張超 代文東 王軍 肖華貴 唐容 黃莎 楊克相 饒勇

摘要?為選育抗磺酰脲類除草劑的甘藍(lán)型油菜波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育（polima cytoplasmic male sterility，pol CMS）恢復(fù)系，以pol CMS恢復(fù)系2255C為母本與抗磺酰脲類除草劑油菜M342雜交，使用苯磺隆篩選F2單株及F2∶3株系，結(jié)合F2除草劑抗性單株與pol CMS不育系的測交鑒定，成功篩選到聚合了純合的除草劑抗性基因和pol CMS恢復(fù)基因的株系，經(jīng)多代自交定向選育出抗磺酰脲類除草劑的pol CMS恢復(fù)系18Z82，用18Z82配制的11個(gè)組合中有2個(gè)組合產(chǎn)量顯著高于油研50、有1個(gè)組合產(chǎn)量與油研50基本持平，表明18Z82可以用來配制高產(chǎn)抗草劑pol CMS“三系”組合。

關(guān)鍵詞?甘藍(lán)型油菜;磺酰脲類除草劑;波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)系;苯磺隆

中圖分類號?S?634.3文獻(xiàn)標(biāo)識碼?A

文章編號?0517-6611（2019）23-0030-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.23.011

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Breeding pol CMS Restorer Line 18Z82 with Herbicide Resistant by Tribenuron?methyl

ZHANG Chao，DAI Wen?dong，WANG Jun et al

（Institute of Oil Crops，Guizhou Academy of Agricultural Sciences，Guiyang，Guizhou 550006）

Abstract?In order to breed herbicide?resistant pol CMS restorer line in Brassica napus L.，pol CMS restorer line 2255C was used as the female parent and crossed with sulfonylurea herbicide?resistant line M342.The F2 segregating population and F2：3 families were identified with tribenuron?methyl to obtain the homozygous herbicide?resistant lines，and the herbicide?resistant F2 plants were crossed with pol CMS sterile line to screen homozygous restorer plants，finally the homozygous herbicide?resistant and pol CMS restorer cross progenies were screened out.After multiple generations of self?crossing，sulfonylurea herbicide?resistant recombinant pol CMS restorer line 18Z82 was bred successfully.Yield test showed that the yield of 2 combinations was significantly higher than that of “Youyan 50” and 1 combination was the same as that of “Youyan 50” among the 11 combinations prepared by 18Z82，which indicated that the 18Z82 could be used for preparing high?yield herbicide?resistant pol CMS “three line” hybrid combinations.

Key words?Brassica napus L.;Sulfonylurea herbicides;Polima （pol） cytoplasmic male sterility （CMS） restorer line;Tribenuron?methyl

油菜是我國第一大油料作物，同時(shí)又具有菜用、蜜用、休閑觀光等多重功能[1];近年來，我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展迅速，農(nóng)村勞動(dòng)力缺乏，勞動(dòng)力成本增加，油菜種植效益偏低。因此，減少油菜生產(chǎn)田間管理勞動(dòng)力投入的輕簡化種植方式越來越受歡迎，但粗放的田間管理導(dǎo)致油菜田草害加重，有時(shí)會造成油菜嚴(yán)重減產(chǎn)[2]，油菜田的雜草防治已成為油菜生產(chǎn)面臨的棘手問題之一。采用化學(xué)除草劑可以經(jīng)濟(jì)、高效地防治雜草，但目前我國尚缺乏商業(yè)化的抗除草劑油菜品種;此外，磺酰脲類除草劑具有毒性低、半衰期短、殘留少等優(yōu)點(diǎn)，在防治油菜田中的闊葉類雜草優(yōu)勢明顯[3]。因此，篩選、培育抗磺酰脲類除草劑的油菜品系已是我國當(dāng)前油菜育種的重要目標(biāo)之一[4]。

