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      白花蛇舌草提取物抗多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞機(jī)制研究

      2019-12-25 03:49:10劉淑艷林圣云
      浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志 2019年12期
      關(guān)鍵詞:白花蛇舌草細(xì)胞周期

      劉淑艷 黃 暢 林圣云

      多發(fā)性骨髓瘤(MM)為血液科常見(jiàn)惡性腫瘤,目前多種新藥包括新一代的蛋白酶體抑制劑、單克隆抗體及移植技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展,大大改善了MM 患者預(yù)后。但幾乎所有患者都會(huì)復(fù)發(fā),而且對(duì)標(biāo)準(zhǔn)治療方案耐藥[1]。臨床除使用西藥治療外常輔助以中草藥治療以期縮短緩解時(shí)間、減輕并發(fā)癥、改善耐藥、提高患者生活質(zhì)量及延長(zhǎng)患者生命。白花蛇舌草為臨床常用抗腫瘤中藥,有實(shí)驗(yàn)證明,白花蛇舌草多糖成分對(duì)MM 細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡作用[2]。本研究將白花蛇舌草提取物(HDE)單體成分作用于不同MM 細(xì)胞,初步探究其抗腫瘤成分及抗腫瘤機(jī)制,為研究MM治療新藥及改善耐藥提供依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 材 料 RPMI 8226 和NCI-H929 細(xì)胞株來(lái)源于浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液學(xué)研究所。HDE 由浙江省中醫(yī)院中藥制劑室從白花蛇舌草(杭州蕭山醫(yī)藥公司中藥分公司,批號(hào)110326)中提取制備。硼替佐米(西安楊森制藥有限公司,規(guī)格:3.5mg,批號(hào)170615343);As2O3(黑龍江哈爾濱醫(yī)大藥業(yè),規(guī)格:10mg,批號(hào)20170401)。

      1.2 試劑及儀器 IMDM 培養(yǎng)液(Gibco);胎牛血清(Gibco);四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT,Sigma);碘化丙錠(PI)試劑盒(聯(lián)科生物,批號(hào)A82381024);細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(聯(lián)科生物,批號(hào)A80010633);二氧化碳孵育箱(美國(guó)Thermo,3111);流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司,F(xiàn)ACS CantoⅡ);酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-TEX,Epoch2);二甲基亞砜(DMSO,SIGMA 公司);水平式離心機(jī)(北京京立離心機(jī)有限公司,LDZ5-2)。

      1.3 方 法

      1.3.1 HDE 制備 取200g 白花蛇舌草的干燥全草,經(jīng)粉碎后用5400mL 體積分?jǐn)?shù)80%乙醇浸泡(RT,0.5h)并濃縮提?。?0℃,2h),再將經(jīng)過(guò)干燥蒸發(fā)得到的提取物溶解于200mL 蒸餾水中,用乙酸乙酯進(jìn)行液液萃取,把過(guò)濾和干燥得到的5g 提取物再次溶解于100mL 蒸餾水中,并用蒸餾水和體積分?jǐn)?shù)60%乙醇進(jìn)行連續(xù)多次洗脫,將乙醇餾分洗脫物收集和干燥后用蒸餾水配成12mg/mL 的受試物樣品。

      1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)于DMEM 培養(yǎng)液(含胎牛血清)的培養(yǎng)瓶中,并置于CO2孵育箱中進(jìn)行孵育,常規(guī)換液并觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,每2~3 天傳代1 次,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

      1.3.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RPMI 8226 及NCI-H929 細(xì)胞,以6×105/mL 接種于96 孔培養(yǎng)板,終體積150μL。分別按終濃度1.25、2.50、5.00、7.50、10.00μM 加入As2O3,按終濃度12.5、25.0、50.0、75.0、100.0nM 加入硼替佐米,作用24、48h。分別按終濃度25、50、75、100、125μg/mL 加入HDE,作用48、72h。培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入MTT 15μL(5g/L),37℃放置4h;2500r/min 離心20min,棄上清液,每孔加入DMSO 150μL,振動(dòng)儀振動(dòng)10min 使結(jié)晶物搖勻溶解。酶聯(lián)免疫分析儀讀取490nm 處的吸光度(OD)值,并用以下公式計(jì)算各組細(xì)胞增值抑制率。實(shí)驗(yàn)設(shè)4 個(gè)平行孔,重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。按公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次,每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔,取平均值為最終結(jié)果。Logit 法計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50);細(xì)胞增殖抑制率(%)=(對(duì)照組OD-實(shí)驗(yàn)組OD)÷(對(duì)照組OD-空白組OD)×100%。

