王 偉 姜洪喆 賈貝貝 鹿 瑤

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院， 北京 100083； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)裝備優(yōu)化設(shè)計(jì)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100083；3.南京林業(yè)大學(xué)機(jī)械電子工程學(xué)院， 南京 210037)

0 引言

雞肉具有低脂肪、高蛋白等特點(diǎn)，是人類膳食營(yíng)養(yǎng)的重要來源。雞肉加工時(shí)僅依賴自身蛋白質(zhì)很難形成完好的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，影響其食用品質(zhì)[1]。大豆蛋白具有良好的吸水性、吸油性、乳化性和凝膠性，適量添加到肉制品中可以改善其色香味等食用品質(zhì)[2]。目前，國(guó)內(nèi)一些不法商家為了掩蓋注水增重等摻假行為，擅自添加大豆蛋白，以增重牟利，卻不在添加劑中注明，這不僅嚴(yán)重侵害了消費(fèi)者權(quán)益，也增添了消費(fèi)者過敏的健康風(fēng)險(xiǎn)[3-4]。一些國(guó)家對(duì)含肉糜食品，如肉餅、香腸、餡餅等中添加非肉蛋白質(zhì)是有嚴(yán)格規(guī)定的。例如，西班牙熟火腿最多允許添加1%的大豆蛋白，美國(guó)對(duì)香腸肉丸等肉制品也明確規(guī)定了可摻入大豆蛋白的百分比等[5]。研究生鮮雞肉糜中摻入大豆蛋白含量的檢測(cè)很有實(shí)際意義，肉糜改變了原有的肌肉形態(tài)特征，增大了鑒別的難度，因此亟待探索無損檢測(cè)技術(shù)的可行性。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)檢測(cè)肉品或肉制品中大豆蛋白含量的方法進(jìn)行了諸多嘗試，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)法、酶聯(lián)免疫(ELISA)、高效液相色譜(HPLC)等。這些方法操作繁瑣且耗時(shí)，可以很好地定性鑒別，但定量預(yù)測(cè)效果并不突出[6-10]。近紅外光譜(NIRS)是近些年發(fā)展起來、可廣泛應(yīng)用于食品檢測(cè)領(lǐng)域的無損檢測(cè)技術(shù)，文獻(xiàn)[11-13]研究了近紅外光譜在原料肉中檢測(cè)大豆蛋白的可行性，檢測(cè)結(jié)果一般。高光譜成像技術(shù)融合了光譜和圖像，可以獲取目標(biāo)樣品內(nèi)部生物化學(xué)信息和外部的物理結(jié)構(gòu)信息[14-17]，彌補(bǔ)了NIRS方法單點(diǎn)檢測(cè)的劣勢(shì)，目前針對(duì)雞肉糜中大豆蛋白含量的檢測(cè)尚未見報(bào)道。

本文采集生鮮雞肉糜中摻入不同種類、不同梯度大豆蛋白樣品的高光譜圖像，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)算法，建立定量預(yù)測(cè)模型，并對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行可視化處理，以探究高光譜成像技術(shù)定量檢測(cè)生鮮雞肉糜中大豆蛋白摻假的可行性。

1 材料與方法

1.1 樣品準(zhǔn)備

生鮮雞胸肉(保存于0～4℃，含水率為70%)采購于北京當(dāng)?shù)氐某校徺I了市場(chǎng)上肉制品中最常用的3種粉狀大豆蛋白產(chǎn)品(圖1)：大豆蛋白粉(Soybean protein flour，SPF)、大豆?jié)饪s蛋白(Soybean protein concentrate，SPC)和大豆分離蛋白(Soybean protein isolates，SPI)，測(cè)量粒度均在125～150 μm之間。SPF(產(chǎn)地河北，食品級(jí)，55%)、SPI(產(chǎn)地山東，食品級(jí)，90%)、SPC(產(chǎn)地河北，食品級(jí)，99%)均購于河北潤(rùn)贏生物科技有限公司。雞胸肉用刀片切成小塊，隨后使用國(guó)產(chǎn)絞肉機(jī)絞碎30 s備用。

圖1 3種大豆蛋白粉末Fig.1 Three kinds of soybean protein powder

將雞肉糜與大豆蛋白分別稱量并充分混合，得到總質(zhì)量為40 g，大豆蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%和100%的樣品。將樣品用叉子依次進(jìn)行攪拌，以得到近似均質(zhì)的混合樣品。每個(gè)梯度下制備8個(gè)重復(fù)樣品分別裝入圓形有蓋培養(yǎng)皿(直徑9 cm，高度1.4 cm)中平鋪，最終每種大豆蛋白摻假樣本均獲得128個(gè)樣品，貼好標(biāo)簽以備后續(xù)高光譜圖像數(shù)據(jù)采集。

