黃 梨 龍佑梅 付義霞 夏良斌

卵巢癌是全世界范圍內(nèi)最致命的婦科惡性腫瘤，大多數(shù)晚期卵巢癌患者最終將對(duì)基于鉑類的化療方案產(chǎn)生耐藥，并導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)，因此，靶向療法在卵巢癌治療中的優(yōu)勢(shì)逐漸增加[1]。天然產(chǎn)品與目前批準(zhǔn)的抗癌藥物聯(lián)合使用是有望預(yù)防和治療癌癥有希望的途徑，以天然產(chǎn)品為主的藥物如多酚化合物在各種體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)、臨床前和臨床研究中顯示可靶向惡性腫瘤的多種信號(hào)通路，且具有較少的副作用和毒性，是治療各種癌癥有希望的潛在藥物[2]。

紫檀芪是一種天然植物多酚化合物，廣泛存在于藍(lán)莓、葡萄等漿果中，具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗衰老等多種廣譜功效。紫檀芪為白藜蘆醇的類似物，生物利用度和抗癌作用均優(yōu)于白藜蘆醇，研究表明白藜蘆醇可抑制卵巢癌的糖酵解過(guò)程從而抑制腫瘤生長(zhǎng)[3]，但紫檀芪在卵巢癌糖酵解中的作用尚不清楚。本研究擬觀察紫檀芪對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖、凋亡及糖酵解的影響，為卵巢癌的藥物治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與實(shí)驗(yàn)材料

人卵巢癌SKOV3細(xì)胞由武漢大學(xué)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科贈(zèng)送；紫檀芪購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)有限公司，純度≥98%；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物公司；Annexin-V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自生工生物工程有限公司；葡萄糖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京雷根生物公司；乳酸測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；抗STAT3、p-STAT3一抗購(gòu)自CST公司；抗HK2一抗、山羊抗兔二抗、GAPDH內(nèi)參抗體購(gòu)自Proteintech公司；TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑盒購(gòu)自日本TOYOBO公司。

1.2 CCK-8法檢測(cè)紫檀芪對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的影響

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SKOV3細(xì)胞制成5×103個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，每孔100 μL細(xì)胞懸液接種于96孔板中，過(guò)夜后加入含不同濃度(0、25、50、100、150 μmol/L)紫檀芪的培養(yǎng)液，以0 μmol/L紫檀芪作為對(duì)照組。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24、48、72 h，培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入10 μL CCK-8溶液，作用2 h后于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光光度(A)值，細(xì)胞增殖率(%)=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 AnnexinV/PI檢測(cè)紫檀芪對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡的影響

調(diào)整待檢測(cè)細(xì)胞濃度為106個(gè)/mL，取200 μL，1 000 rpm，4℃離心5 min；用1 mL預(yù)冷的PBS潤(rùn)洗兩次，1 000 rpm，4℃離心5 min；將細(xì)胞重懸于100 μL binding buffer，加入2 μL Annexin-V-FITC(20 μg/mL)，輕輕混勻，避光冰上放置15 min；轉(zhuǎn)至流式檢測(cè)管，加入400 μL PBS，每個(gè)樣品臨上機(jī)前加入1 μL PI(50 μg/mL)，2 min后迅速檢測(cè)；同時(shí)以不加Annexin V-FITC及PI的一管作為陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 葡萄糖和乳酸測(cè)定試劑盒檢測(cè)SKOV3細(xì)胞上清葡萄糖和乳酸濃度

不同濃度紫檀芪處理細(xì)胞48 h后收集上清，分別采用葡萄糖氧化酶法和化學(xué)比色法檢測(cè)培養(yǎng)基中葡萄糖和乳酸濃度，具體操作按照葡萄糖測(cè)定試劑盒和乳酸測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Western blot法檢測(cè)SKOV3細(xì)胞STAT3、p-STAT3、HK2蛋白表達(dá)

收集細(xì)胞，以預(yù)冷的PBS充分洗滌細(xì)胞2次，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，立即從板上刮下細(xì)胞并將提取物轉(zhuǎn)移至微量離心管，置于冰上；超聲處理30 s以完成細(xì)胞裂解并剪切DNA；取20 μL樣品，在95～100℃下加熱5 min，放在冰上冷卻；微量離心機(jī)內(nèi)離心5 min；上樣20 μL到十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠(SDS-PAGE)凝膠(10×10 cm)上，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，將膜置于25 mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1 h，將膜和一抗STAT3(1∶1 000稀釋)、p-STAT3(1∶100稀釋)、HK2(1∶50 000稀釋)置于10 mL的一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過(guò)夜；二抗在室溫下輕輕搖晃孵育1 h；用15 mL TBST洗滌三次，每次5 min；TBST洗膜后與電化學(xué)發(fā)光試劑孵育1 min，在X線膠片下暗室曝光，成像并分析結(jié)果，用目的蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 qRT-PCR法檢測(cè)SKOV3細(xì)胞HK2、GLUT1、PKM2 mRNA表達(dá)

