高 衎，周 潔，李春剛，唐祁勻

(上海現(xiàn)代制藥海門有限公司，江蘇 南通 226100)

R-氯甘油是一種氯代醇，具有基因毒性示警結(jié)構(gòu)[1](如圖1所示)，是碳鏈中帶有一個(gè)或幾個(gè)氯原子和一個(gè)或幾個(gè)羥基的有機(jī)化合物.R-氯甘油常溫下呈液態(tài)，純品無色，易溶于水，作為化工產(chǎn)品原料和殺菌劑極為廣泛的應(yīng)用于人們的生產(chǎn)和生活中. 2011 年國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)將其歸為 B組可能致癌物[2]. 作為一種基因毒性雜質(zhì)，極低濃度的氯甘油即可損傷脫氧核糖核酸(DNA)[3-4]，嚴(yán)重威脅了患者的生命安全. 近年來，基因毒性雜質(zhì)的研究與控制在藥品質(zhì)量研究領(lǐng)域占據(jù)核心地位. 因此，在一些化合物的加工、生產(chǎn)過程中，R-氯甘油無論作為起始原料亦或是最終產(chǎn)物，其含量的準(zhǔn)確測(cè)定都十分關(guān)鍵.

圖1 R-氯甘油結(jié)構(gòu)圖Fig. 1 Structure of (R )-(-)-3-Chloro-1,2-Propanediol

當(dāng)前，化工企業(yè)對(duì)R-氯甘油的質(zhì)量研究比較簡(jiǎn)單且沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn). 文獻(xiàn)也鮮有報(bào)道相關(guān)的測(cè)定方法. 一些有條件的企業(yè)分別通過離子色譜法和ICP-MS法來測(cè)定氯離子或氯元素的量，從而間接反映R-氯甘油的含量. 不過，這些方法專屬性較差，并且操作復(fù)雜，難以得到推廣. 參考其他氯代醇及類似結(jié)構(gòu)化合物的分析方法，本文擬采用氣相色譜法[5-7]、氣相色譜-質(zhì)譜法[8]對(duì)其進(jìn)行研究. 本文通過對(duì)色譜柱、檢測(cè)器的篩選及色譜參數(shù)的優(yōu)化，建立了定量測(cè)定產(chǎn)品中R-氯甘油含量的氣相色譜法. 該方法經(jīng)濟(jì)、實(shí)用，具有很高的應(yīng)用價(jià)值.

1 儀器與試劑

安捷倫e7890型氣相色譜儀(美國(guó)Angilent公司)；Empower色譜工作站(美國(guó)waters公司)；梅特勒ML240型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；色譜柱Aglient HP-FFAP(30 m×0.53 mm×0.25 μm，美國(guó)Angilent公司).

R-氯甘油標(biāo)準(zhǔn)品(北京百靈威，LP80R12批，純度為99.0%)；化合物A對(duì)照品(自制，HM12-18060601批，純度為99.5%)；甲醇(德國(guó)默克，10951907818批，色譜級(jí))

2 試驗(yàn)部分

2.1 溶液配制

2.1.1 供試品溶液的配制

取化合物A對(duì)照品約250 mg，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲使完全溶解，冷卻，用甲醇定容，搖勻即得.

2.1.2R-氯甘油標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取R-氯甘油標(biāo)準(zhǔn)品約250 mg，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲使完全溶解，冷卻，用甲醇定容，搖勻，作為R-氯甘油標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液. 分別精密移取R-氯甘油標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.6、2.0、2.4、3.0、4.0 mL，置于不同的100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋到刻度，搖勻即得.

2.1.3 回收率溶液的配制

取化合物A對(duì)照品約500 mg，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，平行稱取9份，分別加入R-氯甘油標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.8、1.0、1.2 mL，每個(gè)濃度水平配制3份，用甲醇溶解并稀釋到刻度，搖勻即得.

2.1.4 重復(fù)性溶液的配制

精密量取R-氯甘油標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液5.0 mL,置于250 mL容量瓶中，用甲醇稀釋到刻度，搖勻，作為加標(biāo)稀釋液. 取化合物A對(duì)照品約250 mg，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，用上述加標(biāo)稀釋液溶解并稀釋到刻度，搖勻即得. 平行配制6份.

