李傳海 劉 玉 王延群 陳英劍

ABL2(也稱(chēng)Abl相關(guān)基因，Arg)最初在白血病中被鑒定為致癌基因[1]，是非受體酪氨酸蛋白激酶Abelson家族的一員，其通過(guò)C末端F-肌動(dòng)蛋白和微管結(jié)合序列在細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞生長(zhǎng)、存活、侵襲、黏附和遷移中發(fā)揮著重要作用[2-5]。在多種癌癥中都檢測(cè)到ABL2表達(dá)水平和活性的升高[6-7]，ABL2可以磷酸化cortactin蛋白，從而促進(jìn)侵襲性癌細(xì)胞的遷移[8-9]。最新研究表明，ABL2的失活會(huì)抑制非小細(xì)胞肺癌向腦和骨以及其它器官的轉(zhuǎn)移[10]，但是尚未完全闡明其作用機(jī)制。本研究旨在探究ABL2在肺腺癌A549細(xì)胞中的作用，并闡明其在肺癌中發(fā)揮作用的機(jī)制，希望能夠?yàn)榉伟┑姆肿釉\斷及臨床治療提供依據(jù)。

1 治療與方法

1.1 樣本采集

收集2017年1月—2018年8月于解放軍第960醫(yī)院就診的肺癌患者術(shù)后部分新鮮組織樣本共30例，其中男性18例，女性12例，每例患者均獲得肺癌及相應(yīng)的癌旁組織樣本，液氮保存?zhèn)溆?，其?例為小細(xì)胞肺癌，18例為腺癌，11例為鱗癌。本研究取得了患者及其家屬的同意，并簽署了知情同意書(shū)，同時(shí)本研究得到了本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的許可。

1.2 ABL2表達(dá)水平的檢測(cè)

利用收集到的組織樣本提取RNA，具體操作方法按照TRIzolTMReagent的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，提取好的RNA一部分直接利用High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，具體的反應(yīng)體系和操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，逆轉(zhuǎn)錄完成后于-20℃保存，另一部分RNA直接凍存于-80℃?zhèn)溆?，避免反?fù)凍融。利用Pubmed查找基因序列，使用Primer軟件設(shè)計(jì)qRT-PCR的引物，序列如下：ABL2 5′-GTTGAACCCCAGGCACTAAAT-3′；3′-CAACGAAGAGATTAGGGTCACTC-5′，GAPDH5′-ACCATCTTCCAGGAGCGAGAT-3′；3′-ATGACGAACATGGGGGCATC-5′。利用SYBR?Green Master Mix進(jìn)行定量檢測(cè)。每組實(shí)驗(yàn)做3個(gè)復(fù)孔，以GAPDH作為內(nèi)參，利用2-ΔΔct的方法進(jìn)行定量分析。

1.3 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的建立

人類(lèi)肺泡基底上皮細(xì)胞A549胎中血清由本實(shí)驗(yàn)室提供，培養(yǎng)條件為RPMI1640+10% FBS、37℃和5%CO2。按照說(shuō)明書(shū)用敲減ABL2基因的慢病毒感染A549細(xì)胞，感染24 h后換成新鮮的培養(yǎng)基。之后利用G418(4 μg/mL)篩選出穩(wěn)定低表達(dá)ABL2的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞株和轉(zhuǎn)染無(wú)意義干擾序列的對(duì)照組細(xì)胞株。

1.4 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖

利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板分別對(duì)兩組細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，將同樣數(shù)量的細(xì)胞鋪到96孔板中培養(yǎng)12 h。檢測(cè)時(shí)每孔先加入20 μL CCK-8試劑，培養(yǎng)4 h后用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)各孔的吸光光度值。之后的7天每天都進(jìn)行同樣的檢測(cè)，以空白對(duì)照孔為調(diào)零孔繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

1.5 細(xì)胞劃痕和克隆形成實(shí)驗(yàn)