2010年高建芹等[5]在油菜-大豆輪作田里發(fā)現(xiàn)了抗磺酰脲類除草劑的自然突變油菜資源M9，經(jīng)過除草劑鑒定發(fā)現(xiàn)其具有一定的實(shí)用價(jià)值;胡茂龍等[6]采用EMS誘變也成功創(chuàng)制了多個(gè)磺酰脲類抗除草劑的油菜資源;孫妍妍等[7]、Li等[8]分別在篩選EMS誘變庫和采用苯磺隆化學(xué)殺雄時(shí)發(fā)現(xiàn)了抗磺酰脲類除草劑的油菜種質(zhì)資源，但這些種質(zhì)資源的生產(chǎn)應(yīng)用情況未見深入報(bào)道。采用EMS誘變Hu等[9]獲得了抗磺酰脲類除草劑油菜M342，研究發(fā)現(xiàn)其具有較高的除草劑抗性，且該M342的除草劑抗性源自BnALS3的單基因突變，抗性表現(xiàn)為顯性基因，因此具有較高的實(shí)用價(jià)值。波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育（polima cytoplasmic male sterility，pol CMS）是第一個(gè)有實(shí)用價(jià)值的油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型，在油菜雜交種配制中應(yīng)用廣泛[10]，而選育pol CMS恢復(fù)系是配制pol CMS“三系”品種的關(guān)鍵，研究認(rèn)為油菜的pol CMS恢復(fù)基因是1對顯性基因[11]，可通過雜交來進(jìn)行恢復(fù)基因的轉(zhuǎn)移。鑒于此，筆乾采用pol CMS恢復(fù)系2255C與抗磺酰脲類除草劑種質(zhì)M342進(jìn)行雜交，在F2分離世代采用苯磺隆鑒定抗性單株并按單株與pol CMS不育系測交，結(jié)合測交組合的育性情況及F2∶3株系的除草劑抗性情況，篩選聚合了純合除草劑抗性基因及pol CMS恢復(fù)基因的株系，經(jīng)過多代自交定向選育成穩(wěn)定的抗除草劑pol CMS恢復(fù)系，并與pol CMS不育系配制組合，為選育抗除草劑pol CMS“三系”品種打下基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?供試材料

甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑種質(zhì)M342[9]由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供，2255C為貴州省油料研究所利用從華中農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)的5300C與7005C（黔油15號恢復(fù)系）雜交選育而成的雙低pol CMS恢復(fù)系，pol CMS不育系J068A 、LDX370A、LDX374A、LDX380A、LDX414A、LDX422A、LDX6-18A、LDX82-11A、LDX92-11A、LDX95-58A、常規(guī)03A由貴州省油料研究所李大雄研究員提供，組合比較對照品種油研50（CK）由貴州省油菜研究所張瑞茂研究員提供。

1.2?試驗(yàn)材料田間種植?F2分離群體種植：按2 m寬、10 m長廂面均勻撒播，3～6葉期噴施苯磺隆，噴施14 d后選抗性單株按行長2 m、行距40 cm、株距25 cm移栽。轉(zhuǎn)育后代田間種植：行長2 m、行距40 cm、每行按穴距25 cm小穴點(diǎn)播3～5粒油菜種子，3～6葉期定苗，每穴留苗1株。測恢組合種植：行長2 m、行距40 cm、每行按穴距25 cm小穴點(diǎn)播3～5粒油菜種子，不勻苗，花期調(diào)查育性。pol CMS“三系”組合鑒定試驗(yàn)：設(shè)置5行1小區(qū)，隨機(jī)區(qū)組排列，3次重復(fù)，對照品種為油研50;行長2 m、行距40 cm、每行按穴距25 cm小穴點(diǎn)播3～5粒油菜種子，3～6葉期定苗，每穴留苗1株。

1.3?除草劑抗性鑒定?幼苗3～6葉期，采用苯磺?。ㄓ行С煞?0%，可濕性粉劑）按18 g a.i./hm2的用量噴施，14 d后調(diào)查死亡情況和受抑制情況。

1.4?抗除草劑pol CMS恢復(fù)系18Z82的選育過程

2015年春選2255C做母本，以M342為父本，人工去雄雜交獲得F1雜交種后在貴州省威寧縣加代，收獲自交種后于2015年9月底在貴州省油料研究所貴陽試驗(yàn)地種植形成F2分離群體，于幼苗3～6葉期噴施苯磺隆除草劑，淘汰不抗除草劑單株，2016年春選擇健壯的抗除草劑單株套袋自交，并按單株取花粉與pol CMS不育系測交。2016年5月收獲F2單株自交種及測交組合到威寧進(jìn)行夏繁，F(xiàn)2自交種形成的F2∶3株系苗期采用苯磺隆除草劑鑒定，淘汰不抗株系及有抗/不抗植株分離的株系;測交組合于花期調(diào)查育性，淘汰100%不育及有可育/不育分離的測交組合所對應(yīng)的F2∶3株系，最終選擇100%可育組合所對應(yīng)的抗除草劑F2∶3株系套袋自交。經(jīng)過品質(zhì)分析、夏繁加代、套袋自交至F7代選整齊穩(wěn)定株系18Z82與pol CMS不育系配制組合，2018年9月種植18Z82的F8株系及配制組合，進(jìn)行苗期苯磺隆除草劑抗性鑒定及花期恢復(fù)性鑒定，確定18Z82為新選育的抗磺酰脲類除草劑pol CMS恢復(fù)系。選育流程見圖1。

