詹 琦 周 晟 婁麗萍

膽管癌(Cholangiocarcinoma，CCA)是一種相對(duì)罕見的惡性腫瘤，起源于肝內(nèi)、肺門周圍和遠(yuǎn)端膽管樹的上皮細(xì)胞，是一種致命性的癌癥。在過去的30年中，CCA的發(fā)病率和死亡率逐年增加，5年生存率較低[1]。診斷方面，膽管炎發(fā)作、膽道梗阻、肝內(nèi)膽管結(jié)石造成膽管壁的炎癥變化很難在病理上同癌變相鑒別且CCA缺乏特異性的腫瘤標(biāo)志物，致使患者被確診為CCA時(shí)多已進(jìn)展至晚期[2]。目前，70%～80%的CCA患者均無法接受手術(shù)治療，而只能采取放化療的保守治療方法，然而保守治療并不能有效改善CCA患者的生存率[2]。因此，研究人員期望能夠找到一種提高晚期CCA患者總生存期和預(yù)后的有效方法。有文獻(xiàn)表明[3-10]，在CCA潛在的分子治療靶標(biāo)中，表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2)和表皮生長(zhǎng)因子受體3(HER3)存在明顯的表達(dá)異常。然而，CCA患者中EGFR、HER2和HER3的表達(dá)情況與其臨床病理特征的關(guān)系，以及EGFR、HER2和HER3的表達(dá)情況對(duì)總生存期和CCA細(xì)胞增殖的影響目前研究還比較少。為了觀察EGFR、HER2和HER3的生物學(xué)行為，并研究這些分子是否能夠作為分子治療靶標(biāo)，本文對(duì)50例CCA患者癌組織中的EGFR、HER2和HER3的表達(dá)情況進(jìn)行觀察并對(duì)以上分子與CCA患者臨床病理特征之間的關(guān)系及其表達(dá)對(duì)CCA患者總生存期和對(duì)CCA細(xì)胞增殖的影響進(jìn)行分析。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 收集2009年1月—2013年10月我院手術(shù)切除癌的50例CCA患者進(jìn)行研究，其中肝內(nèi)CCA 28例，肝外CCA 22例。所有患者術(shù)后制作病理石蠟標(biāo)本，標(biāo)本經(jīng)常規(guī)HE染色后由至少2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師診斷為CCA，且術(shù)前均未進(jìn)行放療或化療。其中男35例，女15例，年齡40～75歲。病理組織分級(jí)：高分化9例，中分化11例，低分化30例。其中伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者14例。同時(shí)取所有患者新鮮的癌組織和癌旁正常組織，立即投入液氮中保存，用于提取組織mRNA，其余組織送常規(guī)病檢，中性甲醛固定，石蠟包埋。

通過電話隨訪了解患者的生存情況，隨訪時(shí)間從術(shù)后第2～34個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為22個(gè)月?？偵鏁r(shí)間(Overall survival，OS)是從手術(shù)日期到隨訪截止日期，或由于腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移而死亡的日期。本研究經(jīng)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.1.2 CCA細(xì)胞株 CCA細(xì)胞株QBC939購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組化實(shí)驗(yàn) 標(biāo)本經(jīng)常規(guī)HE染色和EGFR、HER2、HER3免疫組織化學(xué)染色?？乖迯?fù)采用高壓修復(fù)法，免疫組化SP法檢測(cè)則參照試劑說明書。