2.2 色譜條件

色譜柱:以硝基對(duì)苯二酸改性的聚乙二醇為固定液的毛細(xì)管柱,起始溫度為75 ℃，維持3 min，以20 ℃/min的速率升至150 ℃，再以8 ℃/min的速率升至180 ℃，然后以30 ℃/min的速率升至240 ℃，維持12.5 min. 進(jìn)樣口溫度280 ℃，分流比1∶1；檢測(cè)器(FID)溫度為290 ℃；流速為5 mL/min.

2.3 方法驗(yàn)證

2.3.1 專屬性

取配制的供試品溶液、R-氯甘油標(biāo)準(zhǔn)溶液及空白溶劑甲醇各2 μL，分別注入氣相色譜儀，記錄色譜圖.

2.3.2 定量限、檢測(cè)限

取配制的R-氯甘油標(biāo)準(zhǔn)溶液，逐步稀釋，使S/N約為10，記錄此時(shí)的濃度為定量限. 繼續(xù)稀釋，使S/N約為3，記錄此時(shí)的濃度為檢測(cè)限.

2.3.3 線性試驗(yàn)

取5種不同濃度的R-氯甘油標(biāo)準(zhǔn)溶液各2 μL，分別注入氣相色譜儀，記錄色譜圖. 按選定的的方法進(jìn)行測(cè)定. 以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制R-氯甘油標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程.

2.3.4 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)

取“R-氯甘油標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL)，連續(xù)進(jìn)樣6次，考察峰面積的RSD.

2.3.5 重復(fù)性

取供試品(HM12-1860601批)適量，以R-氯甘油標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL)作為對(duì)照溶液，按外標(biāo)法計(jì)算，考察R-氯甘油含量的RSD.

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn)

取回收率溶液各2 μL，分別注入氣相色譜儀，記錄色譜圖. 按外標(biāo)法計(jì)算回收率溶液中R-氯甘油的含量.

回收率=(測(cè)得量-本底量)/加入量×100%

(1)

3 試驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 專屬性

試驗(yàn)結(jié)果表明，空白溶劑及供試品均不干擾測(cè)定，R-氯甘油峰與供試品中其它殘留溶劑峰分離度大于2.0，方法專屬性良好. 試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示.

圖2 R-氯甘油標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig. 2 Standard chromatogram of (R )-(-)-3-Chloro-1,2-Propanediol

3.2 檢測(cè)限、定量限

試驗(yàn)結(jié)果表明，R-氯甘油檢測(cè)限為2.06 ng，定量限為6.58 ng，如表1所列.

表1 定量限與檢測(cè)限結(jié)果Table 1 Results of LOD and LOQ

3.3 線性關(guān)系

試驗(yàn)結(jié)果表明，在80～200 μg/ml范圍內(nèi)，R-氯甘油濃度與峰面積的線性關(guān)系良好，線性方程為y=2.558 8x-62.469，r=0.999 4.

3.4 進(jìn)樣精密度

試驗(yàn)結(jié)果表明，R-氯甘油峰面積的RSD低于1.0%，進(jìn)樣精密度良好，如表2所列.

3.5 重復(fù)性

試驗(yàn)結(jié)果表明，R-氯甘油含量的RSD低于2.0%，方法重復(fù)性良好，如表3所列.

3.6 回收率

試驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度水平的樣品回收率均在98%～102%范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于5.0%，如表4所列. 由表4可見，本方法準(zhǔn)確度良好，滿足定量測(cè)定的要求.

表2 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of injection precision

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of repetitive test

表4 回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.7 討論

R-氯甘油作為一種基因毒性雜質(zhì)，控制限度極低，單一氣相色譜很難達(dá)到要求，往往需要結(jié)合GC-MS進(jìn)行后續(xù)研究. 本文為R-氯甘油的GC-MS測(cè)定方法研究提供了一定的基礎(chǔ)，也能夠幫助企業(yè)初步判斷R-氯甘油的含量，節(jié)省檢驗(yàn)成本. 采用GC-MS測(cè)定時(shí)，由于靈敏度增加，可在本方法基礎(chǔ)上適當(dāng)增大分流比，以獲得更好的重現(xiàn)性. 同時(shí)，氯甘油有R型和S型兩種構(gòu)象，通常情況下，市售多為混合型. 這兩種構(gòu)型的理化性質(zhì)極為相似，因此，本方法對(duì)R-氯甘油異構(gòu)體[9]的測(cè)定也具有較高的參考價(jià)值.

4 結(jié)論

本研究建立了一種測(cè)定化合物中R-氯甘油含量的氣相色譜法，經(jīng)驗(yàn)證，該方法專屬、靈敏、準(zhǔn)確，滿足定量分析的要求.