1.2 高光譜圖像采集與校正

圖像采集使用的是推掃式線掃描高光譜成像系統(tǒng)，波段為380～1 012 nm，采集模式為漫反射模式。該系統(tǒng)主要由Image-λ-V10-IM型成像光譜儀(芬蘭OULU公司)、Imperx Ltd 型CCD檢測(cè)器(美國(guó)FL公司)、XENOPLAN型可變焦的長(zhǎng)鏡頭(德國(guó)Bad Kreuznach公司)、WN500TA1000H型平移臺(tái)(北京微納光科公司)、一對(duì)Watsonville型500 W鹵鎢燈(美國(guó)CA公司)以及一臺(tái)安裝了高光譜圖像采集軟件的計(jì)算機(jī)組成。光譜分辨率為1.9 nm，像素分辨率為0.14 nm/像素，光源分別以與水平方向呈45°角安裝于光譜儀兩側(cè)，樣品表面與鏡頭表面距離為350 nm，曝光時(shí)間設(shè)定為32 ms，電動(dòng)平移臺(tái)的速度為12 mm/s。由于系統(tǒng)兩端光譜區(qū)域(380～400 nm和1 000～1 012 nm)信噪比較低，因此僅保留400～1 000 nm(285個(gè)波段)光譜范圍內(nèi)的圖像用于數(shù)據(jù)分析。

為了消除CCD相機(jī)暗電流影響，需借助白、黑參考圖像進(jìn)行高光譜圖像的黑白校正。采集特氟龍板的圖像作為白參考，并用鏡頭蓋遮擋相機(jī)鏡頭后采集黑參考圖像。并對(duì)高光譜圖像校正，公式為

(1)

式中Rc——校正后的高光譜圖像

R0——未校正前的采集圖像

D——采集的黑參考圖像

W——采集的白參考圖像

1.3 圖像處理和光譜數(shù)據(jù)提取

由于樣品與背景之間具有較大的光譜差異，因此肉樣部分很容易被識(shí)別出來。對(duì)700 nm波長(zhǎng)(高反射率)下的圖像與405 nm波長(zhǎng)下(低反射率)的圖像進(jìn)行扣減運(yùn)算，在波段運(yùn)算圖像(圖2a)上以0.25作為閾值，提取大于0.25部分作為樣品的感興趣區(qū)域(Region of interest, ROI)，對(duì)每一個(gè)樣品構(gòu)造掩膜，提取其平均光譜的同時(shí)可去除背景、培養(yǎng)皿邊緣像素點(diǎn)(圖2b)。每個(gè)樣品中提取ROI的平均光譜作為該樣品的光譜，最終得到不同摻假梯度雞肉糜樣品的光譜矩陣。

圖2 波段運(yùn)算后圖像與掩膜圖像Fig.2 Band math image and mask image

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

圖3 不同大豆蛋白含量樣品的原始平均光譜曲線Fig.3 Average raw spectra of different soybean protein content samples

2 結(jié)果與分析

2.1 原始光譜分析

圖3為生鮮雞肉糜分別摻雜質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%、6%、10%、20%、30%以及100%的3種大豆蛋白(SPF、SPC和SPI)的原始平均光譜。同時(shí)，為便于比較摻雜比例引起的光譜反射特征及強(qiáng)度變化，在每幅圖中均同時(shí)繪制了純生鮮雞肉糜的原始光譜，以利于直觀比較。

由圖3可見，雞胸肉的反射光譜強(qiáng)度低于3種大豆蛋白粉，具有肌紅蛋白(490 nm和560 nm)以及水(760 nm和980 nm)等對(duì)應(yīng)的特征吸收峰/反射谷。當(dāng)摻雜大豆蛋白含量較少時(shí)，例如蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%、6%和10%(圖1a～1c)摻雜樣本的光譜峰、谷位置和曲線形狀與純生鮮雞肉糜的原始光譜基本一致，表明摻雜量較少時(shí)光譜特征主要體現(xiàn)的是純生鮮雞肉糜。隨著摻入蛋白含量的顯著增加，如圖1d～1f，即分別摻入蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%、30%、100%時(shí)，純生鮮雞肉糜的光譜特征逐漸消失，被3類大豆蛋白的在可見光范圍較為平滑的光譜特征所取代，3種大豆蛋白粉末在400～1 000 nm波段無明顯特征吸收峰，光譜曲線形狀相似，而且隨著摻雜比例的逐漸增加，摻雜樣本的反射率逐漸升高，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%時(shí)，3類蛋白的反射率均高于純雞肉糜，這可能與肉糜中水分逐漸被干蛋白粉吸收有關(guān)。進(jìn)一步研究摻入較高含量3類大豆蛋白的樣本(圖1c～1f)發(fā)現(xiàn)，摻入SPC蛋白與SPI蛋白的肉糜光譜曲線重合度較高，這與兩種蛋白自身物質(zhì)組成相近，即均以高濃度蛋白為主有關(guān)；二者均與摻入SPF的光譜曲線存在較大差異，這可能與SPF蛋白含量低、組成成分相對(duì)復(fù)雜有關(guān)。

