李俊英 孫如建 李忠峰 魏中艷 任玉龍 王 俊邱麗娟,*

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大豆7S球蛋白α'亞基缺失新種質(zhì)中黃608的分子鑒定

李俊英1,2,**孫如建2,3,**李忠峰2魏中艷2任玉龍2王 俊1,*邱麗娟2,*

1長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 湖北荊州 434025;2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/ 國家農(nóng)作物基因資源與遺傳改良重大科學(xué)工程/ 農(nóng)業(yè)部種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100081;3呼倫貝爾市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所, 內(nèi)蒙古扎蘭屯 162650

大豆7S球蛋白α'亞基含量與大豆的營養(yǎng)品質(zhì)和加工特性關(guān)系密切。本研究利用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和免疫印跡法(Western blot)從中品661的EMS突變庫中篩選出α'亞基缺失突變體中黃608。利用中黃608與登科1號創(chuàng)建了一個(gè)由210個(gè)個(gè)體組成的F2分離群體。遺傳分析表明, α'亞基缺失由1對隱性單基因控制。利用連鎖分析方法將該基因定位于第10染色體標(biāo)記SSR10-1489與SSR10-1612之間, 其中, 包括控制α'亞基合成基因(), 序列分析發(fā)現(xiàn), 中黃608在第1外顯子第84個(gè)堿基發(fā)生單堿基突變(G84→A84), 導(dǎo)致氨基酸翻譯提前終止。根據(jù)新發(fā)現(xiàn)的變異位點(diǎn)開發(fā)了共顯性分子標(biāo)記, 并檢測F2個(gè)體基因型, 結(jié)果表明,基因型與α'亞基表型共分離。本研究不僅為大豆優(yōu)質(zhì)育種提供了新材料, 同時(shí)也為分子育種提供了技術(shù)支持。

大豆; α'亞基; 突變體; 7S球蛋白; dCAPs標(biāo)記

大豆[(L.) Merr.]種子中含有約40%的蛋白, 是人類和動物食用植物蛋白的主要來源之一。大豆富含鈣、鐵、鋅、鎂和維生素B等多種重要營養(yǎng)元素[1], 與人體健康密切相關(guān), 具有如降膽固醇[2-3]、降血壓[4]、抗癌癥[5]等功效。

根據(jù)沉降系數(shù)大小, 可將大豆蛋白分為2S、7S、11S、15S等組分[9]。大豆蛋白70%為貯藏蛋白, 主要由7S球蛋白(β-conglycinin)與11S大豆球蛋白(glycinin)構(gòu)成。其中7S球蛋白約占大豆總蛋白的30%, 它的組成亞基α' (~76 kD)、α (~71 kD)、β (~52 kD)等是引起人類和動物過敏的主要致敏源[10]。已有研究發(fā)現(xiàn), α' (~76 kD)蛋白亞基含硫氨基酸較少[11], α'亞基缺失型大豆比α'亞基正常型大豆的蛋白凝膠硬度大[12]。α'亞基缺失不僅有利于豆腐的加工, 而且對大豆制品營養(yǎng)品質(zhì)、加工特性等具有積極影響[13-14],因此, 控制7S球蛋白含量、培育α'亞基缺失材料已成為近年來大豆學(xué)科的重要研究方向之一。

日本學(xué)者對大豆α'亞基缺失的研究較早。Kitamura等[15]于1981年從日本大豆種質(zhì)資源中鑒定出α'亞基缺失種質(zhì)“Keburi”以及α和β亞基低含量種質(zhì)。Takahashi等[16]利用γ射線處理“Keburi”, 從誘變后代中篩選出α'和α亞基雙缺材料及7S球蛋白低含量材料, 通過遺傳分析證明, α'亞基缺失表型由一個(gè)單隱性基因控制[17]。Teraishi等[18]從野生大豆資源中發(fā)現(xiàn)一份包含α'亞基整個(gè)7S亞基缺失的材料“QT2”, 并認(rèn)為該性狀由第20染色體上的一個(gè)顯性位點(diǎn)控制。國內(nèi)學(xué)者宋波等[19]和劉珊珊[20]等利用引自日本的α'+α亞基雙缺失材料日B和當(dāng)?shù)卦耘嗥贩N組配, 從后代中篩選出α'亞基、α'+α缺失等亞變異類型。我國關(guān)于α'亞基缺失材料的創(chuàng)制和遺傳分子機(jī)制研究鮮見報(bào)道。