1.2.2 RT-PCR實(shí)驗(yàn)引物 EGFR：上游5′-TTGTTGCAGATCGTGGACAT-3′，下游5′-ACATAACCAGCCACCTCCTG-3′；HER2：上游5′-CATGTCATCGTCCTCCAGCAG-3′，下游5′-TTGACTCTGAATGTCGGCCAA-3′；HER3：上游5′-GGACUCGAGCAACAUUGAUTT-3′。反應(yīng)條件：94℃ 5 min，94℃ 30 s、60℃ 40 s、72℃ 40 s(40個(gè)循環(huán))，72℃ 10 min。在DNA擴(kuò)增儀上擴(kuò)增相應(yīng)的靶基因片段，同時(shí)擴(kuò)增GAPDH片段作為內(nèi)參照。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 細(xì)胞長(zhǎng)至70%融合時(shí)可用于轉(zhuǎn)染。嚴(yán)格按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)染36 h后可用于功能實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 Western blot 等量提取細(xì)胞蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE分離膠和5%濃縮膠分離后，半干轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，以含5% BSA的TBST室溫封閉2 h，加入一抗4℃過夜孵育。第二天用0.1% TBST洗膜3次，每次5 min，加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。0.1% TBST洗膜后，硝酸纖維素膜以Supersignal West Femto HRP敏感化學(xué)發(fā)光底物對(duì)條帶進(jìn)行顯色。Actin作為內(nèi)參對(duì)照。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.2.5 MTT方法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 上述細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔中加入20 μL的MTT溶液，作用4h后吸出上清，加入150 μL的DMSO溶液，低速震蕩10 min后，波長(zhǎng)490 nm 處測(cè)定OD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，EGFR、HER2和HER3的表達(dá)與CCA患者各臨床病理特征之間的關(guān)系比較采用χ2檢驗(yàn)、連續(xù)性校正χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法；RT-PCR和MTT結(jié)果采用方差分析和t檢驗(yàn)，siRNA敲低EGFR、HER2和HER3對(duì)CCA細(xì)胞增殖的影響采用EGFR、HER2和HER3分別與對(duì)照組進(jìn)行t檢驗(yàn)；生存分析采用Kaplan-Meier法，并進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn)。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行多因素分析，分析影響CCA患者總生存期的因素，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGFR、HER2和HER3在CCA組織中的表達(dá)情況

在CCA組織中可檢測(cè)EGFR、HER2和HER3的表達(dá)，EGFR主要在癌細(xì)胞胞質(zhì)和胞膜中表達(dá)，HER2陽(yáng)性顯示為癌細(xì)胞胞膜上連續(xù)棕黃色染色，而HER3主要在胞質(zhì)中出現(xiàn)陽(yáng)性染色。圖1A-C所示為EGFR、HER2和HER3在CCA組織中陽(yáng)性染色。50例CCA組織中EGFR、HER2和HER3表達(dá)陽(yáng)性的分別為13(26.0%)、7(14.0%)和31(62.0%)。而在癌旁組織中未檢測(cè)到EGFR、HER2和HER3的表達(dá)(圖1D-F)。

圖1 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

2.2 EGFR、HER2和HER3在CCA組織中的表達(dá)情況

EGFR、HER2和HER3在CCA組織中的mRNA表達(dá)水平均顯著高于癌旁組織(P<0.001)(圖2)。

圖2 RT-PCR方法檢測(cè)EGFR、HER2和HER3在CCA組織中的表達(dá)

2.3 EGFR、HER2和HER3表達(dá)與CCA臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

HER2的表達(dá)與患者性別、年齡、癌分化程度和臨床分期無關(guān)(P>0.05)，EGFR和HER3表達(dá)與患者性別、年齡和臨床分期無關(guān)，與CCA的分化程度有關(guān)(P<0.05)，EGFR、HER2和HER3表達(dá)在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于無轉(zhuǎn)移組(P<0.05)(表1)。

表1 EGFR、HER2和HER3表達(dá)與CCA臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

2.4 EGFR、HER2和HER3與CCA術(shù)后總生存期之間的關(guān)系

EGFR、HER2和HER3陽(yáng)性者術(shù)后總生存期明顯低于EGFR、HER2和HER3陰性者(P<0.05)(表2，圖3)。

表2 CCA患者總生存期的單因素和多因素Cox回歸分析

圖3 不同EGFR、HER2和HER3表達(dá)CCA患者Kaplan-Meier生存曲線

2.5 siRNA敲低EGFR、HER2和HER3對(duì)CCA細(xì)胞增殖的影響

敲低CCA細(xì)胞株QBC939中EGFR、HER2和HER3表達(dá)后(圖4A)，QBC939細(xì)胞增殖能力的OD值均顯著下降，對(duì)照細(xì)胞OD值為(1.52±0.21)，EGFR siRNA處理后OD值降為(0.39±0.18)(P=0.003)，HER2 siRNA處理后OD值降為(0.56±0.14)(P=0.024)，HER3 siRNA處理后OD值降為(0.42±0.20)(P=0.011)(圖4B)。

圖4 siRNA敲低EGFR、HER2和HER3對(duì)CCA細(xì)胞增殖的影響

3 討論

表皮生長(zhǎng)因子受體(HER)家族成員包括HER1(EGFR/ErbB1)、HER2(NEU/ErbB2)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4)四種類型。這些膜受體均由細(xì)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和具有保守酪氨酸激酶(TK)結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成。ErbB家族受體參與各種病理生理功能，包括細(xì)胞增殖、分化、生存、黏附和遷移等[1]。