收集各組細(xì)胞，加入Trizol充分裂解，提取總RNA，然后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA；嚴(yán)格按SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑盒說(shuō)明書(shū)，分別以β-actin為內(nèi)參，GLUT1、PKM2為引物，在AB7900HT型定量PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀上進(jìn)行熒光定量PCR，最后結(jié)果以2-△△Ct表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物序列如下：β-actin：5′-TGGACTTCGAGCAAGAGATG-3′，3′-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-5′；GLUT1：5′-CCGCTTCCTGCTCATCAACC-3′，3′-CATCATCTGCCGACTCTCTTCC-5′；PKM2：5′-CTGTGGACTTGCCTGCTGTG-3′，3′-AGATGCCTTGCGGATGAATGAC-5′。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 紫檀芪對(duì)細(xì)胞增殖的影響

CCK-8結(jié)果顯示，紫檀芪對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的抑制作用呈濃度(F=760.87，P<0.001)和時(shí)間(F=969.36，P<0.001)依賴性(圖1)。多重比較結(jié)果顯示，除25、50 μmol/L組作用24 h外，25、50 μmol/L處理48、72 h及100、150 μmol/L紫檀芪處理24、48、72 h后，SKOV3細(xì)胞增殖率均顯著低于各自的陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。相同處理濃度下，紫檀芪作用不同時(shí)間，除150 μmol/L紫檀芪處理48、72 h外，其余各組24、48、72 h之間相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。紫檀芪處理SKOV3細(xì)胞24、48、72 h時(shí)IC50分別為289.50、89.68、64.55 μmol/L。后續(xù)選擇100 μmol/L紫檀芪作為實(shí)驗(yàn)組的處理濃度(圖1)。

圖1 不同濃度紫檀芪對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的影響

2.2 紫檀芪對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡的影響

0、25、50、100 μmol/L紫檀芪處理48 h后，SKOV3細(xì)胞凋亡率分別為(2.22±0.06)%、(3.71±0.39)%、(6.80±0.28)%、(12.78±0.08)%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1 106，P<0.001)；25、50、100 μmol/L組細(xì)胞凋亡率均較對(duì)照組顯著增高(P<0.05)(圖2)。

圖2 不同濃度紫檀芪對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡的影響

2.3 紫檀芪對(duì)SKOV3細(xì)胞葡萄糖消耗和乳酸生成的影響

100 μmol/L紫檀芪作用于SKOV3細(xì)胞24 h后，收集培養(yǎng)基上清，使用葡萄糖氧化酶法和比色法檢測(cè)其中的葡萄糖和乳酸含量，并將相對(duì)葡萄糖攝取和乳酸生成水平按細(xì)胞數(shù)歸一化。結(jié)果顯示，100 μmol/L組葡萄糖消耗量低于0 μmol/L，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。100 μmol/L組的乳酸產(chǎn)生量明顯低于0 μmol/L組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(表1，圖3)。

表1 紫檀芪對(duì)SKOV3細(xì)胞葡萄糖消耗和乳酸生成的影響

圖3 紫檀芪對(duì)SKOV3細(xì)胞葡萄糖消耗和乳酸生成的影響

2.4 紫檀芪對(duì)SKOV3細(xì)胞STAT3、p-STAT3、HK2蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與0 μmol/L組相比，100 μmol/L組可顯著降低p-STAT3蛋白水平(t=10.920，P<0.001)。100 μmol/L組HK2蛋白表達(dá)水平明顯低于0 μmol/L組(t=9.442，P<0.001)(圖4)。

圖4 紫檀芪對(duì)SKOV3細(xì)胞HK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)的影響

2.5 紫檀芪對(duì)SKOV3細(xì)胞GLUT1、PKM2 mRNA表達(dá)的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示，100 μmol/L組GLUT1 mRNA的表達(dá)水平為(0.70±0.01)，明顯低于對(duì)照組(1.00±0.08)(t=6.878，P<0.01)；100 μmol/L組PKM2 mRNA表達(dá)水平為(0.54±0.05)，明顯低于0 μmol/L組(1.00±0.01)(t=15.050，P<0.001)(圖5)。

圖5 紫檀芪對(duì)SKOV3細(xì)胞GLUT1、PKM2 mRNA表達(dá)的影響

3 討論

對(duì)于大多數(shù)晚期卵巢癌患者，耐藥性的產(chǎn)生是治療失敗的主要原因之一，因此，尋找有效的抗癌藥物以降低化療失敗風(fēng)險(xiǎn)并提高卵巢癌患者的生存率非常有必要。近年來(lái)，許多植物化學(xué)物質(zhì)在臨床前和臨床研究中被證明具有良好的抗癌功效，且癌癥治療最新研究發(fā)現(xiàn)，在臨床前研究中，癌癥傳統(tǒng)療法聯(lián)合低劑量天然植物化學(xué)物質(zhì)的抗癌作用具有相加或協(xié)同效應(yīng)，更重要的是，當(dāng)與天然植物化合物聯(lián)合使用時(shí)，化療或放療的毒性降低[4]。

