楊玲玲 何凱 顧華敏

[摘要] 目的 研究CK34βE12、Galectin-3在甲狀腺乳頭狀癌（PTC）中的表達(dá)以及與BRAFV600E基因突變的關(guān)系，評(píng)價(jià)其在甲狀腺乳頭狀癌中的臨床診斷價(jià)值。 方法 收集2017年6月～2018年6月在我院接受治療的230例甲狀腺乳頭狀癌患者的甲狀腺乳頭癌組織及其癌旁組織，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CK34βE12、Galectin-3的表達(dá)情況，AMERS法檢測(cè)BRAFV600E，采用χ2檢驗(yàn)方法分析CK34βE12、Galectin-3蛋白陽(yáng)性率與BRAFV600E基因突變率關(guān)系。 結(jié)果 在PTC組織中，CK34βE12、Galectin-3呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（P<0.01），與患者年齡、性別、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等均無(wú)關(guān)聯(lián)（P>0.05）;BRAFV600E基因在PTC中有84.3%突變;BRAFV600E基因突變率與患者年齡、性別、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等無(wú)關(guān)聯(lián)（P>0.05），與CK34βE12、Galectin-3蛋白表達(dá)無(wú)關(guān)聯(lián)（P>0.05）。 結(jié)論 PTC組織中，CK34βE12、Galectin-3對(duì)鑒別甲狀腺良惡性具有重要臨床意義，但CK34βE12、Galectin-3表達(dá)升高與BRAFV600E基因突變的相互關(guān)系，還需要進(jìn)一步研究。

[關(guān)鍵詞] 甲狀腺乳頭狀癌;CK34βE12;Galectin-3;BRAFV600E

[中圖分類號(hào)] R737.9;R737.25 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-9701（2019）30-0131-04

Study on the diagnostic effect of CK34βE12 and Galectin-3 in PTC and its relationship with BRAFV600E

YANG Lingling HE Kai GU Huamin FAN Guangmin YU Yingzhi CAO Xuequan CHEN Qi LU Hongsheng

Department of Pathology， Taizhou Central Hospital （Taizhou University Hospital） in Zhejiang Province， Taizhou ? 318000， China

[Abstract] Objective To investigate the expression of CK34βE12 and Galectin-3 in papillary thyroid carcinoma （PTC） and its relationship with BRAFV600E gene mutation， so as to evaluate its clinical diagnostic value in papillary thyroid carcinoma. Methods 230 cases of thyroid papillary carcinoma and adjacent tissues who were treated in our hospital from June 2017 to June 2018 were collected. The expression of CK34βE12 and Galectin-3 was detected by immunohistochemistry. The BRAFV600E gene was detected by the AMERS method. The χ2 test method was used to analyze the relationship between the positive rate of CK34βE12 and Galectin-3 protein and the mutation rate of BRAFV600E gene. Results CK34βE12 and Galectin-3 were strongly positively expressed in PTC tissues （P<0.01）， and were not associated with age， sex， and lymph node metastasis（P>0.05）， the BRAFV600E gene showed 84.3% mutations in PTC; the BRAFV600E gene mutation rate was not associated with age， gender， lymph node metastasis （P>0.05）， and was not associated with CK34βE12 and Galectin-3 protein expression（P>0.05）. Conclusion CK34βE12 and Galectin-3 in PTC tissues have important clinical significance in the differential diagnosis of benign and malignant thyroid. However， the relationship between the increased expression of CK34βE12 and Galectin-3 and the mutation of BRAFV600E gene needs further study.