表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR，即HER1，廣泛分布于哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞表面，生理?xiàng)l件下的EGFR信號(hào)通路激活對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化等生理過程發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，當(dāng)EGFR與表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal growth factor，EGF)或轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(Transforming growth factor，TGF)結(jié)合以后，可以啟動(dòng)EGFR下游的信號(hào)傳導(dǎo)通路，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖與遷移。EGFR下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路目前已研究的較為清楚，主要通過RAS/RAF/MEK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、PI3K/PDK/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路將外界信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)[11-13]。EGFR在多種癌內(nèi)存在異常表達(dá)和基因突變，如乳腺癌、胃癌、胰腺癌和卵巢癌等[14-17]，EGFR在這些癌組織中的異常表達(dá)與患者的預(yù)后和總生存期密切相關(guān)。

HER2同EGFR均屬于ErbB受體酪氨酸激酶家族。HER2過表達(dá)可導(dǎo)致受體二聚化(自體或異體的)。受體二聚化后，ErbBs胞漿段出現(xiàn)自體磷酸化，進(jìn)而向下游傳遞信號(hào)活化ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[18]。同時(shí)，HER2還可阻斷EGFR的內(nèi)化降解，致使EGFR表達(dá)水平升高[19]。因此，HER2過表達(dá)可使下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路過度激活，從而促進(jìn)癌的發(fā)生發(fā)展。

與其他幾種ErbB受體不同的是，HER3不能形成同源二聚體且胞內(nèi)的TK結(jié)構(gòu)域是非活化的，故其催化活性較低。這是由于HER3缺少關(guān)鍵殘基，因而不能催化激活其他激酶，通常被認(rèn)為是其他HER家族成員的信號(hào)傳導(dǎo)底物。雖然HER3的酪氨酸激酶活性比較弱，但亦可與EGFR家族中的其他成員(尤其是與EGFR和HER2)形成異源二聚體，從而導(dǎo)致HER3羧基末端酪氨酸殘基的磷酸化，進(jìn)而激活RAS/RAF/MAPK和PI3K/AKT的信號(hào)傳導(dǎo)通路，目前已有研究證實(shí)在乳腺癌中HER3能夠通過與HER2形成異源二聚體來促進(jìn)HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞增殖[10]。

膽管上皮細(xì)胞排列在肝內(nèi)和肝外膽管中，主要作用是分泌和運(yùn)輸膽汁。在CCA組織中，EGFR、HER2存在著明顯的異常表達(dá)。其中，免疫組化檢測(cè)EGFR蛋白的表達(dá)率為26%，且與患者不良預(yù)后相關(guān)；HER2的表達(dá)量與腫瘤部位相關(guān)[3-10]。然而，目前在CCA中HER3的表達(dá)情況研究較少，CCA中EGFR、HER2和HER3的表達(dá)情況與其患者的臨床病理特征的關(guān)系，以及EGFR、HER2和HER3的表達(dá)情況對(duì)CCA患者總生存期和對(duì)CCA細(xì)胞增殖影響的相關(guān)研究較罕見。本研究通過免疫組化檢測(cè)了50例CCA患者癌組織中EGFR、HER2和HER3的表達(dá)情況，分析了上述分子表達(dá)與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。在細(xì)胞水平上，在CCA QBC939細(xì)胞系驗(yàn)證了EGFR、HER2和HER3的表達(dá)對(duì)CCA細(xì)胞增殖的影響。本研究顯示，CCA腫瘤組織中的EGFR、HER2和HER3蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)水平相較于癌旁組織均顯著升高，說明CCA組織中存在以上分子的過表達(dá)；HER2的蛋白表達(dá)水平僅僅與CCA是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)；而EGFR和HER3不僅與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，還與癌組織的分化程度相關(guān)。生存分析結(jié)果顯示EGFR、HER2和HER3表達(dá)陽(yáng)性的患者總生存期明顯低于陰性表達(dá)患者。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)敲低細(xì)胞株QBC939中EGFR、HER2和HER3表達(dá)后，QBC939細(xì)胞增殖能力顯著降低。

綜上所述，本研究結(jié)果提示CCA組織中上調(diào)表達(dá)的EGFR、HER2和HER3與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，EGFR、HER2和HER3參與CCA惡化的機(jī)制可能是通過促進(jìn)CCA細(xì)胞增殖相關(guān)。然而，關(guān)于EGFR、HER2和HER3在CCA細(xì)胞凋亡和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中的作用及相關(guān)機(jī)制還需進(jìn)一步的深入研究。