本研究利用SDS-PAGE技術(shù), 從中品661的EMS突變體庫[21]中篩選和創(chuàng)制α'亞基缺失種質(zhì)中黃608; 利用該突變體和登科1號構(gòu)建F2遺傳分離群體, 并通過連鎖分析將控制α'亞基基因定位在第10染色體上物理長度為1.77 Mb區(qū)間內(nèi), 進(jìn)一步序列分析發(fā)現(xiàn), 該突變體的α'亞基缺失可能是由基因新的等位變異控制, 并開發(fā)了分子標(biāo)記。本研究為培育α'亞基缺失大豆新品系提供了優(yōu)異種質(zhì)材料和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 遺傳群體的構(gòu)建

2016年夏季將大豆品種中品661的1000份M5代EMS誘變家系[21]播種于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所北京順義試驗(yàn)基地。同時(shí)在內(nèi)蒙古呼倫貝爾農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所試驗(yàn)地用α'亞基缺失突變體中黃608與當(dāng)?shù)刂髟云贩N登科1號組配雜交組合, 在北京順義種植獲得F1種子, 并于當(dāng)年冬季在海南加代種植收獲F2種子。

1.2 α'亞基缺失候選基因定位

從宋啟建等[22]開發(fā)的SSR標(biāo)記中, 隨機(jī)選取均勻覆蓋大豆20條染色體的540個(gè)標(biāo)記。利用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù), 篩選出突變體中黃608和登科1號之間具有多態(tài)性的標(biāo)記, 分別鑒定F2個(gè)體的基因型, 通過連鎖分析確定α'亞基缺失相關(guān)基因的候選定位區(qū)間。

1.3 大豆貯藏蛋白亞基組成聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

選取親本及F2籽粒, 在種臍背部磨取豆粉。稱取0.5 mg豆粉放入2.0 mL離心管中, 加入0.5 mL蛋白提取液(0.2% SDS, 0.05 mol L–1Tris-HCl pH 8.0, 0.01 mol L–1巰基乙醇, 1 g L–1溴酚藍(lán), 5 mol L–1Urea)并振蕩混勻, 于4℃環(huán)境下15,294×離心10 min, 取上清液。蛋白電泳所需凝膠厚度為1 mm, 濃縮膠濃度和分離膠濃度分別為5%、12%。取5 μL蛋白提取液進(jìn)行SDS-PAGE, 電泳結(jié)束進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色、脫色。后用5%甘油和玻璃紙封存、照相和分析。

1.4 DNA提取、PCR擴(kuò)增反應(yīng)及產(chǎn)物測序

取幼嫩三出復(fù)葉, 利用CTAB法提取基因組DNA[23], 加200 μL滅菌水溶解, 經(jīng)濃度檢測后稀釋為20 ng μL–1, 置–20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR體系包括5 μL DNA (20 ng μL–1)、2 μL dNTPs、2 μL buffer、0.2 μL Easy酶和10.8 μL滅菌水。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min后, 經(jīng)過34個(gè)循環(huán)的95℃變性30 s、55℃退火溫度30 s和72℃延伸 20 s, 34個(gè)循環(huán), 再經(jīng)72℃ 5 min。從每個(gè)擴(kuò)增樣品分別取2 μL產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測, 同時(shí)將剩余樣品送公司進(jìn)行PCR測序。測序結(jié)果通過在線軟件Multalin等比對分析(http://multalin. toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html)。

1.5 引物設(shè)計(jì)及dCAPS標(biāo)記開發(fā)

從NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載靶基因的基因組序列, 以其為模板利用Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)設(shè)計(jì)引物-A和-B, 其對應(yīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度分別為1598 bp和1702 bp, 可以覆蓋基因組序列全長(表1)。

表1 基因Cgy-1 PCR擴(kuò)增引物

基于突變體中黃608在基因上存在的SNP位點(diǎn), 利用在線軟件dCAPS Finder 2.0 (http://helix. wustl.edu/dcaps/dcaps.html)開發(fā)一個(gè)分子標(biāo)記。因含有I內(nèi)切酶識別位點(diǎn)T↓CGA序列, 以突變體中黃608基因組為PCR模板的擴(kuò)增產(chǎn)物可被切割為2個(gè)片段, 而野生型中品661為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物因不含有此識別位點(diǎn), 不能為I內(nèi)切酶切割, 僅有一個(gè)條帶(表2)。10 μL酶切反應(yīng)體系包含5 μL PCR產(chǎn)物、3 UI內(nèi)切酶和1.5 μL Cutsmart緩沖液。將酶切反應(yīng)體系混勻, 放入37℃水浴鍋溫浴酶切1 h后, 用瓊脂糖凝膠電泳(m V–1, 2%)檢測, 80 V電壓下運(yùn)行1.5 h。擴(kuò)增所需引物及限制性內(nèi)切酶相關(guān)信息如表2所示。