[Key words] Papillary thyroid carcinoma; CK34βE12; Galectin-3; BRAFV600E

甲狀腺癌在我國(guó)以每年20%的速度持續(xù)增長(zhǎng)[1]，甲狀腺乳頭狀癌（Papillary thyroid carcinoma，PTC）是臨床較為常見病變，惡性程度較低，約占甲狀腺癌的85%，但其發(fā)病率多為年輕人群，且近年呈現(xiàn)發(fā)病率上升趨勢(shì)[2-4]。在PTC的疾病發(fā)生發(fā)展中，常有特異性標(biāo)志物的上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，從而輔助診斷，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)PTC關(guān)鍵標(biāo)志物是臨床診斷重要依據(jù)，高分子量細(xì)胞角蛋白CK34βE12、細(xì)胞黏附凝集素Galectin-3在甲狀腺乳頭狀癌中上調(diào)表達(dá)[5-6]。同時(shí)BRAFV600E的基因突變?cè)赑TC中具有普遍性，有研究報(bào)道BRAFV600E突變參與了基因調(diào)控，與疾病的發(fā)生發(fā)展存在調(diào)控作用[7-8]。因此，PTC中特異性標(biāo)志物的表達(dá)水平變化是否與分子水平的BRAFV600E之間存在相關(guān)性值得關(guān)注。本文旨在探討CK34βE12、Galectin-3在PTC檢測(cè)中的作用及其上調(diào)表達(dá)與BRAFV600E突變的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料

選取2017年6月～2018年6月在我院接受手術(shù)治療的PTC患者230例，其中男53例，女177例，年齡26～70歲，平均（48.05±11.01）歲，以上患者臨床資料完整，均經(jīng)手術(shù)及病理確診，術(shù)前未接受其他治療。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

鼠抗CK34βE12、Galectin-3及En VisionTM試劑均購(gòu)自廈門邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。BRAFV600E基因突變檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.3方法

取患者組織石蠟包埋蠟塊，4 μm厚連續(xù)切片，HE染色對(duì)照。免疫組織化學(xué)采用En VisionTM二步染色法，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封固。每批實(shí)驗(yàn)均設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照。按照試劑說(shuō)明書提取石蠟包埋組織DNA，經(jīng)ABI7500熒光定量PCR儀行AMERS法檢測(cè)BRAFV600E基因突變。

1.4評(píng)價(jià)指標(biāo)

免疫組化結(jié)果經(jīng)2位病理醫(yī)師獨(dú)立閱片和診斷，綜合判定結(jié)果。CK34βE12以胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒分布為陽(yáng)性，Galectin-3以胞質(zhì)/胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒分布為陽(yáng)性。分子診斷以樣本的FAM信號(hào)Ct值≥28，為陰性;樣本的FAM信號(hào)Ct值<28，為陽(yáng)性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 CK34βE12、Galectin-3表達(dá)情況

230例PTC標(biāo)本中，CK34βE12在腫瘤組織中陽(yáng)性率95.2%，在癌旁對(duì)照組織中陽(yáng)性率7.8%;Galectin-3在腫瘤組織中陽(yáng)性率98.7%，在癌旁對(duì)照組織中陽(yáng)性率9.6%。兩種標(biāo)記物在PTC與癌旁良性組織中表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表1。CK34βE12、Galectin-3典型陽(yáng)性表達(dá)圖譜見封三圖11～14。

2.2 CK34βE12、Galectin-3在PTC中的表達(dá)及與臨床病理關(guān)系

在與疾病進(jìn)展的關(guān)鍵性指標(biāo)中，年齡、性別、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等，CK34βE12、Galectin-3的表達(dá)均無(wú)關(guān)聯(lián)（P>0.05），見表2。

2.3 BRAFV600E突變與臨床病理關(guān)系

在收集的230例PTC標(biāo)本中，突變例數(shù)194例，突變率84.3%，其與年齡、性別、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等均無(wú)關(guān)聯(lián)（P>0.05），見表3。

2.4 PTC組織中BRAFV600E突變與CK34βE12、Galectin-3表達(dá)的相互關(guān)系

CK34βE12、Galectin-3在BRAFV600E基因突變組的表達(dá)率分別為95.4%（185/194）、98.4%（191/194），在BRAFV600E基因未突變組的表達(dá)率分別為94.4%（34/36）、100%（36/36），BRAFV600E基因是否突變與兩種蛋白的表達(dá)無(wú)關(guān)聯(lián)（P>0.05），見表4。

