μL，引物各0.2 μL，cDNA 1 μL。反應(yīng)條件：95℃ 2 min；95℃ 15 s，60℃ 20 s，72℃ 15 s，40個循環(huán)；95℃ 5 s，58℃ 5 s，95℃ 50 s，1個循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行溶解曲線分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

qRT-PCR擴(kuò)增結(jié)果參照2–ΔΔCt方法[14]評估TCONS_00815878及和相對表達(dá)量，以18S rRNA作為內(nèi)參基因，0.05表示為差異顯著，0.01表示為差異極顯著。每項(xiàng)檢測設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)設(shè)置3個技術(shù)重復(fù)，由GraphPad Prism 6.0軟件完成統(tǒng)計(jì)并作圖。生物信息學(xué)分析結(jié)果由Excel軟件統(tǒng)計(jì)，利用R軟件分析作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 TCONS_00815878表達(dá)特征及核質(zhì)定位

利用qRT-PCR檢測出生7 d內(nèi)大白仔豬心臟、脾臟、肺臟、腎臟、背肌和后腿肌肉6種組織中TCONS_00815878的表達(dá)量(圖1A)。結(jié)果表明，TCONS_00815878在心臟、背肌和后腿肌肉中表達(dá)量較高，在其他組織中不表達(dá)。取35 d、45 d、55 d胚胎及產(chǎn)后第7 d和第200 d大白仔豬后腿肌肉組織，檢測TCONS_00815878表達(dá)量(圖1B)。結(jié)果表明，TCONS_00815878表達(dá)量在胚胎期35 d和45 d呈緩慢下降趨勢，從45 d開始呈上升趨勢，直至仔豬出生后第7 d達(dá)到峰值。

圖1 TCONS_00815878表達(dá)特征及核質(zhì)定位結(jié)果

A：lncRNA TCONS_00815878在豬不同組織中的表達(dá)量；B：TCONS_00815878從豬胚胎期到出生后不同時間點(diǎn)表達(dá)量；C：TCONS_00815878核質(zhì)定位結(jié)果。

提取分化24 h豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核RNA，qRT-PCR檢測TCONS_00815878表達(dá)量(圖1C)。結(jié)果表明，TCONS_00815878在細(xì)胞核中高表達(dá)，推測其可能在豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的細(xì)胞核中發(fā)揮作用。

2.2 TCONS_00815878對豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化的影響

收集增殖期12 h、24 h和分化期12 h、24 h豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，qRT-PCR檢驗(yàn)骨骼肌細(xì)胞體外增殖及誘導(dǎo)分化效果。結(jié)果表明，增殖期標(biāo)記基因和在豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖期呈上升趨勢，至增值期24 h達(dá)到峰值，之后在分化期表達(dá)量不斷下降(圖2A；附圖1A)。分化期標(biāo)記基因和表達(dá)量在豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖期呈下降趨勢，分化初期表達(dá)量上升，末期表達(dá)量下降。分化期標(biāo)記基因在豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中的表達(dá)量，從增殖期到分化期12 h呈上升趨勢，之后下降(圖2B；附圖1，B和C)。表明豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化成功。

收集增殖期6 h、12 h、18 h、30 h、36 h和42 h及分化期6 h、12 h、24 h、30 h、36 h和42 h的豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，qRT-PCR檢測豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖期和分化期不同時間點(diǎn)TCONS_00815878的表達(dá)量。結(jié)果表明，在豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖期，TCONS_00815878表達(dá)量普遍較低，分化初期呈上升趨勢，分化30 h達(dá)到峰值，說明TCONS_00815878可能作用于豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化過程(圖2C)。因此，本研究通過網(wǎng)站在線設(shè)計(jì)ASO片段，在分化期豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中敲低TCONS_00815878。檢測結(jié)果表明，在分化期18 h和30 h的豬骨骼肌衛(wèi)星衛(wèi)星細(xì)胞中，ASO敲低組與對照組相比TCONS_00815878表達(dá)量顯著降低(<0.001)，表明ASO片段具有明顯敲低效果，可 用于后續(xù)TCONS_00815878表達(dá)調(diào)控分析(圖3，A和B)。

