李姍姍

摘 要：黑麥?zhǔn)切←湹慕壩锓N，可改良小麥所需的許多目標(biāo)性狀，是豐富小麥遺傳變異、選育優(yōu)良新品種的重要基因資源。該研究利用RAPD技術(shù)評估11個來自不同國家春黑麥品種的遺傳多樣性，為育種者選擇親本提供幫助，且通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步了解黑麥的起源歷史。

關(guān)鍵詞：黑麥;RAPD;遺傳多樣性;遺傳距離

中圖分類號 S512.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2019）22-0008-04

Genetic Diversity of Spring Rye Cultivars Evaluated by RAPD Analysis

Li Shanshan

（Anhui Institute of Quality and Standardization，Hefei 230051，China）

Abstract：Rye is the related species of wheat，it has many of the required target traits of improving wheat. It is the important genetic resources of riching wheat genetic variation and breeding new varieties. In this study，RAPD analysis was used to evaluate the genetic diversity of 11 spring rye varieties from different countries. The result from the current study provide help for breeders in the selection of parents for breeding purpose. And the origin of the rye was also showed in the study.

Key words：Rye;RAPD;Genetic diversity;Genetic distance

1 引言

在東歐和北歐，普通黑麥（Secale cereale L ssp. cereal）是一種重要的作物，由于其對低溫和含有高濃度鋁元素的土壤有著極佳的耐受性，相對于其他溫帶谷物而言，有其自身的優(yōu)勢。在歐洲，黑麥?zhǔn)堑?大重要的谷物，其在作為小麥（Triticum aestivum L.）外來基因源方面發(fā)揮著重要的作用。分子水平上遺傳多樣性，有可能為雜交育種選擇合適的親本提供幫助。為此，本研究調(diào)查了來自歐洲不同國家春黑麥（S.cereale ssp. cereale）品種的遺傳多樣性，旨在了解黑麥在世界上的起源歷史[1-3]，為育種親本選擇提供幫助。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料 采用11個來自波蘭科學(xué)院科學(xué)植物園的春黑麥品種，均生長在溫室里。11個春黑麥品種分別為：（1）Arens Abruzzi–USA、（2）Bojko-Poland、（3）Gator-USA、（4）Gazelle-Canada、（5）Karlshulder-Germany、（6）Petka-Germany、（7）Petkuser Sommer-Germany、（8）Priaborschi-Romania、（9）Profili Spring-USA、（10）Somro Petkus-Germany、（11）Strzekencinskie-Poland。

2.2 實(shí)驗(yàn)試劑 （1）Genomic Mini AX plant cat .no.050-60（來自波蘭A&A生物技術(shù)中心）、（2）無核酸酶的水（來自于Thermo Scientic）、（3）Taq酶++ Master Mix （2x） （來自于Thermo Scientic）、（4）引物（來自O(shè)peron Technologies Inc公司）、5TBE buffer的成分—10.8g Tris base—5.5g Boric acid;—0.744g 0.5MEDTA;—1000mL去離子水。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 基因組DNA的提取 從2個月大的春黑麥品種植株上選取最嫩的葉片，提取DNA，這些春黑麥品種全部生長在溫室中。使用Genomic Mini AX plant cat .no.050-60方法進(jìn)行DNA的抽提。DNA的提取步驟如下：（1）放置大約100mg的幼葉至1.5mL的eppendorf管中，并加入0.9mL的LS裂解懸浮液和20μL的蛋白酶溶液。（2）混合試管中的物質(zhì)，并在50℃下培養(yǎng)30min，不時反向顛倒試管。（3）溫育樣品15s然后在1000～1400轉(zhuǎn)速下旋轉(zhuǎn)5min。（4）在樣品離心過程中，加入0.8mL的K1平衡液平衡色譜柱。（5）樣品離心后，上清轉(zhuǎn)移到1個平衡柱，并允許它由重力流動。（6）添加1.5mL的K2洗滌液洗滌平衡柱，洗滌液由于重力通過整個溶液。（7）重復(fù)洗滌步驟（操作方法同第6步驟）。（8）往平衡柱中添加0.25mL的K3洗滌液，并使洗滌液通過平衡柱。（9）將圓柱轉(zhuǎn)移到1個新的2mL的沉淀管中，并通過添加1mL的K3洗滌液洗脫DNA。（10）加入0.8mL的PM沉淀液到DNA溶液中并將其混合。通過顛倒試管混合整個樣品幾分鐘，然后在12000轉(zhuǎn)速下旋轉(zhuǎn)樣品10min。（11）小心棄去上清液，添加0.5mL的70%的乙醇到沉淀管，混合樣品，并在12000轉(zhuǎn)速下旋轉(zhuǎn)樣品3min。（12）小心棄去上清液，并干燥含DNA的顆粒5min，將試管倒過來干燥。（13）如果有一些酒精小點(diǎn)滴沾在管壁上，用無菌棉簽去除。