1.5?農(nóng)藝性狀調(diào)查

成熟期，自交系、組合比較試驗(yàn)各小區(qū)隨機(jī)取10株，采用常規(guī)方法考察株高、一次有效分枝高度、一次有效分枝數(shù)、主花序長、主花序角果數(shù)、單株有效角果數(shù)，每株取一次分枝中部30個(gè)角果計(jì)算每角果粒數(shù)，單株脫粒測量單株籽粒產(chǎn)量并測量千粒重;采用FOSS NIR System近紅外分析儀（美國）進(jìn)行品質(zhì)分析;考種取樣后按小區(qū)收獲并測量小區(qū)產(chǎn)量。

1.6?數(shù)據(jù)處理?用Excel 2013匯總整理數(shù)據(jù)，采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?抗除草劑pol CMS恢復(fù)系18Z82的選育

以2255C為母本、M342為父本配制雜交組合，采用苯磺隆除草劑鑒定發(fā)現(xiàn)M342及F1表現(xiàn)為抗除草劑，而2255C在噴施除草劑后14 d葉片發(fā)紅變黃，逐漸死亡（圖2）。種植F2分離群體于苗期（3～6葉期）噴施除草劑篩選出抗除草劑單株157株，盛花期選抗性單株套袋自交并取花粉與pol CMS不育系測交。種植F2抗性單株自交種形成F2∶3株系，于苗期（3～6葉期）噴施苯磺隆除草劑，14 d后調(diào)查發(fā)現(xiàn)F2∶3株系分3種類型，第1種類型為噴藥后100%抗除草劑;第2種類型為噴藥后葉片發(fā)紅、變黃死亡不抗除草劑;第3種類型為出現(xiàn)抗/不抗除草劑單株分離（圖2），根據(jù)除草劑鑒定情況獲得100%抗苯磺隆除草劑F2∶3株系53個(gè);盛花期調(diào)查抗除草劑的F2單株與pol CMS不育系測交組合的育性情況，發(fā)現(xiàn)157個(gè)測交組合的育性情況也分3種類型，其中全可育組合32個(gè)，全不育組合52個(gè)，有可育/不育分離的組合73個(gè);綜合發(fā)現(xiàn)，32個(gè)全可育組合對應(yīng)的F2∶3株系中有7個(gè)表現(xiàn)為100%抗苯磺隆除草劑，對這7個(gè)株系套袋自交至F7，發(fā)現(xiàn)2018年夏繁編號為18Z82的株系整齊一致，株高、生育期適中，分枝多，株型緊湊，品質(zhì)“雙低”，隨后利用18Z82與貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院貴州省油料研究所選育的pol CMS不育系配制雜交組合，經(jīng)除草劑鑒定及恢復(fù)性鑒定表明18Z82為新選育的抗除草劑pol CMS恢復(fù)系。

2.2?18Z82及親本的農(nóng)藝性狀

成熟期農(nóng)藝性狀調(diào)查結(jié)果見表1。由表1可知，，選育的18Z82分枝高度、含油量、芥酸含量及硫代葡萄糖苷的含量與親本2255C、M342間差異不顯著;18Z82的株高、二次有效分枝數(shù)、主花序長、主花序角果數(shù)及單株角果數(shù)均顯著高于M342而低于2255C;18Z82每角粒數(shù)、千粒重及生育期接近親本2255C，單株產(chǎn)量均顯著低于2個(gè)親本。綜上所述，18Z82的綜合性狀接近2255C與M342的中間類型。