在分化18 h和30 h收集細(xì)胞，qRT-PCR檢測豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化標(biāo)記基因和的表達(dá)量。結(jié)果表明，在分化18 h和30 h，基因表達(dá)量顯著下降(<0.05)，和基因呈下降趨勢，推測TCONS_00815878可能促進(jìn)豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化(圖3，C和D)。通過免疫熒光檢測敲低后細(xì)胞樣品中基因表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)量顯著下降(<0.01) (圖3E)。以上結(jié)果初步說明TCONS_00815878可能影響豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分化過程。

2.3 TCONS_00815878靶基因功能預(yù)測及驗(yàn)證

通過計(jì)算TCONS_00815878與其他蛋白編碼基因的表達(dá)量相關(guān)性，預(yù)測得到TCONS_00815878的多個靶基因(附表1)。利用DAVID軟件在線預(yù)測靶基因功能，推測TCONS_00815878可能通過調(diào)控其靶基因，參與生長因子合成、糖酵解和代謝等與骨骼肌發(fā)育有關(guān)的多個生物學(xué)過程(圖4A，附表2)。其中和等基因參與糖酵解 代謝(glycolytic process，glycolysis和glycolysis/ gluconeogenesis)過程，和等基因參與生長因子結(jié)合(growth factor binding和GTPase activator activity)等過程。最后，本研究選取與TCONS_00815878表達(dá)呈正相關(guān)性的和基因，利用qRT-PCR在敲低TCONS_00815878的細(xì)胞中檢測其表達(dá)量。結(jié)果表明，和基因表達(dá)量顯著下降(0.05)，驗(yàn)證了靶基因預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性(圖4B)。通過以上結(jié)果，提示TCONS_ 00815878可能通過調(diào)控其靶基因進(jìn)而影響骨骼肌發(fā)育過程。

圖2 豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化效果及TCONS_00815878在豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞不同時期表達(dá)量

A，B：增殖期基因與分化期基因的表達(dá)；C：TCONS_00815878在豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化不同時間點(diǎn)的表達(dá)量。

圖3 TCONS_00815878對豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化影響

A，B：誘導(dǎo)分化18 h和30 h后TCONS_00815878表達(dá)量；C，D：敲低TCONS_00815878分化18 h和30 h后分化標(biāo)記基因的表達(dá)情況；E：敲低TCONS_00815878后免疫熒光圖片(400í)及基因表達(dá)量。比例尺為20 μm。*表示<0.05，差異顯著；**表示<0.01，***表示<0.001，差異極顯著；NC：正常對照。

3 討論

運(yùn)用高通量測序和生物信息學(xué)分析技術(shù)，目前已鑒定得到了大量的功能基因[15]。研究證實(shí)，人類基因組75%以上的基因被選擇性地轉(zhuǎn)錄，但只有少部分被翻譯，其余不具有任何編碼能力的轉(zhuǎn)錄物被標(biāo)注為非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA)[16]，其中長度大于200 nt的為lncRNA[17]。越來越多的研究表明，lncRNA參與多種細(xì)胞和組織的發(fā)育過程，如基因組印記、干細(xì)胞維持、胚胎發(fā)育及成肌過程等[18~22]。然而，目前l(fā)ncRNA的功能研究，在豬上仍處于探索的初級階段[23]。

圖4 TCONS_00815878靶基因功能預(yù)測及驗(yàn)證結(jié)果

A：GO富集分析和KEGG通路分析結(jié)果圖；B：ASO敲低樣品中靶基因表達(dá)量檢測結(jié)果。*表示<0.05，差異顯著。

豬骨骼肌的發(fā)育主要取決于肌纖維的生成，胚胎期35~90 d的兩次生長波以及出生后1~60 d肌纖維類型的轉(zhuǎn)變，對骨骼肌最終的發(fā)育起關(guān)鍵作用[24,25]。本研究利用qRT-PCR檢測大白豬胚胎期35~55 d及出生后7 d和200 d不同時間點(diǎn)后腿肌肉組織中TCONS_ 00815878表達(dá)量，結(jié)果推測該lncRNA可能在豬胚胎期和出生早期發(fā)揮作用。

豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞是研究骨骼肌發(fā)育規(guī)律進(jìn)行研究的理想材料[26]，本研究利用豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)行TCONS_00815878核質(zhì)定位實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明TCONS_00815878主要分布在豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的細(xì)胞核中。另外，在豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖與分化期不同時間點(diǎn)檢測TCONS_00815878表達(dá)量，結(jié)果推測該基因主要在豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化期發(fā)揮作用。在分化期豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中敲低TCONS_ 00815878，qRT-PCR和免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，相較于對照組，敲低組中基因的表達(dá)量顯著下降。以上結(jié)果推測TCONS_00815878可能促進(jìn)豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分化。

LncRNA作用范圍廣泛，調(diào)控機(jī)制復(fù)雜。根據(jù)lncRNA不同的作用模式分為順式(cis)和反式(trans)兩種調(diào)控模式，其中反式調(diào)控模式可以通過計(jì)算lncRNA與蛋白編碼基因的表達(dá)量相關(guān)性預(yù)測lncRNA靶基因[27]?；赥ang等[12]分析得到的各基因表達(dá)量，本研究通過計(jì)算TCONS_00815878與其他蛋白編碼基因的表達(dá)量相關(guān)性，找到其可能參與調(diào)控的多個靶基因。基因功能富集分析發(fā)現(xiàn)其靶基因富集到多個與肌肉發(fā)育相關(guān)的通路，其中和基因參與糖酵解代謝過程，和基因參與生長因子結(jié)合過程。已有研究表明，糖酵解過程可以通過促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖與分化來支持胚胎肌肉生長[28]。Mangano等[29]研究表明，基因可以通過促進(jìn)多不飽和脂肪酸的合成間接促進(jìn)肌肉的生長發(fā)育。而和基因作為糖酵解或丙酮酸代謝的關(guān)鍵基因，在肌肉生長發(fā)育中起促進(jìn)作用[30]。為驗(yàn)證靶基因預(yù)測準(zhǔn)確性，本研究利用qRT-PCR在敲低后細(xì)胞樣品中檢測與TCONS_00815878表達(dá)呈正相關(guān)性的和基因表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)和基因表達(dá)量與對照組相比下降顯著(0.05)，由此推測TCONS_00815878可能通過調(diào)控其靶基因間接參與骨骼肌的發(fā)育。本研究初步探討了lncRNA TCONS_ 00815878對豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化可能起到的調(diào)控作用，為深入揭示lncRNA TCONS_00815878在豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化和骨骼肌發(fā)育中的作用機(jī)制提供參考。

附錄：

附表1、附表2和附圖1見文章電子版www.chinagene.cn。

附表1 靶基因列表

Supplementary Table 1 List of target genes

附圖1 豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖期和分化期標(biāo)記基因的表達(dá)

Supplementary Fig. 1 Expression level of marker genes in proliferative and differentiation phases of porcine skeletal muscle satellite cells

A：基因表達(dá)量；B：基因表達(dá)量；C：基因表達(dá)量。

[1] Groenen MAM, Archibald AL, Uenishi H, Tuggle CK, Takeuchi Y, Rothschild MF, Rogel-Gaillard C, Park C, Milan D, Megens HJ, Li ST, Larkin DM, Kim H, Frantz LAF, Caccamo M, Ahn H, Aken BL, Anselmo A, Anthon C, Auvil L, Badaoui B, Beattie CW, Bendixen C, Berman D, Blecha F, Blomberg J, Bolund L, Bosse M, Botti S, Bujie Z, Bystrom M, Capitanu B, Silva DC, Chardon P, Chen C, Cheng R, Choi SH, Chow W, Clark RC, Clee C, Crooijmans RPMA, Dawson HD, Dehais P, De Sapio F, Dibbits B, Drou N, Du ZQ, Eversole K, Fadista J, Fairley S, Faraut T, Faulkner GJ, Fowler KE, Fredholm M, Fritz E, Gilbert JGR, Giuffra E, Gorodkin J, Griffin DK, Harrow JL, Hayward A, Howe K, Hu ZL, Humphray SJ, Hunt T, Hornsh?j H, Jeon JT, Jern P, Jones M, Jurka J, Kanamori H, Kapetanovic R, Kim J, Kim JH, Kim KW, Kim TK, Larson G, Lee K, Lee KT, Leggett R, Lewin HA, Li YR, Liu WS, Loveland JE, Lu Y, Lunney JK, Ma J, Madsen O, Mann K, Matthews L, McLaren S, Morozumi T, Murtaugh MP, Narayan J, Nguyen DT, Ni PX, Oh SJ, Onteru S, Panitz F, Park EW, Park HS, Pascal G, Paudel Y, Perez-Enciso M, Ramirez-Gonzalez R, Reecy JM, Zas SR, Rohrer GA, Rund L, Sang YM, Schachtschneider K, Schraiber JG, Schwartz J, Scobie L, Scott C, Searle S, Servin B, Southey BR, Sperber G, Stadler P, Sweedler JV, Tafer H, Thomsen B, Wali R, Wang J, Wang J, White S, Xu X, Yerle M, Zhang GJ, Zhang JG, Zhang J, Zhao SH, Rogers J, Churcher C, Schook LB. Analyses of pig genomes provide insight into porcine demography and evolution., 2012, 491(7424): 393–398.