表2 dCAPS標(biāo)記的引物序列和內(nèi)切酶

1.6 Western blot

取野生型中品661和突變體中黃608籽粒樣品各5 mg, 研磨成豆粉分別加入500 μL提取液(0.05 mol L–1Tris-HCl pH 8.0)提取總蛋白, 具體流程參考[24]。蛋白電泳需要凝膠厚度為0.75 mm, 分離膠(m V–1, 12.5%)和濃縮膠(m V–1, 5%)各2.5 mL。從制備好的蛋白樣品中各取10 μL上樣, 濃縮膠120 V電壓運(yùn)行半個(gè)小時(shí), 轉(zhuǎn)至140 V電壓下運(yùn)行1 h后結(jié)束電泳。隨后, 切下分離膠并用半干轉(zhuǎn)膜儀進(jìn)行轉(zhuǎn)膜, 所需濾紙及NC膜在轉(zhuǎn)膜前用轉(zhuǎn)膜液提前浸泡。25 V電壓下轉(zhuǎn)膜1 h, 將NC膜取出放在含有5 mL 5%牛奶的小盒中, 并放置在搖床上封閉1 h; 隨后, 在盒子中加入1 μL一抗(1∶5000)(IP-IF小鼠多抗), 孵育1 h后將牛奶倒掉并加入5 mL PBST洗膜液, 置搖床上振蕩(100 r min–1) 5 min, 連續(xù)洗3次。洗膜后加入5 mL的PBST和1 μL的二抗(1∶10,000), 孵育1 h后加入約5 mL的PBST沖洗, 連續(xù)沖洗3遍, 每次5 min; 最后加入光學(xué)顯色劑顯色, 掃描照相。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 α'蛋白亞基缺突變體篩選及表型鑒定

大豆種子總蛋白電泳(SDS-PAGE)圖譜中, 通常有7個(gè)蛋白條帶比較清晰(圖1-a, ZP661), 它們分別對應(yīng)7S球蛋白的Lox、α、α'、β亞基和11S球蛋白的A3亞基、酸性亞基(Acidic)、堿性亞基(Basic)。利用SDS-PAGE技術(shù), 從中品661的1055份M4代EMS誘變材料中篩選到1份α'亞基缺失材料, 命名為中黃608 (圖1-a)。從后代株行表型鑒定結(jié)果進(jìn)一步證實(shí), α'亞基缺失突變體表型可以穩(wěn)定遺傳(圖1-b)。

2.2 α'亞基缺失突變體中黃608的遺傳分析

為了明確中黃608 α'亞基缺失性狀的遺傳方式, 構(gòu)建了該突變體與大豆品種登科1號的F2遺傳分離群體。SDS-PAGE鑒定結(jié)果顯示, 雜交F1籽粒均含有α'亞基, 表型與登科1號一致。210個(gè)F2籽粒中, α'亞基缺失材料64粒, α'亞基正常146粒。經(jīng)卡方檢驗(yàn), F2遺傳分離群體中, α'亞基正常與缺失籽粒比例符合3∶1 (χ2= 1.43,= 0.08), 證明中黃608的籽粒α'亞基缺失性狀是由一對隱性單基因控制(表3)。

圖1 α'亞基缺失突變體的表型鑒定

a: α'亞基缺失材料中黃608與野生型中品661的SDS-PAGE電泳結(jié)果。b: 中黃608子代株行的α'亞基表型鑒定結(jié)果, 1~8分別為8個(gè)子代。

a: protein profiles of the α' subunit deletion mutant ZH608 and the wild-type ZP661 by SDS-PAGE. b: α' subunit mutant trait of ten indivi-duals derived from ZH608 validated by SDS-PAGE (lanes 1–8).