2.3?抗除草劑pol CMS恢復(fù)系18Z82的應(yīng)用

利用新選育的pol CMS恢復(fù)系18Z82與11個(gè)優(yōu)良pol CMS不育系配制組合，苗期采用苯磺隆鑒定發(fā)現(xiàn)對照品種油研50不抗除草劑，配制的11組合均表現(xiàn)較強(qiáng)的除草劑抗性。成熟期考種農(nóng)藝性狀見表2。由表2可知，18Z82與LDX95-58A及LDX6-18A配制的組合小區(qū)產(chǎn)量顯著高于對照品種油研50，18Z82與J068A配制的組合產(chǎn)量與油研50基本持平，而18Z82與其他不育系配制的組合產(chǎn)量都顯著低于對照，表明恢復(fù)系18Z82可以配制高產(chǎn)組合。利用18Z82配制的11個(gè)pol CMS“三系”組合及對照品種的小區(qū)產(chǎn)量與各主要農(nóng)藝性狀的相關(guān)性分析可知，小區(qū)產(chǎn)量與各農(nóng)藝性狀的相關(guān)性由大到小依次為：單株角果數(shù)（r=0.815）>一次分枝數(shù)（r=0.680）>千粒重（r=0.659）>主花序角果數(shù)（r=0.628）>每角粒數(shù)（r=0.618）>主花序長（r=0.598）>二次分枝數(shù)（r=0.582）>株高（r=0.471）>分枝高度（r=0.068）>含油量（r=-0.042）>硫代含量（r=-0.365）>芥酸含量（r=-0.435）。其中，小區(qū)產(chǎn)量與單株角果數(shù)呈極顯著正相關(guān)，小區(qū)產(chǎn)量與一次分枝數(shù)、千粒重、主花序角果數(shù)、每角粒數(shù)、主花序長、二次分枝數(shù)等農(nóng)藝性狀均呈顯著正相關(guān)，與株高、分枝高呈正相關(guān)但未達(dá)到顯著水平，而小區(qū)產(chǎn)量與含油量、芥酸含量及硫代含量呈不顯著的負(fù)相關(guān)。因此，在恢復(fù)系的選育中要著重選育一次分枝數(shù)、千粒重、主花序角果數(shù)、每角粒數(shù)、主花序長、二次分枝數(shù)等農(nóng)藝性狀配合力高的材料。

3?討論

利用除草劑進(jìn)行油菜田的雜草防治可以顯著降低油菜生產(chǎn)成本，減少因雜草造成的產(chǎn)量損失，但目前我國尚缺乏可用于生產(chǎn)的抗除草劑pol CMS “三系”雜交油菜品種，因此，選育抗除草劑pol CMS恢復(fù)系意義重大。M342為單基因控制的顯性磺酰脲類除草劑抗性油菜種質(zhì)，具有較高除草劑抗性[9]，pol CMS恢復(fù)基因同樣也為顯性單基因[11]，采用雜交轉(zhuǎn)育的方法聚合M342中的除草劑抗性基因及pol CMS恢復(fù)系中的恢復(fù)基因在理論上可行，但選育過程工作量較大。因此，該研究對F2分離群體進(jìn)行苯磺隆除草劑處理，淘汰不抗除草劑單株，保留抗性單株，縮小了選育范圍;對F2單株進(jìn)行測恢，可以有針對性的篩選攜帶純合pol CMS恢復(fù)基因的抗性單株;結(jié)合F2∶3株系的除草劑鑒定，可以排除攜帶雜合除草劑抗性基因的株系，最終在F2∶3世代就可以篩選到聚合了純合的除草劑抗性基因、pol CMS恢復(fù)基因的轉(zhuǎn)育材料，從而顯著提高了恢復(fù)系的選育效率。

農(nóng)藝性狀調(diào)查顯示，該研究選育的18Z82的株高、二次有效分枝數(shù)、主花序長、主花序角果數(shù)及單株角果數(shù)等性狀為2個(gè)親本的中間類型，表明18Z82綜合了2個(gè)親本的部分優(yōu)良性狀，但仍有進(jìn)一步改良的空間，可以采用轉(zhuǎn)育后代與優(yōu)良親本回交的策略進(jìn)一步改良親本攜帶的優(yōu)良性狀，例如閆宏山等[12]利用轉(zhuǎn)育后代與親本回交的方法成功選育了抗除草劑的谷子新品種。18Z82的角粒數(shù)接近母本2255C，這可能是因?yàn)橛筒私橇?shù)受母本的影響較大[13]。18Z82與貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院貴州省油料研究所選育的11個(gè)優(yōu)良pol CMS不育系配制的組合中，有2個(gè)組合小區(qū)產(chǎn)量顯著高于油研50，1個(gè)組合與油研50產(chǎn)量差異不顯著，表明可以利用18Z82配制高產(chǎn)組合。配制的組合小區(qū)產(chǎn)量與單株角果數(shù)呈極顯著正相關(guān)，這與楊國浪等[14]的研究結(jié)果一致;此外，該研究發(fā)現(xiàn)組合的小區(qū)產(chǎn)量與一次分枝數(shù)、千粒重、主花序角果數(shù)、每角粒數(shù)、主花序長、二次分枝數(shù)等農(nóng)藝性狀均呈顯著正相關(guān);白桂萍等[15]研究也認(rèn)為油菜高產(chǎn)主要依靠較多的分枝數(shù)和角果數(shù)，同時(shí)兼顧千粒重;塔娜等研究認(rèn)為在油菜高產(chǎn)育種中，首先需要加強(qiáng)單株生物量、千粒重和角果粒數(shù)的選擇，其次是株高、分枝高度、一次有效分枝數(shù)、主花序長度和主花序角果數(shù)等性狀的改良[16]。因此，單株角果數(shù)、一次分枝數(shù)、千粒重、主花序角果數(shù)、每角粒數(shù)、主花序長、二次分枝數(shù)等農(nóng)藝性狀與產(chǎn)量性狀密切相關(guān)，在恢復(fù)系的選育中應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注這些農(nóng)藝性狀的改良。