3討論

甲狀腺癌是較為常見的臨床惡性腫瘤，尤其在女性中高發(fā)，發(fā)病率不但逐年上升，且呈年輕化趨勢(shì)，是當(dāng)前威脅我國(guó)的十大癌癥之一[9]。甲狀腺癌乳頭狀癌是甲狀腺癌中最常見類型，雖然大部分甲狀腺癌乳頭狀癌預(yù)后良好，5年生存率>90%[10]，但這類疾病的高發(fā)趨勢(shì)需要引起重視，臨床治療中也需要快速鑒別診斷。免疫組化依然是當(dāng)前甲狀腺癌乳頭狀癌診斷的主要手段，特異性標(biāo)志物在甲狀腺癌乳頭狀癌診斷發(fā)揮重要作用[11-13]。CK34βE12表達(dá)于鱗狀上皮、導(dǎo)管上皮和其他復(fù)層上皮，能夠在前列腺基底細(xì)胞胞質(zhì)中特異性著色，與p63、PSA、p504S等聯(lián)用在前列腺癌診斷中具有重要作用[14]，但目前發(fā)現(xiàn)CK34βE12特異性表達(dá)于PTC組織中，是鑒定甲狀腺良惡性的有效標(biāo)志物，本研究的230例PTC患者中，CK34βE12陽(yáng)性表達(dá)率95.2%。Galectin-3是一個(gè)同型細(xì)胞黏附凝集素，主要作用和同類細(xì)胞間的黏附有關(guān)，并且作為腫瘤惡化程度的參考指標(biāo)，本研究的230例PTC患者中，Galectin-3陽(yáng)性表達(dá)率98.7%。上述抗體證明是PTC診斷中的特異性標(biāo)記物，且指標(biāo)敏感，便于臨床開展。

分子病理在當(dāng)前病理診斷及臨床用藥指導(dǎo)中發(fā)揮不可替代作用，BRAFV600E是RAF基因家族成員之一，BRAFV600E突變?cè)诩谞钕偃轭^狀癌高發(fā)[15-17]，同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)道BRAFV600E突變?cè)诩谞钕偃轭^狀癌中與RET重排有關(guān)[18]，提示可能與腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展存在關(guān)系，BRAFV600E在PTC中的高發(fā)突變，有助于臨床診斷。在本實(shí)驗(yàn)中，BRAFV600E基因在PTC中有84.3%的突變率，其與免疫組化特異性標(biāo)志物的聯(lián)合檢測(cè)有助于PTC的診斷，同時(shí)其高發(fā)突變可與超聲引導(dǎo)細(xì)針穿刺活檢（Fine needle aspiration biopsy，F(xiàn)NAB）相結(jié)合，對(duì)于術(shù)前難以診斷或不確定標(biāo)本如果發(fā)生BRAFV600E基因突變，即可提示PTC可能，在術(shù)前診斷中發(fā)揮重要作用，因此具有重要的臨床輔助價(jià)值。BRAFV600E突變以何種方式調(diào)控PTC的發(fā)生與進(jìn)展，尚不明確。王海瑩等[19]報(bào)道認(rèn)為BRAFV600E突變與淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移間存在相關(guān)性，但目前的試驗(yàn)并未證實(shí)上述觀點(diǎn)，可能與擴(kuò)大樣本量篩查相關(guān)。Guan X等[20]報(bào)道發(fā)現(xiàn)在BRAFV600E突變組織中，高遷移率族蛋白B1（HMGB1）存在下調(diào)，證實(shí)在MAPK信號(hào)通路中起重要作用。BRAFV600E突變與PTC中過(guò)度表達(dá)或缺失表達(dá)蛋白之間是否存在特定調(diào)控關(guān)系，值得探討。在本實(shí)驗(yàn)中，CK34βE12、Galectin-3均為甲狀腺乳頭狀癌中特定表達(dá)的抗體，但其在蛋白表達(dá)水平與BRAFV600E的突變表達(dá)并無(wú)相關(guān)性，提示需要進(jìn)一步在分子機(jī)制中尋找原因，相關(guān)的機(jī)制需要進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)的研究證實(shí)，CK34βE12、Galectin-3與BRAFV600E突變檢測(cè)聯(lián)用，有助于精確診斷PTC，且便于常規(guī)開展，BRAFV600E可有效與術(shù)前診斷相結(jié)合，在臨床檢測(cè)中具有重要的價(jià)值。

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（收稿日期：2019-04-28）