許曉敬 郭傳濱 禹寶成 唐培培 楊立均 孫會忠

摘 要：以從煙草根際土壤中分離到的具β-甘露聚糖酶活性菌株ZMD13為出發(fā)菌株，對其開展了紫外線誘變選育研究。結(jié)果表明，出發(fā)菌株ZMD13在功率15W，紫外燈距離30cm，照射時間1.5min的誘變條件下的致死率達到75%，確定為適宜劑量;試驗獲得的產(chǎn)β-甘露聚糖酶正突變菌株（編號為ZMD13-2）的最高酶活性達到了32.0U/mL，是出發(fā)菌株ZMD13最高酶活性（6.0U/mL）的5.3倍。突變菌株ZMD13-2可作為煙草土壤保育制劑開發(fā)的備用菌株。

關(guān)鍵詞：煙草;β-甘露聚糖酶;誘變選育

中圖分類號 S-3文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2019）22-00012-03

Ultraviolet Mutagenesis and Breeding of the Strain ZMD13 Producing β-mannanase

Xu Xiaojing1 et al.

（1Zhumadian branch of Henan provincial tobacco company，Zhumadian Henan 463000，China）

Abstract：The strain ZMD13 with beta manganase activity isolated from tobacco rhizosphere soil was used as the starting strain to carry out UV mutagenesis and breeding. The results showed that the mutagenesis rate of ZMD13 strain was 75% under the condition of 15 W power， 30 cm distance of uv lamp and 1.5 min exposure time， and the appropriate dose was determined. The positive mutant strain producing β-mannanase （numbered ZMD13-2） had the highest enzyme activity of 32.0 U/mL， 5.3 times that of the original strain ZMD13 with the highest enzyme activity of 6.0 U/mL. The mutant ZMD13-2 could be used as a reserve strain for tobacco soil conservation preparation.

Key words：Tobacco;β-mannanase;Mutation breeding

甘露聚糖是由β-1，4-D-吡喃甘露糖連接而成的線狀多聚體，是半纖維素的第二大組分，廣泛存在于生物有機體中，尤其是植物細胞壁的核心結(jié)構(gòu)成分[1，2]。β-甘露聚糖酶是水解以β-1，4-D-吡喃甘露糖為主鏈的甘露寡糖、甘露多糖的內(nèi)切水解酶，其在動物、植物和微生物中均有所發(fā)現(xiàn)，自然界中分布較為廣泛，但得到實際應(yīng)用的β- 甘露聚糖酶主要來自微生物[3，4]。因為β-甘露聚糖酶在高分子化合物纖維素的降解過程中起重要作用，所以β-甘露聚糖酶有利于加速土壤中的作物秸稈降解，調(diào)控耕作層土壤的碳素循環(huán)，是土壤保育劑和益生菌制劑開發(fā)重要的靶標物質(zhì)之一[5]。本研究在前期研究中獲得1株具有β-甘露聚糖酶活性菌株，編號為ZMD13，為了進一步提高其開發(fā)應(yīng)用價值，筆者以改土著菌株作為出發(fā)菌株，進行了紫外線誘變選育，以期獲得產(chǎn)酶能力強的菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 出發(fā)菌株ZMD13：分離于煙草根際土壤，保存于駐馬店市煙草公司生產(chǎn)技術(shù)中心實驗室實驗室。魔芋粉鑒別培養(yǎng)基：魔芋精粉5g，硫酸鎂5g，硝酸鈉3g，磷酸鉀1g，硫酸鐵0.01g，瓊脂粉20g，蒸餾水1000mL，自然pH[2]?；罨捅２嘏囵B(yǎng)基：LB斜面培養(yǎng)基[6]。

1.2 出發(fā)菌株的紫外線誘變選育 首先利用LB培養(yǎng)基將出發(fā)菌株ZMD13進行活化培養(yǎng)，收集菌體，并用滅菌生理鹽水水洗3次，在顯微鏡下借助于血球計數(shù)板統(tǒng)計菌體數(shù)，將菌體濃度調(diào)制成108個/mL，然后分別吸取3mL菌懸液，滴加到直徑為90mm滅菌培養(yǎng)皿中，之后再用照功率為15W的紫外燈進行照射，紫外燈與培養(yǎng)皿中菌液之間的距離定為30cm，照射時間設(shè)定0.5、1、1.5、2和2.5min4個梯度。將紫外線照射處理過的菌懸液用生理鹽水進行10倍梯度稀釋，選取10-4、10-5、10-6 3個梯度分別涂布于魔芋粉鑒別培養(yǎng)基，30℃條件下避光恒溫培養(yǎng)48h。設(shè)未照射紫外線的對照處理。

紫外線誘變的致死率計算公式如下[6]：

致死率（%）[對照毫升菌數(shù)-處理后每毫升菌數(shù)對照毫升菌數(shù)]×100

1.3 β-甘露聚糖酶活性評估 初步評估：采用魔芋粉鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)突變株，觀察水解圈的大小。定量評估：DNS法測定菌株發(fā)酵液中的β-甘露聚糖酶活性。操作過程：將魔芋粉調(diào)制成0.5%作為底物，在0.9mL底物中加入0.1mL粗酶液（待測菌株在不加瓊脂的魔芋粉鑒別培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)液），置于55℃的水浴鍋中反應(yīng)10min，之后加入2.0mLDNS試劑，煮沸5min以終止魔芋粉在β-甘露聚糖酶催化下的水解反應(yīng)，快速冷卻后用蒸餾水定容至25mL，用空白液將分光光度計歸零，在波長540nm處測吸光度，設(shè)ZMD13的對照組。酶活力計算：在上述反應(yīng)條件下，用0.5%濃度的魔芋膠作為底物，1min時段內(nèi)釋放1μmol相當于D-甘露糖的還原糖所需的酶量為1個酶活單位（U）[2，7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘變致死率 以誘變的照射時間為橫坐標，菌體致死率為縱坐標繪制致死率曲線（圖1）。由致死率曲線可知，在功率15W、紫外燈距離30cm、照射時間1.5min條件下，致死率達到75%，故確定為出發(fā)菌株ZMD13的誘變試驗劑量。