[2] Almada AE, Wagers AJ. Molecular circuitry of stem cell fate in skeletal muscle regeneration, ageing and disease., 2016, 17(5): 267–279.

[3] Sacco A, Doyonnas R, Kraft P, Vitorovic S, Blau HM. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells., 2008, 456(7221): 502–506.

[4] Allen RE, Merkel RA, Young RB. Cellular aspects of muscle growth: myogenic cell proliferation., 1979, 49(1): 115–127.

[5] Buckingham M. Myogenic progenitor cells and skeletal myogenesis in vertebrates., 2006, 16(5): 525–532.

[6] Jathar S, Kumar V, Srivastava J, Tripathi V. Technological developments in lncRNA biology., 2017, 1008: 283–323.

[7] Yang F, Yi F, Cao HQ, Liang ZC, Du Q. The emerging landscape of long non-coding RNAs., 2014, 36(5): 456–468.楊峰, 易凡, 曹慧青, 梁子才, 杜權(quán). 長鏈非編碼RNA研究進(jìn)展. 遺傳, 2014, 36(5): 456–468.

[8] Lu C, Huang YH. Progress in long non-coding RNAs in animals., 2017, 39(11): 1054–1065.路暢, 黃銀花. 動物長鏈非編碼RNA研究進(jìn)展. 遺傳, 2017, 39(11): 1054–1065.

[9] Weikard R, Demasius W, Kuehn C. Mining long noncoding RNA in livestock., 2017, 48(1): 3–18.

[10] Li H, Feng JC, Li GL, Wang X, Li MZ, Liu HF. The effect of lnc-RAP3 on 3T3-L1 preadipocyte differentiation in mouse., 2018, 40(9): 758–766.李歡, 馮晉川, 李貴林, 王訊, 李明洲, 劉海峰. Lnc- RAP3對小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響. 遺傳, 2018, 40(9): 758–766.

[11] Xie SH. Integrated analysis of miRNA and mRNA expression profiles of muscle development in Changbai and Lantang pigs[Dissertation]. Sun Yat-Sen University, 2017.謝水華. 長白豬和藍(lán)塘豬肌肉發(fā)育差異miRNA和mRNA表達(dá)譜的整合分析[學(xué)位論文]. 中山大學(xué), 2017.

[12] Tang ZL, Wu Y, Yang YL, Yang YCT, Wang ZS, Yuan JP, Yang Y, Hua CJ, Fan XH, Niu GL, Zhang YB, Lu ZJ, Li K. Comprehensive analysis of long non-coding RNAs highlights their spatio-temporal expression patterns and evolutional conservation in., 2017, 7: 43166.

[13] Zhou ZY, Li AM, Adeola AC, Liu YH, Irwin DM, Xie HB, Zhang YP. Genome-Wide identification of long intergenic noncoding RNA genes and their potential association with domestication in pigs., 2014, 6(6): 1387–1392.

[14] Yun L, Liu JP, Zhuang ZX, Yang LQ, Zhang RL, Ye XM, Cheng JQ. Real-time RT-PCR gene expression relative quantification REST?software analysis compared with 2(–ΔΔCT)method., 2007, 7(10): 956–958.庾蕾, 劉建平, 莊志雄, 楊淋清, 張仁利, 葉小明, 程錦泉. 實(shí)時RT-PCR基因表達(dá)相對定量REST?軟件分析與2(–ΔΔCT)法比較. 熱帶醫(yī)學(xué)雜志, 2007, 7(10): 956–958.