因此，通過對(duì)原始光譜比較可以推測(cè)出在雞肉中摻入逐漸加大梯度的大豆蛋白會(huì)造成光譜反射率的逐漸升高以及特征峰的逐漸弱化，這有利于快速準(zhǔn)確定量預(yù)測(cè)雞肉中不同大豆蛋白的摻假含量梯度。

2.2 全光譜定量模型建立

表1 基于原始及預(yù)處理全光譜建立的PLSR模型性能Tab.1 Results of PLSR models based on full raw and preprocessed spectra

2.3 特征波長(zhǎng)選取

進(jìn)一步以優(yōu)選全光譜模型為基礎(chǔ)，應(yīng)用2DCOS(二維相關(guān)光譜)提取特征波長(zhǎng)，摻入3種不同大豆蛋白(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0～30%)樣品的2DCOS同步譜及其對(duì)應(yīng)的三維立體圖如圖4所示。在SPF的2DCOS譜圖中(圖4a)，對(duì)角線上產(chǎn)生了6個(gè)自動(dòng)峰(515、617、661、809、871、980 nm)，這些波長(zhǎng)點(diǎn)處的微小變化在相應(yīng)的功率譜(圖5)上觀測(cè)更明顯，這說明隨著摻入量的增加，這些波段下的反射強(qiáng)度出現(xiàn)了顯著變化，因此推斷這些波長(zhǎng)用來定量分析SPF摻假梯度時(shí)是有效的。這些顯著變化也反演展示出不同摻假梯度下的樣品中顏色變化(515、617、661 nm處)和含水率(980 nm處)有差異[19]。同理，針對(duì)SPC和SPI兩種大豆蛋白，也用此種方法分別選出了5個(gè)波長(zhǎng)(圖4b、4c)，所有選取的特征波長(zhǎng)如表2所示。

圖4 2DCOS同步譜等高線圖與其對(duì)應(yīng)的三維立體圖Fig.4 Wavelengths selection using 2DCOS synchronous contour plots and 3D stereo plots

圖5 功率譜Fig.5 Power spectrum

對(duì)比摻雜的功率譜(圖5)發(fā)現(xiàn)，SPC、SPI的功率譜形狀相近，而SPF與這兩者的功率譜差別較為明顯。其原因在于：3種大豆蛋白內(nèi)部組成不同，大豆蛋白(SPF)為大豆除去油脂后的豆粕直接加工而成，其蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為43%；而大豆?jié)饪s蛋白(SPC)是去除大豆粉中的低聚糖以及水溶性小分子蛋白，將大豆蛋白中的粗蛋白進(jìn)一步濃縮所得到，其蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)70%左右；大豆分離蛋白(SPI)是在大豆?jié)饪s蛋白SPC的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步去除掉大分子粗蛋白后得到，其蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)更是高達(dá)90%左右，因此，相比SPF，SPC和SPI的光譜特征更為接近。其次，SPF功率譜(圖5a)所

表2 特征波長(zhǎng)選擇Tab.2 Summary of key wavelengths selection

呈現(xiàn)的位于可見光范圍的特征波長(zhǎng)515、617、661 nm處相對(duì)峰值較高，是因?yàn)镾PF蛋白為深黃甚至橙色，相比較SPC、SPI兩種蛋白顏色偏深。同樣地，SPF功率譜所呈現(xiàn)的特征波長(zhǎng)809 nm對(duì)應(yīng)RNH2鍵，表征SPF中的糖類。因此，當(dāng)3種蛋白分別摻入生鮮雞肉糜中時(shí)，SPF的功率譜與SPC、SPI明顯不同。