表3 α'亞基缺失突變體F2群體遺傳分析

2.3 α'亞基缺失突變體Cgy-1基因定位與候選基因篩選

選取均勻覆蓋大豆基因組20條染色體540對SSR標(biāo)記, 通過PCR反應(yīng)和聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選出親本間具有多態(tài)性的84個(gè)標(biāo)記。利用集團(tuán)分離分析法(BSA)和F2突變個(gè)體, 將α'亞基基因定位在第10染色體標(biāo)記SSR10_0982和SSR10_1638之間(圖2-a)。通過進(jìn)一步的多態(tài)性標(biāo)記加密和基因型檢測, 將定位區(qū)間縮小至標(biāo)記SSR10_1489和SSR10_1612之間, 區(qū)間物理長度為1.77 Mb (圖2-b)。

查詢大豆Williams 82參考基因組, 該定位區(qū)間內(nèi)注釋編碼蛋白的基因有190個(gè)。其中基因()在NCBI數(shù)據(jù)庫的功能注釋為與α'亞基蛋白編碼有關(guān)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gene/?term=Cgy-1), Harada等[25]研究發(fā)現(xiàn)是編碼α'亞基的唯一基因, 而且該基因在大豆籽粒中高表達(dá), 推測該基因可能也是引起中黃608 α'亞基缺失的候選基因。

2.4 Cgy-1基因新等位變異位點(diǎn)的鑒定

在參考基因組中基因全長2730 bp, 包含6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子, 其中CDS序列全長1866 bp, 編碼621個(gè)氨基酸。根據(jù)基因組序列, 我們設(shè)計(jì)2對引物Cgy1-F1和Cgy1-R1, 并對野生型中品661和α'亞基缺失突變體中黃608基因組DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物測序結(jié)果顯示, 中黃608與野生型在基因組序列第一外顯子上第84位核苷酸發(fā)生了變異, 由G變?yōu)榱薃, 導(dǎo)致密碼子TGG (色氨酸)變成TGA (終止子), 翻譯出氨基酸長度為27個(gè), 顯著短于野生型621個(gè)。推測基因截短的異常氨基酸序列可能造成了大豆籽粒蛋白中α'亞基缺失(圖3-a)。利用合成的抗體對野生型中品661和α'亞基缺失突變體中黃608進(jìn)行免疫印跡檢測(Western blot)也顯示, 野生型中品661在76 kD位置有2個(gè)條帶, 而α'亞基缺失突變體中黃608在76 kD對應(yīng)位置缺失相應(yīng)的一條α'亞基蛋白條帶(圖3-b), 進(jìn)一步證實(shí)的基因組序列改變與中黃608 α'亞基缺失表型相關(guān)。

圖2 α'亞基缺失突變體的基因定位

a: 用210個(gè)F2單株將候選基因定位到標(biāo)記SSR10-0982與SSR10-1638之間。b: 通過多態(tài)性標(biāo)記篩選和加密, 將候選基因定位區(qū)間縮小至SSR10-1489與SSR10-1619之間。c: 突變體中黃608在基因第1外顯子的第84位堿基發(fā)生突變(核苷酸G變?yōu)锳), 造成編碼氨基酸序列的提前終止。藍(lán)色方框代表外顯子, 白色方框代表5'和3'UTR, 黑線代表基因的內(nèi)含子。

a: the candidate genewas mapped to between SSR marker SSR10-0982 and SSR10-1638 by using 210 F2individuals. b: the candidate interval was reduced to SSR10-1489 and SSR10-1619 by SSR polymorphic markers. c: the mutation of eighty-fourth bases at the first exon ofgene in the mutant Zhonghuang 608, resulted in pre-terminating of encoding amino acid. Blue boxes, white boxes, and black lines represent exons, 5' UTR/3' UTR and introns, respectively.

圖3 野生型和突變體的SDS-PAGE (a)和Western blot (b)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Fig. 3 SDS-PAGE (a) and Western blot (b) results of mutants and wild type

a: SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示突變體中黃608 (ZH608)缺少α'亞基條帶。b: Western blot結(jié)果: 抗體雜交結(jié)果表明野生型(ZH608)有2條帶; 突變體(ZP661)缺失了α'亞基條帶。

a: the result of SDS-PAGE showed that the mutant ZH608 lacked α' subunit. b: in antibody hybridization results showed that the wild type (ZH608) had two bands and the mutant (ZP661) lacked the α' subunit band.