[15] Chen G, Shi TL, Shi LM. Characterizing and annotating the genome using RNA-seq data., 2017, 60(2): 116–125.

[16] Djebali S, Davis CA, Merkel A, Dobin A, Lassmann T, Mortazavi A, Tanzer A, Lagarde J, Lin W, Schlesinger F, Xue C, Marinov GK, Khatun J, Williams BA, Zaleski C, Rozowsky J, R?der M, Kokocinski F, Abdelhamid RF, Alioto T, Antoshechkin I, Baer MT, Bar NS, Batut P, Bell K, Bell I, Chakrabortty S, Chen X, Chrast J, Curado J, Derrien T, Drenkow J, Dumais E, Dumais J, Duttagupta R, Falconnet E, Fastuca M, Fejes-Toth K, Ferreira P, Foissac S, Fullwood MJ, Gao H, Gonzalez D, Gordon A, Gunawardena H, Howald C, Jha S, Johnson R, Kapranov P, King B, Kingswood C, Luo OJ, Park E, Persaud K, Preall JB, Ribeca P, Risk B, Robyr D, Sammeth M, Schaffer L, See LH, Shahab A, Skancke J, Suzuki AM, Takahashi H, Tilgner H, Trout D, Walters N, Wang H, Wrobel J, Yu Y, Ruan X, Hayashizaki Y, Harrow J, Gerstein M, Hubbard T, Reymond A, Antonarakis SE, Hannon G, Giddings MC, Ruan Y, Wold B, Carninci P, Guigó R, Gingeras TR. Landscape of transcription in human cells., 2012, 489(7414): 101–108.

[17] Deniz E, Erman B. Long noncoding RNA (lincRNA), a new paradigm in gene expression control., 2017, 17(2–3): 135–143.

[18] Jandura A, Krause HM. The new RNA world: growing evidence for long noncoding RNA functionality., 2017, 33(10): 665–676.

[19] Li YY, Chen XN, Sun H, Wang HT. Long non-coding RNAs in the regulation of skeletal myogenesis and muscle diseases., 2018, 417: 58–64.

[20] Flynn RA, Chang HY. Long noncoding RNAs in cell-fate programming and reprogramming., 2014, 14(6): 752–761.

[21] Qin CY, Cai H, Qing HR, Li L, Zhang HP. Recent advances on the role of long non-coding RNA H19 in regulating mammalian muscle growth and development., 2017, 39(12): 1150–1157.秦辰雨, 蔡禾, 卿涵睿, 李利, 張紅平. 長鏈非編碼RNA H19對哺乳動物肌肉生長發(fā)育的調(diào)控. 遺傳, 2017, 39(12): 1150–1157.

[22] Zhou R, Wang YX, Long KR, Jiang AA, Jin L. Regulatory mechanism for lncRNAs in skeletal muscle development and progress on its research in domestic animals., 2018, 40(4): 292–304.周瑞, 王以鑫, 龍科任, 蔣岸岸, 金龍. LncRNA調(diào)控骨骼肌發(fā)育的分子機(jī)制及其在家養(yǎng)動物中的研究進(jìn)展. 遺傳, 2018, 40(4): 292–304.

[23] Li MX, Huang T, Ma LP, Liu Y, Li T, Gong HB, Qiu MY, Xie S, Sun XM. Cloning of porcine lncRNA-ENSSSCT-00000018610 and its expression pattern in porcine ovarian follicles., 2018, 49(9): 1830–1839.李夢尋, 黃濤, 馬力鵬, 劉乙, 李濤, 公紅斌, 邱梅玉, 謝蘇, 孫曉梅. 豬lncRNA-ENSSSCT00000018610的克隆及其在豬卵泡中的表達(dá). 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2018, 49(9): 1830–1839.

[24] Picard B, Lefaucheur L, Berri C, Duclos MJ. Muscle fibre ontogenesis in farm animal species., 2002, 42(5): 415–431.

[25] Lefaucheur L, Vigneron P. Post-natal changes in some histochemical and enzymatic characteristics of three pig muscles., 1986, 16(3): 199–216.