      1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期 RPMI 8226 細(xì)胞以2×105/mL 接種于培養(yǎng)瓶,終體積5mL。按終濃度2.5、5.0、10.0μM 分別加入As2O3,按終濃度25、50、100nM 分別加入硼替佐米,作用24h 后測(cè)定細(xì)胞細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期。按終濃度50、100、150μg/mL分別加入HDE,作用48h 后測(cè)定細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期,同時(shí)設(shè)空白(不加藥)對(duì)照組,800r/min 離心5min后收集細(xì)胞,分別收集1.5×105個(gè)和2×105個(gè)細(xì)胞,冷PBS 洗滌2 次,800r/min,4℃離心5min,棄上清。100μL 1×Binding Buffer 重懸細(xì)胞,加5μL Annexin V-FITC 和5μL PI 染色劑,輕輕混勻,避光室溫反應(yīng)15min,加入300μL 1×Binding Buffer 重懸,立刻用流式細(xì)胞儀檢測(cè),用Cellquest 1.2 分析軟件分析結(jié)果。

      1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,單變量?jī)山M比較采用t 檢驗(yàn),多組資料比較采用單因素方差分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 不同藥物及濃度對(duì)RPMI 8226 及NCI-H929細(xì)胞增殖抑制的影響 不同濃度As2O3、硼替佐米及HDE 作用于RPMI 8226 及NCI-H929 細(xì)胞增殖的抑制作用具有濃度及時(shí)間依賴(lài)性(趨勢(shì)圖見(jiàn)圖1-1 至2-3)。不同藥物作用于細(xì)胞的IC50 見(jiàn)表1。

      圖1-1 不同濃度As2O3作用于RPMI 8226

      圖1-2 不同濃度硼替佐米作用于RPMI 8226

      圖1-3 不同濃度HDE 作用于RPMI 8226

      圖2-1 不同濃度As2O3作用于NCI-H929

      圖2-2 不同濃度硼替佐米作用于NCI-H929

      圖2-3 不同濃度HDE 作用于NCI-H929

      2.2 不同藥物及濃度對(duì)RPMI 8226 及NCI-H929細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,硼替佐米均可使RPMI 8226 及NCI-H929 細(xì)胞G2/M 期所占比例增加,HDE 均可使RPMI 8226及NCI-H929 細(xì)胞G0/G1 期所占比例顯著增加。而As2O3對(duì)RPMI 8226 細(xì)胞周期無(wú)明顯影響,可使NCI-H929 細(xì)胞G0/G1 期所占比例增加。且上述三種藥物濃度越大,對(duì)RPMI 8226 及CNI-H929 細(xì)胞周期影響越大。見(jiàn)圖3-1、2,表2-4。

      圖3-1 不同藥物對(duì)RPMI 8226 細(xì)胞周期的影響

      圖3-2 不同藥物對(duì)NCI-H929 細(xì)胞周期的影響

      2.3 不同藥物及濃度對(duì)RPMI 8226 及NCI-H929細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,As2O3、硼替佐米、HDE 均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,且隨著濃度的增加,細(xì)胞凋亡比例增高。見(jiàn)圖4-1、2,表5-7。

      表1 不同藥物不同時(shí)間作用于RPMI 8226、NCI-H929 細(xì)胞的IC50()

      表1 不同藥物不同時(shí)間作用于RPMI 8226、NCI-H929 細(xì)胞的IC50()

      注:HDE:白花蛇舌草提取液;IC50:半數(shù)抑制濃度

      表2 不同濃度As2O3對(duì)RPMI 8226、NCI-H929細(xì)胞周期影響(%)

      表3 不同濃度硼替佐米對(duì)RPMI 8226、NCI-H929細(xì)胞周期影響(%)

      表4 不同濃度HDE 對(duì)RPMI 8226、NCI-H929細(xì)胞周期影響(%)

      圖4-1 不同藥物對(duì)RPMI 8226 細(xì)胞凋亡的影響

      圖4-2 不同藥物對(duì)NCI-H929 細(xì)胞凋亡的影響

      表5 不同濃度As2O3作用于RPMI 8226、NCI-H929 細(xì)胞24h 的凋亡率(%,)

      表5 不同濃度As2O3作用于RPMI 8226、NCI-H929 細(xì)胞24h 的凋亡率(%,)

      注:不同濃度As2O3對(duì)RPMI 8226、NCI-H929 細(xì)胞凋亡率的影響(P均<0.01);與0μM 組比較,*P<0.05;與2.5μM 組比較,△P<0.05;與5.0μM 組比較,▲P<0.05

      表6 不同濃度硼替佐米作用于RPMI 8226、NCI-H929細(xì)胞24h 的凋亡率(%,)