2.3.2 RAPD-PCR擴(kuò)增 用12.5μL的樣品進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）[4]。其中表1為每一個RAPD-PCR擴(kuò)增樣品混合物的成分;表2為實(shí)驗(yàn)所用的引物及其序列，所用14個引物是由Operon Technologies Inc.公司測試的;表3為PCR反應(yīng)的熱條件和時間。

2.3.3 瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖凝膠電泳步驟如下：

（1）使用的化學(xué)物品是1500mg的瓊脂糖，100mL稀釋1倍的TBE緩沖液和1μL的EB。首先，用電子天平稱1500mg的瓊脂糖，然后將其放入到一燒杯中，再加入100mL的TBE進(jìn)入燒杯，接著將瓶口封住，最后放到微波爐中將其沸騰（600W電力下運(yùn)行2min）。將燒杯從微波爐中拿出后再放入1μL的EB，然后將燒杯內(nèi)的液體倒入到電泳槽中。

（2）用藍(lán)色試劑進(jìn)行DNA的染色，往所有裝有DNA的eppendorf試管里添加1μL的溴酚藍(lán)，所以最后在每一個試管里都有13.5μL的溶液，然后準(zhǔn)備DNA Ladder，往一個空的eppendorf試管里放入10.5μL的水，再加入2μL的DNA Ladder（O′ RangeRule 100bp DNA Ladder），最后加入1μL的溴酚藍(lán)，混勻。

（3）最后將所有混合物都加到瓊脂糖凝膠孔中進(jìn)行電泳。且在瓊脂糖凝膠中加樣的順序如下：Arens Abruzzi，Bojko，Gator，Gazelle，Karlshulder，Petka，Petkuser Sommer，Priaborshi，Profili Spring，Somro Petkus，Strzencinskie這11個品種的DNA樣品以及DNA Ladder （O′RangeRule100bp DNA Ladder，它有11條帶，大小分別是1500bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp）。接著添加TBE懸浮液進(jìn)入電泳槽中，然后70V電壓下2h。最后在紫外透射燈上觀察并記錄。每1個樣品DNA都會進(jìn)行3～4次的RAPD擴(kuò)增，最后選取擴(kuò)增效果最好的那一次記錄。

2.3.4 數(shù)據(jù)分析 為了計算遺傳相似性（GSab），采用的是Nei和Li（1979）方法。計算公式為：

GSab=2Nab/（Na+Nb）

式中：Nab等位基因數(shù)在對象a和對象b上;

Na等位基因數(shù)在對象a上;

Nb等位基因在對象b上。

基于所計算出的遺傳相似系數(shù)（GSab），依據(jù)非加權(quán)組平均法（UPGMA）對春黑麥品種進(jìn)行聚類，聚類結(jié)果以樹狀圖的形式表達(dá)。

遺傳距離計算公式為：GD=1-GSab

3 結(jié)果與分析

3.1 RAPD擴(kuò)增 在本實(shí)驗(yàn)中，DNA是從11個春黑麥品種提取的。使用14個不同的引物利用PCR儀擴(kuò)增每個品種的DNA，14個引物分別是OPA-04，OPA-09，OPA-07，OPA-12，OPC-18，OPD-16，OPB-10，OPB-17，OPH-13，OPH-20，OPI-12，OPF-04，OPF-08，OPF-12。但是在本實(shí)驗(yàn)中，只發(fā)現(xiàn)OPA-04，OPA-07，OPA-09，OPB-10，OPB-17，OPH-13，OPH-20，OPI-12等8個引物能得出好的結(jié)果，使用這8個引物能得出大量的擴(kuò)增產(chǎn)物，共產(chǎn)生86條擴(kuò)增帶（圖1和圖2）[5-6]。