4?結(jié)論

以pol CMS恢復(fù)系2255C與抗磺酰脲類除草劑種質(zhì)M342配制雜交組合，利用苯磺隆除草劑鑒定F2分離群體及F2∶3株系，同時(shí)結(jié)合F2抗性單株與pol CMS不育系的測交育性鑒定，可以高效、定向選育抗除草劑的pol CMS恢復(fù)系，利用新選育的抗除草劑pol CMS恢復(fù)系18Z82可以配制高產(chǎn)抗草劑pol CMS“三系”組合。

參考文獻(xiàn)

[1] 王漢中.以新需求為導(dǎo)向的油菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略[J].中國油料作物學(xué)報(bào)，2018，40（5）：613-617.

[2] 李揚(yáng)漢.中國雜草志[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998.

[3] 鄒月利，陶波.磺酰脲類除草劑的降解機(jī)制及代謝產(chǎn)物的研究進(jìn)展[J].農(nóng)藥科學(xué)與管理，2011，32（10）：24-31.

[4] 胡茂龍，浦惠明，張潔夫.我國抗ALS類除草劑油菜種質(zhì)創(chuàng)制與研究進(jìn)展[J].中國油料作物學(xué)報(bào)，2018，40（5）：679-686.

[5] 高建芹，浦惠明，戚存扣，等.抗咪唑啉酮油菜種質(zhì)的發(fā)現(xiàn)與鑒定[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2010，11（3）：369-373.

[6] 胡茂龍，浦惠明，龍衛(wèi)華，等.具有除草劑抗性的乙酰乳酸合酶突變蛋白及其應(yīng)用：201710568511.7[P].2017-10-13.

[7] 孫妍妍，曲高平，黃謙心，等.甘藍(lán)型油菜抗苯磺隆突變體ALS基因分析與SNP標(biāo)記[J].中國油料作物學(xué)報(bào)，2015，37（5）：589-595.

[8] LI H T，LI J J，ZHAO B，et al.Generation and characterization of tribenuron?methyl herbicide?resistant rapeseed （Brasscia napus） for hybrid seed production using chemically induced male sterility[J].Theoretical and applied genetics，2015，128（1）：107-118.

[9] HU M L，PU H M，GAO J Q，et al.Inheritance and molecular characterization of resistance to AHAS?inhibiting herbicides in rapeseed[J].Journal of integrative agriculture，2017，16（11）：2421-2433.

[10] FU T D，YANG G S，YANG X N.Studies on “three line” polima cytoplasmic male sterility developed in B.napus L.[J].Plant breeding，1990，104（2）：115-120.

[11] 楊光圣，傅廷棟，馬朝芝，等.油菜波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的篩選與遺傳[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1996，29（4）：17-22.

[12] 閆宏山，劉金榮，王素英，等.利用除草劑快速回交選育抗除草劑谷子新品種[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（11）：34-36.

[13] 楊玉花.甘藍(lán)型油菜每角粒數(shù)遺傳結(jié)構(gòu)和機(jī)制解析[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2016：26-32.

[14] 楊國浪，張小強(qiáng)，徐長虹，等.油菜年河18號經(jīng)濟(jì)性狀與產(chǎn)量的相關(guān)性分析[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，60（2）：186-188，192.

[15] 白桂萍，劉克釗，譚永強(qiáng)，等.油菜高產(chǎn)群體各農(nóng)藝性狀對產(chǎn)量的影響[J].作物雜志，2015，30（6）：33-38.

[16] 塔娜，王灝，陳文杰，等.甘藍(lán)型油菜DH系產(chǎn)量及產(chǎn)量相關(guān)性狀的主成分分析[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，61（10）：35-39.