2.5 dCAPS分子標(biāo)記開發(fā)及其在F2群體中的應(yīng)用

基于中黃608中基因上新的點(diǎn)突變, 本研究開發(fā)了一個(gè)dCAPS分子標(biāo)記(命名為GM7S-1)。利用其對應(yīng)引物(表2)分別擴(kuò)增中黃608和野生型中品661基因組DNA, PCR產(chǎn)物長度均為158 bp (圖4-a), 但是中黃608 的擴(kuò)增條經(jīng)I限制性內(nèi)切酶消化后, 產(chǎn)生長度為138 bp和20 bp (圖4-b)的2個(gè)片段, 而野生型158 bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不能被該內(nèi)切酶所消化。因而, 該 dCAPS標(biāo)記可準(zhǔn)確區(qū)分野生型和α'亞基缺失突變體中黃608。

在此基礎(chǔ)之上, 利用標(biāo)記GM7S-1對中黃608與登科1號雜交組合的210個(gè)F2子代進(jìn)行基因型檢測顯示, 64個(gè)α'亞基缺失個(gè)體的PCR產(chǎn)物均可以被酶切為2個(gè)片段, 為純合突變基因型A; 146個(gè)α'亞基正常個(gè)體中, 80個(gè)F2的PCR產(chǎn)物完全不能被酶切, 為純合野生型基因型G, 另外有66個(gè)F2的PCR產(chǎn)物可以部分被I酶切, 為雜合基因型G/A(H)(圖5)。由前述結(jié)果可知, F2個(gè)體的基因型與α'亞基表型表現(xiàn)一致。因此, 該dCAPS分子標(biāo)記可用于α'亞基缺失表型的分子輔助鑒定。

圖4 dCAPS分子標(biāo)記開發(fā)

a: 引物GM7S-1分別擴(kuò)增野生型及突變體, PCR產(chǎn)物為150 bp的單一條帶。b: ZH608的擴(kuò)增產(chǎn)物被I酶酶切為2條更小的片段。

a: the single fragment was detected for the amplified PCR product of both the wild type and the mutant by the primer GM7S-1. b: the PCR product of ZH608 was cleaved into two smaller fragments by the restriction enzymeI.

圖5 F2代dCAPs標(biāo)記基因型檢測結(jié)果

P1, P2為親本; G為野生型基因型(父本), A為突變基因型(母本), H為雜合基因型。

P1is the female parent, and P2male parent. G, A, and H represent the wild type, mutant, and heterozygous genotype, respectively.

2.6 α'亞基缺失與11S/7S比值關(guān)系

α'亞基缺失材料中黃608的11S/7S比值為2.52, 顯著高于野生型中品661 (2.04)(= 14.7,< 0.0001)。在中黃608與登科1號雜交組合的F2群體中, 64份α'亞基缺失材料的11S/7S平均值為2.73, 同樣要顯著高于146份α'亞基正常個(gè)體, 后者平均值為1.75 (= 11.76,< 0.0001)(圖6)。可見, 作為7S大豆球蛋白的重要構(gòu)成因子, α'亞基的缺失可以引起7S總量的減少, 進(jìn)而改變11S/7S比值。

3 討論

7S球蛋白α'亞基的缺失可以提高豆腐的凝膠硬度[26], 同時(shí)也能降低致敏性。因此, 篩選α'亞基缺失材料對提高大豆?fàn)I養(yǎng)價(jià)值利用效率和改善其加工性能均十分重要。目前, 國內(nèi)創(chuàng)制的大豆α'亞基缺失材料, 主要是利用國外材料與國內(nèi)品種雜交選育的。例如, 劉珊珊[27]、宋波等[28]利用從日本引進(jìn)的(α'+α)亞基缺失品種“日B”與黑龍江主栽品種東農(nóng)47雜交, 從中篩選出α'缺失、A3缺失和α'+α亞基缺失等多種蛋白亞基變異類型材料。研究發(fā)現(xiàn), 這些亞基缺失材料攜帶了不利基因位點(diǎn), 多表現(xiàn)為萎黃病, 甚至發(fā)生致死, 不利于在大豆育種中進(jìn)一步利用[29]。我國從α'亞基缺失材料變異中篩選的僅有幾例[30-31], 尚不能滿足α'亞基缺失品系選育需要。本研究中的α'亞基缺失材料中黃608是從高產(chǎn)、高油優(yōu)良大豆品種中品661的化學(xué)誘變后代中篩選而來, 表現(xiàn)為α'亞基缺失表型但無黃化致死等不良性狀, 為大豆蛋白品質(zhì)改良提供了寶貴的材料。