[26] Zammit PS, Heslop L, Hudon V, Rosenblatt JD, Tajbakhsh S, Buckingham ME, Beauchamp JR, Partridge TA. Kinetics of myoblast proliferation show that resident satellite cells are competent to fully regenerate skeletal muscle fibers., 2002, 281(1): 39–49.

[27] Liao Q, Liu CN, Yuan XY, Kang SL, Miao RY, Xiao H, Zhao GG, Luo HT, Bu DC, Zhao HT, Skogerb? G, Wu ZD, Zhao Y. Large-scale prediction of long non-coding RNA functions in a coding-non-coding gene co-expression network., 2011, 39(9): 3864–3878.

[28] Sanoudou D, Haslett JN, Kho AT, Guo SQ, Gazda HT, Greenberg SA, Lidov HGW, Kohane IS, Kunkel LM, Beggs AH. Expression profiling reveals altered satellite cell numbers and glycolytic enzyme transcription in nemaline myopathy muscle., 2003, 100(8): 4666–4671.

[29] Mangano KM, Sahni S, Kerstetter JE, Kenny AM, Hannan MT. Polyunsaturated fatty acids and their relation with bone and muscle health in adults., 2013, 11(3): 203–212.

[30] Lambadiari V, Triantafyllou K, Dimitriadis GD. Insulin action in muscle and adipose tissue in type 2 diabetes: The significance of blood flow., 2015, 6(4): 626–633.

The effect of lncRNA TCONS_00815878 on differentiation of porcine skeletal muscle satellite cells

Ziying Huang1, Long Li1, Qianqian Li1, Xiangdong Liu1,2, Changchun Li1,2

Porcine skeletal muscle development is a complex biological process, and differentiation of skeletal muscle satellite cells is an important part of skeletal muscle development. In recent years, it has been found that lncRNA plays an important role in the differentiation of skeletal muscle satellite cells. Here we investigate the effect of lncRNA TCONS_00815878 on the differentiation of porcine skeletal muscle satellite cells. We first used qRT-PCR to detect the expression levels of TCONS_00815878 in six tissues (heart, spleen, lung, kidney, back muscles and leg muscles) of Yorkshire piglets within seven days of birth.At the same time, the expression levels of TCONS_00815878 at five different time points from the embryonic stage to the postnatal stage (35 d, 45 d, 55 d of embryos, and 7 d, 200 d of postpartum leg muscles) were examined. The expression of the differentiation marker genes,andwas examined by knocking down TCONS_00815878 in porcine skeletal muscle satellite cells using antisense oligonucleotides (ASO). The target gene of TCONS_00815878 was predicted by bioinformatics analysis, and the function and pathway of its target gene were predicted online using DAVID software. The results showed that TCONS_00815878 had the highest expression level in pig myocardium and leg muscles. Within seven days after birth, TCONS_00815878 increased in the muscle tissue of pigs, and reached the peak of expression level on the 7th day. During the process of proliferation and differentiation of porcine skeletal muscle satellite cells, the expression level of TCONS_00815878 increased during the differentiation stage and peaked at 30 h of differentiation. After knocking down TCONS_00815878, the expression levels ofandwere decreased, but the expression level ofwas significantly decreased (<0.05). In addition, functional predictions revealed that the target gene of TCONS_00815878 is enriched in multiple biological processes, such as glycolysis and pyruvate metabolism, related to skeletal muscle satellite cell differentiation. This study speculates that lncRNA TCONS_00815878 may promote the differentiation of porcine skeletal muscle satellite cells.

lncRNA TCONS_00815878; porcine skeletal muscle satellite cells; differentiation; knockdown; target gene

2019-05-21;

2019-11-19

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：31872322)和中央高校創(chuàng)新研究基金項(xiàng)目(編號：2662017PY030)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31872322) and Central University Innovation Research Fund (No. 2662017PY030)]

黃子瑩，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：動物遺傳育種大數(shù)據(jù)分析。E-mail: 327620138@qq.com

李長春，博士生導(dǎo)師，研究方向：豬重要經(jīng)濟(jì)性狀的表觀遺傳學(xué)基礎(chǔ)。E-mail: lichangchun@mail.hzau.edu.cn

10.16288/j.yczz.19-146

2019/12/7 17:08:48

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20191206.0936.004.html

(責(zé)任編委: 李明洲)