2.2 誘變效果 在功率15W、紫外燈距離30cm、照射時間1.5min誘導(dǎo)條件下對出發(fā)菌株ZMD13進行誘變，將誘變處理在魔芋粉鑒別培養(yǎng)基上進行37℃恒溫避光培養(yǎng)，48h后染色，依據(jù)水解圈直徑與菌落直徑比值（HC）大小，確定ZMD13的誘變效果，結(jié)果見表1。選取不同平板中正向突變菌落中HC比最大的3株正突變菌株并依次編號為ZMD13-1、ZMD13-2和ZMD13-3，見圖2。為了考察3株菌正向突變遺傳穩(wěn)定性，在魔芋粉鑒別培養(yǎng)基上連續(xù)進行了5次傳代培養(yǎng)，見表2，判斷依據(jù)是HC值的大小。結(jié)果顯示，正突變株ZMD13-1、ZMD13-2和ZMD13-3的β-甘露聚糖酶活性在五代平板培養(yǎng)結(jié)果之間區(qū)別不明顯，方差分析結(jié)果差異未達顯著水平，故ZMD13-1、ZMD13-2和ZMD13-3 3株正突變株產(chǎn)β-甘露聚糖酶活性的遺傳穩(wěn)定性較好。

2.3 3株正突變菌株的產(chǎn)酶能力 以出發(fā)菌株ZMD13作為對照，對誘變效果最好的3個正向突變菌株ZMD13-1、ZMD13-2和ZMD13-3的β-甘露聚糖酶活性進行定量測定（圖3）。結(jié)果顯示，ZMD13-1、ZMD13-2和ZMD13-3 3個突變菌株在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的過程中，β-甘露聚糖酶活性均比對照出發(fā)菌株要高，其中突變株ZMD13-2的β-甘露聚糖酶活性最高，發(fā)酵6h時達到峰值32.0U/mL，是出發(fā)菌株RYXP最高值6.0U/mL的5.3倍。本實驗通過紫外線對出發(fā)菌株ZMD13進行誘變處理，結(jié)果明顯提高了土著菌株RYXP產(chǎn)β-甘露聚糖酶活性，ZMD13-1、ZMD13-2和ZMD13-3等3個突變菌株豐富了備選菌株資源庫，擴大了產(chǎn)酶條件優(yōu)化、功能菌劑開發(fā)等下游研究的選擇空間。

3 討論

土壤中的微生物種類繁多，通過各種技術(shù)手段獲得的土著功能微生物資源的產(chǎn)酶活性往往較低，很多時候功能菌株無法達到或滿足實際開發(fā)應(yīng)用的水平[4，5，8]。為此，積極開展土著微生物資源的誘變選育成了功能菌資源開發(fā)必然選項。在此背景下，本文對煙草根際土壤中獲得的產(chǎn)β-甘露聚糖酶活性菌株ZMD13進行紫外線誘后，獲得ZMD13-1、ZMD13-2和ZMD13-3活性較強的正突變株，通過平板鑒別初評和DNS法定量測定，明確了ZMD13-1、ZMD13-2和ZMD13-3各自的基本產(chǎn)酶活性特征，其中突變株ZMD13-2的最高酶活性達到了32.0U/mL，與出發(fā)菌株相比優(yōu)勢明顯，最具開發(fā)潛力。但菌株的產(chǎn)酶活性受復(fù)雜因素的影響[9]，故本試驗獲得的ZMD13-1、ZMD13-2和ZMD13-3突變株仍需要后期進行大量的復(fù)合誘變、產(chǎn)酶條件優(yōu)化等基礎(chǔ)工作。

參考文獻

[1]楊先芹，孫丹，楊文博，等. 地衣芽孢桿菌 NK-27 菌株β-甘露聚糖酶的產(chǎn)酶條件及粗酶性質(zhì)[J].南開大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2002，35（2）：117-122.

[2]李長影，孔雯，王家昕，等. β-甘露聚糖酶產(chǎn)生菌的分離鑒定和酶學(xué)性質(zhì)[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，30（2）：138-142.

[3]徐揚，劉起麗，聶國興，等.β-甘露聚糖酶的研究進展.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，40（4）：34-37.

[4]張樹飛，鄔敏辰.酸性β-甘露聚糖酶高產(chǎn)菌株的誘變育種[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2008，16（2）：346-350.

[5]羅強，孫啟玲，張興宇，等.β-甘露聚糖酶菌株的復(fù)合誘變選育及發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].四川大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2003，40（1）：44-48.

[6]蔣詠梅.微生物育種學(xué)實驗[M].北京：科學(xué)出版社，2012：205，117-211.

[7]Akino T，Nakamura N，Horikoshi K. Production of β-mannosidase and β-mannanase by an alka1ophilic Bacillus sp[J].Appl Microbiol Biotech，1987，26：323-327.

[8]施巧琴，吳松剛.工業(yè)微生物育種學(xué).北京：科學(xué)出版社，2009，88-90.

[9]曹茜，馮鳳琴.產(chǎn)脂肪酶菌株的常壓室溫等離子體誘變及高通量篩選方法的建立[J].中國糧油學(xué)報，2016，31（2）：52-57.

（責編：張 麗）