將兩組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種到6孔板中，細(xì)胞密度為5×105個(gè)/孔，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后棄掉培養(yǎng)基，用10 μL的槍頭比著直尺劃痕，PBS清洗3遍，之后加入無(wú)血清的培養(yǎng)基放入孵箱中培養(yǎng)，按0、6、12、24、36、48 h在相同位置用光學(xué)顯微鏡拍照。

將兩組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種到6孔板中，細(xì)胞密度為2×103個(gè)/孔，加入培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，中間換液一次，15天后除去培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定，利用吉姆薩進(jìn)行染色，Image J軟件進(jìn)行克隆計(jì)數(shù)。

1.6 Western blot實(shí)驗(yàn)

提取兩組細(xì)胞的總蛋白，通過(guò)BCA試劑盒測(cè)量蛋白濃度，加入上樣緩沖液后進(jìn)行蛋白變性，利用丙烯酰胺凝膠進(jìn)行蛋白的分離檢測(cè)。每孔上樣量為90 μg，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。一抗孵育過(guò)夜，二抗室溫1 h，之后利用ECL進(jìn)行顯色。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 ABL2在肺癌和相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)情況

通過(guò)Realtime PCR的方法檢測(cè)了肺癌和相應(yīng)癌旁組織樣本中ABL2的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示，肺癌組織中ABL2的mRNA水平高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-4.638，P<0.001)(圖1)。

圖1 ABL2在肺癌組織和相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)情況

2.2 穩(wěn)定低表達(dá)ABL2細(xì)胞株的驗(yàn)證

建立穩(wěn)定低表達(dá)ABL2的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組兩種細(xì)胞株，之后通過(guò)Western blot檢測(cè)ABL2蛋白表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)組中ABL2蛋白表達(dá)明顯下降(t=21.15，P<0.001)，可以進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)(圖2)。

圖2 A549細(xì)胞中沉默ABL2后蛋白表達(dá)情況

2.3 沉默ABL2基因?qū)?xì)胞增殖和遷移能力的影響

為了驗(yàn)證沉默ABL2基因?qū)?xì)胞增殖和遷移能力的影響，分別進(jìn)行了細(xì)胞增殖、劃痕和克隆形成實(shí)驗(yàn)。與對(duì)照組相比較，實(shí)驗(yàn)組從第3天開(kāi)始活細(xì)胞總數(shù)明顯減少(F=7.29，P=0.014)，整體生長(zhǎng)速度降低(圖3A)。48 h后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的遷移距離變短(t=18.525，P<0.001)(圖3B)。15天后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞株形成的平均克隆數(shù)為76.7個(gè)，明顯的少于對(duì)照組的212個(gè)(t=11.206，P<0.01)(圖3C，圖3D)。

圖3 細(xì)胞增殖和遷移能力檢測(cè)

2.4 沉默ABL2基因?qū)MT轉(zhuǎn)化的影響

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)升高(t=11.741，P<0.001)，間質(zhì)細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物N-cadherin(t=13.156，P<0.001)、Vimentin(t=5.814，P=0.004)及Snail蛋白(t=15.228，P<0.001)表達(dá)降低(圖4)。

2.5 沉默ABL2基因?qū)?xì)胞凋亡的影響

為了檢測(cè)沉默ABL2基因?qū)?xì)胞凋亡的影響，本研究采用Western blot技術(shù)檢測(cè)了BAX和Bcl-XL兩個(gè)蛋白的表達(dá)水平，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中Bcl-XL蛋白(t=4.867，P=0.008)表達(dá)下調(diào)，BAX蛋白(t=14.558，P<0.001)表達(dá)上調(diào)(圖5)。

圖4 EMT相關(guān)蛋白的變化情況

圖5 凋亡相關(guān)蛋白的變化情況

2.6 ABL2通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路抑制細(xì)胞凋亡

研究表明許多細(xì)胞信號(hào)通路都可以影響細(xì)胞凋亡，在本實(shí)驗(yàn)中主要檢測(cè)了PI3K/AKT信號(hào)通路主要蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中PI3K P110(t=3.993，P=0.016)、AKT(t=6.626，P=0.003)和p-AKT蛋白(t=3.464，P=0.026)的表達(dá)水平都明顯降低(圖6)。