圖6 F2群體α'亞基缺失和α'亞基正常材料11S/7S比值分布

目前, 已報(bào)道的α'亞基缺失的等位基因有限。Kim等[32]研究發(fā)現(xiàn), ‘Keburi’ α'亞基缺失表型可能與整個(gè)基因及不完整串聯(lián)重復(fù)序列的12,998 bp刪除相關(guān)。張國敏[33]從2份α'亞基缺失材料中分別克隆基因, 發(fā)現(xiàn)二者cDNA序列的361 bp和529 bp處均發(fā)生小片段缺失, 推測該基因的突變導(dǎo)致了α'亞基缺失。本研究則發(fā)現(xiàn),基因組因第84位堿基發(fā)生了突變, 使編碼氨基酸序列提前終止, 導(dǎo)致中黃608的α'亞基缺失表型。在此基礎(chǔ)上, 我們利用鑒定出的基因的新等位變異位點(diǎn)開發(fā)了分子標(biāo)記。為α'亞基缺失表型的分子標(biāo)記輔助育種提供了新材料和技術(shù)支持。與前人研究結(jié)果類似[34],本研究發(fā)現(xiàn)中黃608因α'亞基缺失, 導(dǎo)致11S/7S比值變大, 并且蛋白質(zhì)含量較野生型表現(xiàn)一定程度增加, 然而, α'亞基缺失對大豆籽?？偟鞍缀康挠绊懸约岸呦嗷リP(guān)系還有待進(jìn)一步研究[35]。

4 結(jié)論

利用α'亞基缺失突變體中黃608構(gòu)建的F2群體, 通過連鎖分析將控制α'亞基合成基因定位在Chr10標(biāo)記SSR10_1489和SSR10_1612之間1.77 Mb的區(qū)間內(nèi)?；虻?4位堿基的突變, 導(dǎo)致編碼氨基酸的提前終止。推測這是α'亞基的缺失的原因。

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Molecular identification of a new soybean germplasm Zhonghuang 608 lacking of 7S globulin alpha' subunit

LI Jun-Ying1,2,**, SUN Ru-Jian2,3,**, LI Zhong-Feng2, WEI Zhong-Yan2, REN Yu-Long2, WANG Jun1,*,and QIU Li-Juan2,*

1College of Agriculture, Yangtze University, Jingzhou 434025, Hubei, China;2Key Laboratory of Crop Germplasm Utilization, Ministry of Agriculture, Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Science, Beijing 100081, China / National Key Facility for Gene Resources and Genetic Improvement, Beijing 100081, China;3Hulun Buir Institution of Agricultural Sciences, Zhalantun 162650, Inner Mongolia, China

The content of alpha' subunit of 7S globulin has an important effect on the nutritional quality and processing characteristics in soybean. In this study, using polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blotting, Zhonghuang 608 (ZH608), an α' subunit deletion mutant, was identified from the Zhongpin 661 (ZP661) EMS mutant library. Zhonghuang 608 was crossed to the soybean variety Dengke 1, and self-pollinated to establish an F2segregating population composed of 210 individuals. Genetic analysis showed that the alpha' subunit deletion trait in ZH608 was controlled by a single recessive nuclear gene. By linkage analysis we mapped the locus between SSR10-1489 and SSR10-1612 on chromosome 10. Coincidentally, in the mapping region() was annotated as an alpha' subunit synthesis-related gene according to the Williams 82 reference genome. Further sequence analysis showed that the mutant had a single base change (G84to A84) in the first exon of, which resulted in the premature termination of the amino acid sequence. Based on the newly discovered SNP mutation, a co-dominant molecular marker was developed, and used to detect the genotypes of those F2individuals. The results indicated that thegenotype cosegregated with the alpha' subunit phenotype in the F2segregating population of Zh608 and Dengke 1. This study not only provides new materials for quality improvement, but also offers technical support for molecular breeding in soybean.

soybean; alpha' sunbunit; mutant; 7S globulin; dCAPS marker

2018-06-02;

2018-10-08;

2018-11-06.

10.3724/SP.J.1006.2019.84078

通信作者(Corresponding authors): 邱麗娟, E-mail: qiulijuan@caas.cn; 王俊, E-mail: wjsoybean_2008@163.com

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

李俊英, E-mail: 13051379117@163.com

本研究由“十三五”國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016YFD0100201)和國家大豆種質(zhì)資源平臺(2016-004)項(xiàng)目資助。

The study was supported by the National Key R&D Program for Crop Breeding (2016YFD0100201) and the National Soybean Germplasm Resources Platform (2016-004).

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.s.20181105.1125.014.html