3.2 遺傳距離 為了得到11個春黑麥品種的遺傳距離，UPGMA聚類圖以1個可視性圖片顯示出了它們之間的遺傳關(guān)系（表4和圖3）。RAPD分析基礎(chǔ)上的聚類分析圖顯示了品種Priaborshi和品種Profili Spring之間的遺傳距離系數(shù)（GDC：Genetic Distance Coefficient）是1-0.769=0.231，表明2個品種之間的遺傳差異較小。品種Gazelle和Petkuser Sommer之間的GDC是1-0.797=0.203，表明2個品種之間的遺傳差異性也很小。品種Arens Abruzzi和Petka之間的GDC是1-0.775=0.225，品種Somro Petkus、Priaborshi、Profili Spring之間的GDC是1-0.73=0.27，品種Karlshulder、Arens Abruzzi、Petka之間的GDC是1-0.732=0.268，品種Gazelle、Petkuser Sommer、Karlshulder、Arens Abruzzr、Petka之間的GDC是1-0.694=0.306，品種Somro Petkus、Priaborshi、Profili Spring、Gazelle、Petkuser Sommer、Karlshuder、Arens Abruzzi和品種Petka之間的GDC是1-0.689=0.321，品種Strzekencinskie–Poland、Somro Petkus、Priaborshi、Profili Spring、Gazelle、Petkuser Sommer、Karlshuder、Arens Abruzzi和品種Petka之間的GDC是1-0.667=0.332，品種Gator、Strzekencinskie–Poland、Somro Petkus、Priaborshi、Profili Spring、Gazelle、Petkuser Sommer、Karlshuder、Arens Abruzzi和品種Petka之間的GDC是1-0.624=0.376，11個春黑麥品種之間的遺傳距離系數(shù)（GDC）是1-0.58=0.42，表明這些品種之間的遺傳差異性不大。品種Priaborshi和品種Profili Spring之間的GDC是1-0.769=0.231，品種Arens Abruzzi和品種Petka之間的GDC是1-0.775=0.225，表明它們之間的親緣很接近。從這些遺傳相似系數(shù)來看，11個春黑麥品種之間的親緣關(guān)系是非常明顯的，而且最近的遺傳距離出現(xiàn)在品種Gazelle和品種Karlshulder之間，該值是0.031，最遠(yuǎn)的遺傳距離出現(xiàn)在品種Bojko和品種Strzekencinskie之間，該值是0.505[7-8]。

依據(jù)公式GD=1-GSab可得到所有品種之間的遺傳距離值。

4 結(jié)論

本研究通過RAPD分析比較來自不同國家不同春黑麥品種的遺傳多樣性，結(jié)果表明：

（1）來自不同國家的11個春黑麥品種間的遺傳距離系數(shù)范圍在0.031～0.505。

（2）最高的遺傳距離系數(shù)是0.505，出現(xiàn)在波蘭黑麥品種Bojko和波蘭黑麥品種Strzekencinskie之間;最低的遺傳距離系數(shù)是0.031，出現(xiàn)在加拿大黑麥品種Gazelle和德國黑麥品種Karlshulder之間。來自羅馬尼亞的黑麥品種Priaborschi和來自美國的黑麥品種Profili Spring之間的遺傳距離系數(shù)（GDC：Genetic distance coeffiecient）是0.231，來自美國的品種Arens Abruzzi和來自德國的品種Petka之間的遺傳距離系數(shù)是0.225，這意味著它們之間的親緣關(guān)系很接近。

（3）通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，RAPD標(biāo)記是評估黑麥遺傳多樣性一個可靠有效的方法。根據(jù)RAPD分子標(biāo)記多態(tài)性，可以估測11個春黑麥品種之間的遺傳關(guān)系。

（4）通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果了解到11個春黑麥品種之間的遺傳多樣性，這些數(shù)據(jù)不僅可以為育種者在選擇親本上提供很大的幫助，還進(jìn)一步了解到黑麥在世界上的起源歷史。

參考文獻(xiàn)

[1]厲榮玉，林毅，蔡永萍.不同基因型小麥及其近緣屬黑麥的RAPD分析[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2007，34（2）：213-217.

[2][2]趙錦，劉孟軍，呂增仁.RAPD技術(shù)在植物遺傳多樣性研究中的應(yīng)用[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2000，23（1）：25-28

[3]張鵬，解玉紅，周東坡.隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)RPAD技術(shù)在遺傳育種中的應(yīng)用[J].生物技術(shù)通報，2003（4）：346-348.

[4]盛艷敏，楊燕平，吳英杰，等.應(yīng)用于PCR技術(shù)的DNA聚合酶[J].長春師范學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版），2008，27（6）：67-70.

[5]Ma R，Mattila Y T，Pulli S. Phylogenetic relationship among genotypes of worldwide collection of spring and winter ryes （Secale Cereale L.） determined by RAPD-PCR markers[J].Hereditas，2004，140：210-221.

[6]Persson K，Diaz O，Bothmer R V. Extent and patterns of RAPD variation in landraces and cultivars of rye （Secale cereale L.） from Northern Europe[J].Hereditas，2001，134：237-243.

[7]Cwlklinska A，Broda Z，Bocianowski J，et al.The usefulness of RAPD and AFLP markers for determining genetic similarity in rye （Secale L.） Species and subspecies[J].Acta biologica cracoviensia Series Botanica，2010，52（1）：19-25.

[8]Fu S L，Tang Z X，Ren Z L，Zhang H Q，Yan B J. Isolation of rye-specific DNA fragment and genetic diversity analysis of rye genus Secale L. using wheatSSR markers[J].Journal of Genetics，2010，89（4）：21-25.

（責(zé)編：張宏民）