圖6 PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白的變化情況

3 討論

肺癌是癌癥死亡的最常見(jiàn)原因，非小細(xì)胞肺癌占所有肺癌的大約80%。一線的化療、放療和靶向藥物可以對(duì)肺癌有較好的治療效果，但是晚期肺癌患者的復(fù)發(fā)率極高，患者的5年生存率較低，對(duì)于肺癌的徹底治愈也存在著很大的挑戰(zhàn)。在肺癌治療的過(guò)程中，許多患者都死于毒副反應(yīng)。并且隨著治療的進(jìn)行，腫瘤產(chǎn)生耐藥性，之后的治療效果也變的不明顯。因此開(kāi)發(fā)一種新的治療方法和治療靶點(diǎn)尤為重要。

ABL2蛋白與c-abl癌基因1蛋白高度相似，后者在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中均有表達(dá)，并參與白血病中ETS基因的易位，其主要是22號(hào)染色體bcr和9號(hào)染色體長(zhǎng)臂上的原癌基因abl重新組合成融合基因?qū)е略擃?lèi)疾病的發(fā)生發(fā)展。研究證實(shí)ABL2在多種類(lèi)型的腫瘤中都存在著異常表達(dá)[11]，ABL2基因表達(dá)的增加和異常擴(kuò)增都會(huì)導(dǎo)致實(shí)體瘤中ABL2的激活，從而使ABL2蛋白表達(dá)增加。ABL2在肝細(xì)胞癌中高表達(dá)，與肝細(xì)胞癌的不良預(yù)后呈正相關(guān)，但是與臨床病理參數(shù)之間沒(méi)有顯著的關(guān)系，并可以作為一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素[12]。ABL2可誘導(dǎo)STAT3的磷酸化并增加MMP1蛋白的活性，有趣的是ABL2和STAT3的作用會(huì)促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，但STATS并不干擾單獨(dú)依賴(lài)于ABL2的入侵和轉(zhuǎn)移過(guò)程[13]。越來(lái)越多的研究也證實(shí)ABL2在多種實(shí)體瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中都發(fā)揮著重要的作用。但是ABL2在肺癌中并沒(méi)有詳細(xì)的探究，并且其具體作用機(jī)制也不明確。在本研究中，通過(guò)對(duì)30例肺癌和相應(yīng)癌旁組織的臨床樣本檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中ABL2的表達(dá)水平明顯高于相應(yīng)的癌旁組織。為了進(jìn)一步探究ABL2基因的高表達(dá)在肺癌中發(fā)揮的作用，在肺腺癌A549細(xì)胞系中構(gòu)建了穩(wěn)定低表達(dá)ABL2的細(xì)胞株。細(xì)胞增殖、劃痕和克隆形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢，細(xì)胞遷移距離變短，形成的克隆數(shù)減少。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，EMT的發(fā)生能夠使癌細(xì)胞向周?chē)M織浸潤(rùn)，最終導(dǎo)致癌癥的轉(zhuǎn)移。沉默ABL2基因能抑制EMT過(guò)程的發(fā)生，其主要變化為E-cadherin表達(dá)量上調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin和Snail表達(dá)量降低。PI3K/AKT信號(hào)通路參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和增殖等過(guò)程[14-16]。細(xì)胞的凋亡程度受Bcl-2家族、caspase家族、癌基因C-myc和抑制基因p53的調(diào)控[17-18]。在本研究中，我們主要關(guān)注ABL2與肺癌細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系。結(jié)果證實(shí)，沉默ABL2基因能夠下調(diào)Bcl-XL蛋白表達(dá)，上調(diào)BAX蛋白表達(dá)，同時(shí)還會(huì)抑制PI3K P110、AKT和p-AKT蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

本研究通過(guò)探究ABL2在肺癌中的作用及機(jī)制，希望能夠?yàn)榉伟┑呐R床診斷提供新的思路和解決方案，進(jìn)一步為臨床上肺癌的分子靶向治療提供一個(gè)新的分子靶標(biāo)，為肺癌的早期診斷和治療提供廣泛的應(yīng)用基礎(chǔ)。