      表6 不同濃度硼替佐米作用于RPMI 8226、NCI-H929細(xì)胞24h 的凋亡率(%,)

      注:不同濃度硼替佐米對(duì)RPMI 8226、NCI-H929 細(xì)胞凋亡率的影響(P均<0.01);與0nM 組比較,*P<0.05;與25nM 組比較,△P<0.05;與50nM 組比較,▲P<0.05

      表7 不同濃度HDE 作用于RPMI 8226、NCI-H929 細(xì)胞48h的凋亡率(%,)

      表7 不同濃度HDE 作用于RPMI 8226、NCI-H929 細(xì)胞48h的凋亡率(%,)

      注:不同濃度HDE 對(duì)RPMI 8226、NCI-H929 細(xì)胞凋亡率的影響(P 均<0.01);與0μg/mL 組比較,*P<0.05;與50μg/mL 組比較,△P<0.05;與100μg/mL 組比較,▲P<0.05;HDE:白花蛇舌草提取液

      3 討論

      本實(shí)驗(yàn)提取白花蛇舌草浸取物,結(jié)果顯示,HDE在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)MM 細(xì)胞具有較為明顯劑量依賴(lài)的殺傷作用,50~75μg/mL 對(duì)細(xì)胞的抑制作用最為明顯。其通過(guò)改變細(xì)胞周期及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮抑制MM 的作用。

      腫瘤細(xì)胞的周期調(diào)控也是治療腫瘤的方法之一[3]。本研究發(fā)現(xiàn),HDE 可阻滯MM 細(xì)胞在G0/G1期,這是其具有抗腫瘤作用的機(jī)理之一,其對(duì)細(xì)胞周期素D1、E 以及細(xì)胞周期正性因子CDK2/4/6 的作用機(jī)制還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。研究顯示,一定濃度的As2O3可使Hs-SμLton 細(xì)胞主要阻滯于G0/G1 期,而誘發(fā)細(xì)胞凋亡。As2O3誘導(dǎo)MM 細(xì)胞凋亡與線粒體相關(guān)[4]。HDE 促凋亡作用可能與As2O3有相似之處。同時(shí)其具有誘導(dǎo)MM 細(xì)胞凋亡的作用,但具體機(jī)制與蛋白酶體抑制劑不同。以硼替佐米為代表的蛋白酶體抑制劑可將MM 細(xì)胞阻滯在G2 期,其具體的機(jī)制包括促進(jìn)MM 細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白NOXA 和抑癌基因p53 表達(dá),激活Caspase 通路,導(dǎo)致組蛋白高度乙?;?,從而導(dǎo)致MM 細(xì)胞凋亡等[5-6]。目前治療MM 新藥物及方法層出不窮,免疫調(diào)節(jié)劑、組蛋白去乙酰化酶抑制劑、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑、單克隆抗議及CAR-T治療等均在深入研究[7-8]。

      目前已知的可能導(dǎo)致MM 耐藥的機(jī)制較多,有研究發(fā)現(xiàn),miR-221-222 可下調(diào)激素敏感MM 細(xì)胞中p53 相關(guān)凋亡調(diào)節(jié)物(PUMA),促使MM 細(xì)胞對(duì)激素耐藥[9]。高表達(dá)的重組蛋白及超二倍體都與MM 的預(yù)后良好相關(guān),重組蛋白的下調(diào)導(dǎo)致MM 細(xì)胞對(duì)免疫調(diào)節(jié)劑的耐藥[10]。硼替佐米耐藥機(jī)制部分原因可能是IGF-1 及受體的高表達(dá)激活下游的Akt 及JNK 通路[11]。Hedgehog 信號(hào)通路的活化,促進(jìn)下游抗凋亡基因BCL2 的表達(dá)可抑制硼替佐米誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用[12]。組蛋白去乙?;种苿℉DACi)對(duì)于多種抗MM 藥物的耐藥,可通過(guò)下調(diào)相關(guān)耐藥基因(miR-221-222、c-Myc)、消除IL-6 和IGF-1 對(duì)MM 細(xì)胞的保護(hù)作用、阻礙HIF-1α 活化、降低NF-κB 活性等,從而發(fā)揮克服相關(guān)藥物耐藥[13-16]。目前中藥有效成分作為化療及靶向治療腫瘤的輔助治療,逆轉(zhuǎn)MM 耐藥方面均發(fā)揮了較大作用,為其他抗MM 中藥的研究提供了更為成熟的思路及方法[17-18]。

      綜上所述,HDE 可能通過(guò)誘導(dǎo)RPMI 8226 及NCI-H929 細(xì)胞凋亡及阻滯細(xì)胞周期來(lái)抑制骨髓瘤細(xì)胞增殖。

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