紫檀芪是一種天然芪類化合物，近年研究發(fā)現(xiàn)，其在多種惡性腫瘤中具有抗癌功效。紫檀芪以時(shí)間和劑量依賴性方式抑制乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，而對(duì)正常乳腺癌MCF-10A細(xì)胞沒(méi)有顯著毒性，另外紫檀芪增加兩種乳腺癌細(xì)胞系中的細(xì)胞凋亡，并誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯[5]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌中，紫檀芪可通過(guò)時(shí)間和劑量依賴性增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)，從而降低癌細(xì)胞活力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。Qian等[7]發(fā)現(xiàn)紫檀芪可通過(guò)下調(diào)轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1(MTA1)和組蛋白去乙?；?(HDAC1)復(fù)合物，抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的紫檀芪均對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞具有抑制作用，并且抑制作用隨著紫檀芪作用濃度和時(shí)間的增加而增加。此外，作用濃度越大，對(duì)細(xì)胞凋亡作用越明顯。

即使在有氧條件下，癌細(xì)胞中的糖酵解持續(xù)存在稱為有氧糖酵解或Warburg效應(yīng)，腫瘤中的這種代謝改變已在癌癥中得到廣泛證實(shí)，Warburg效應(yīng)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和耐藥，并認(rèn)為它是晚期惡性腫瘤的“標(biāo)志”[8]。近年來(lái)，糖代謝在癌癥中的重要作用引起了越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注，并為之展開(kāi)了一系列臨床和基礎(chǔ)研究。有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上皮性卵巢癌組織中HK2和GLUT1的表達(dá)水平顯著高于正常卵巢組織[9]。Chao等[10]在卵巢癌組織微陣列上對(duì)PKM2進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果顯示，PKM2表達(dá)較高的患者預(yù)后較差，且無(wú)進(jìn)展生存率較低。Xintaropoulou等[11]在380個(gè)卵巢癌的組織微陣列分析中，通過(guò)定量免疫熒光分析糖酵解酶的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高級(jí)別漿液性卵巢癌(HGSOC)中HK2、GLUT1表達(dá)高于非HGSOC，且GLUT1表達(dá)在晚期(Ⅲ/Ⅳ期)卵巢癌中也顯著高于早期(Ⅰ/Ⅱ期)。GLUT1、HK2、PKM2是幾種關(guān)鍵的糖酵解相關(guān)酶，它們可能在卵巢癌的發(fā)生和進(jìn)展中起重要作用。本研究結(jié)果顯示，紫檀芪可降低卵巢癌SKOV3細(xì)胞葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生量，并且降低HK2、PKM2、GLUT1的表達(dá)。因此，抑制卵巢癌糖酵解途徑可成為卵巢癌治療的新思路。

腫瘤的糖代謝是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，STAT3信號(hào)參與的Warburg效應(yīng)在癌癥發(fā)生和惡性進(jìn)展中起關(guān)鍵作用[12]。在肝細(xì)胞癌中，STAT3可通過(guò)HK2途徑調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞糖酵解，STAT3過(guò)表達(dá)顯著增加了培養(yǎng)液上清葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生，而敲低STAT3則明顯降低了葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生，并下調(diào)糖酵解相關(guān)酶HK2的表達(dá)[13]。另有研究發(fā)現(xiàn)，p-STAT3在卵巢癌患者腹水中高表達(dá)，并在卵巢腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中起作用，抑制STAT3可抑制腫瘤生長(zhǎng)并在體內(nèi)和體外促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]，以上結(jié)果均表明STAT3可能是治療卵巢癌潛在的靶點(diǎn)。此外，多項(xiàng)研究顯示，在卵巢癌中，STAT3和HK2表達(dá)呈正相關(guān)，STAT3可通過(guò)HK2促進(jìn)葡萄糖代謝和刺激糖酵解，而抑制STAT3的表達(dá)同時(shí)伴隨著HK2下調(diào)，糖酵解受到抑制[15-16]，靶向卵巢癌細(xì)胞中的STAT3/HK2途徑可有效抑制Warburg效應(yīng)，減弱糖酵解過(guò)程。本研究結(jié)果顯示，紫檀芪可下調(diào)p-STAT3的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)HK2，進(jìn)而抑制SKOV3細(xì)胞的糖酵解過(guò)程，本研究首次發(fā)現(xiàn)紫檀芪在卵巢癌糖酵解過(guò)程中作用。

綜上所述，紫檀芪可抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并干擾糖酵解過(guò)程，其機(jī)制可能與抑制STAT3/HK2信號(hào)途徑相關(guān)。本研究?jī)H進(jìn)行了體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究，后續(xù)會(huì)進(jìn)一步在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中去探討紫檀芪對(duì)卵巢癌的作用及機(jī)制。本研究為紫檀芪抗腫瘤機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)，為將來(lái)卵巢癌的治療提供新視角。