進(jìn)一步分析表2可看出，所有3種大豆蛋白選取特征波長(zhǎng)均包含了980 nm，表明無論何種大豆蛋白摻入梯度越高的情況下含水率會(huì)越低。除此之外， SPF和SPI樣品選取的特征波長(zhǎng)都含871 nm，而SPC和SPI樣品中選取的波長(zhǎng)都含425 nm和572 nm，其他選取出的波長(zhǎng)不相同，這表明不同種類大豆蛋白的摻入對(duì)整個(gè)樣品系統(tǒng)的影響具有一定的相似性，又因成分不同具有一定差異。

2.4 多光譜定量預(yù)測(cè)模型

表3 基于選擇波長(zhǎng)建立的PLSR模型性能Tab.3 Performance of PLSR models developed by selected wavelengths

2.5 檢測(cè)限計(jì)算

圖6 雞肉糜中摻假大豆蛋白SPF、SPC和SPI檢測(cè)的簡(jiǎn)化模型性能Fig.6 Results of simplified models for detection of SPF, SPC and SPI adulteration in minced chicken meat

為進(jìn)一步觀察PLSR多光譜預(yù)測(cè)模型性能，分別繪制了如圖6所示的3種大豆蛋白模型中訓(xùn)練集、交叉驗(yàn)證集和預(yù)測(cè)集帶有誤差棒的預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)與真實(shí)數(shù)據(jù)相關(guān)圖。檢測(cè)限(Limit of detection, LOD)是衡量檢測(cè)方法能力的重要指標(biāo)，為了評(píng)估其靈敏度，本研究中LOD計(jì)算公式[20]為

(2)

式中δ——空白樣本預(yù)測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)偏差

S——訓(xùn)練集擬合曲線的斜率

由訓(xùn)練集和交叉驗(yàn)證集可以看出，二者檢測(cè)誤差相差較小，表明了模型的可靠穩(wěn)定性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證檢測(cè)方法，僅對(duì)未參與建模的獨(dú)立預(yù)測(cè)集LOD進(jìn)行了計(jì)算，得到應(yīng)用該方法預(yù)測(cè)雞肉糜中SPF、SPC和SPI的LOD分別為0.53%、0.58%和1.02%?？梢钥闯鯯PF和SPC的LOD均在1%以下，而SPI的LOD在1%左右，現(xiàn)實(shí)中以盈利為目的進(jìn)行的肉類摻假行為摻假率一般都會(huì)高于10%，因此使用高光譜成像檢測(cè)雞肉糜中大豆蛋白含量是可滿足實(shí)際需求的，尤其對(duì)摻假率在1%以上樣品的定量檢測(cè)效果更佳。

2.6 摻假梯度可視化表征

將SPF、SPC和SPI對(duì)應(yīng)的最優(yōu)簡(jiǎn)化PLSR預(yù)測(cè)模型應(yīng)用到原始多光譜圖像上，針對(duì)每一個(gè)像素點(diǎn)的大豆蛋白摻入含量進(jìn)行定量預(yù)測(cè)，最終拼接成一幅預(yù)測(cè)分布圖。如圖7所示，選擇了10個(gè)摻假梯度(蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)0、2%、4%、6%、8%、10%、15%、20%、25%和30%)進(jìn)行示例展示?？梢暬瘓D中背景用黑色、低梯度用藍(lán)色，而高梯度用紅色表示，可見采用此種線性顏色能夠看到不同大豆蛋白梯度下的整體顏色變化，隨梯度的升高樣品由藍(lán)色向黃紅色轉(zhuǎn)變，可清晰看出是否摻假及其摻假水平。樣品內(nèi)各像素點(diǎn)顏色也有差異預(yù)示著不同點(diǎn)處的摻假情況也有不同，證實(shí)大豆蛋白粉在雞肉糜中分布也是不均勻的。在SPF和SPC的可視化圖中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為零的樣品幾乎全是深藍(lán)色，而SPI中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為零與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的樣品可視化效果接近，說明該方法對(duì)SPF和SPC的定性檢測(cè)以及微量的定量檢測(cè)效果要優(yōu)于SPI，這也與表3中最優(yōu)模型預(yù)測(cè)結(jié)果相一致。通過構(gòu)建大豆蛋白摻假梯度可視化分布圖的方法，可直觀展示與雞肉顏色相近的大豆蛋白粉的摻入狀況，為雞肉糜的品質(zhì)安全檢測(cè)提供了參考。

圖7 雞肉糜中大豆蛋白的可視化分布圖Fig.7 Visualization of soybean proteins distribution in minced chicken meat

3 結(jié)束語