鐵皮石斛多糖不同分級(jí)組分對(duì)小鼠免疫調(diào)節(jié)及腸道健康的影響

張珊珊 童 微 胡婕倫 黃曉君 殷軍藝 聶少平

（南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌 330047）

鐵皮石斛為蘭科石斛屬植物，因其鐵綠色外皮而得名，又名鐵皮蘭、龍頭鳳尾草，主要分布在我國(guó)安徽、福建、浙江、廣西和云南等地[1]。鐵皮石斛是一種名貴的中草藥，常用于治療口干舌燥、目暗不明、胃陰不足、陰虛火旺、筋骨無(wú)力等癥狀，其鮮莖可泡茶、燉湯，亦可直接食用，是一種藥食兩用的植物。因其具有滋陰清熱、美容養(yǎng)顏、延緩衰老、提高免疫力等功效，在民間被稱為 “救命稻草”，且擁有“藥中黃金”的美名[2]。研究表明[3]，鐵皮石斛中化學(xué)成分多種多樣，主要包括多糖、生物堿、氨基酸及其它一些微量元素，其中多糖含量豐富，是最主要的活性物質(zhì)，具有良好的藥效。藥理研究表明，鐵皮石斛多糖具有降血糖、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種功效[4-6]。近年來(lái)，多糖的免疫調(diào)節(jié)與腸道健康功能備受關(guān)注，而關(guān)于多糖不同分級(jí)組分的相關(guān)研究較少。本試驗(yàn)中采用梯度醇沉的方法對(duì)鐵皮石斛多糖進(jìn)行分級(jí)處理，以得到不同分子質(zhì)量的多糖組分，并將鐵皮石斛多糖不同分級(jí)組分作用于環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫低下小鼠模型[7]，探討鐵皮石斛多糖不同分級(jí)組分對(duì)免疫抑制小鼠的免疫調(diào)節(jié)及腸道健康影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵皮石斛干莖購(gòu)自云南金九地生物科技有限公司。

環(huán)磷酰胺（批號(hào)：07112221），江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；IFN-γ、IL-4、IL-6、TNF-α ELISA 試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司；IgE試劑盒，武漢優(yōu)爾生公司；短鏈脂肪酸（乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸、正戊酸和異戊酸）標(biāo)品，Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

3K15高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司；METTLER TOLEDO XS105電子分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；FE-20 pH計(jì)，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；HPSEC-MALLS色譜系統(tǒng)，美國(guó) Wyatt Technology公司；Varioskan Flash全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司；Agilent 6890N氣相色譜系統(tǒng)，Agilent公司。

1.3 動(dòng)物

BALB/c 小鼠，雌性，SPF 級(jí)，體重（20±2）g，采購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)為 SCXK（湘）2011-0003。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 鐵皮石斛多糖的分離、純化與分級(jí) 參考文獻(xiàn)中的多糖提取方法[8]，通過(guò)傳統(tǒng)的水提醇沉法提取鐵皮石斛多糖。取干燥的鐵皮石斛干莖并粉碎到適宜的粒度，加入正己烷后攪拌48 h，再加入95%乙醇溶液攪拌48 h，離心后收集殘?jiān)蚱渲屑尤?0倍質(zhì)量的去離子水，于70℃下提取3 h，離心，收集上清液。將上清液真空濃縮，醇沉，離心，收集沉淀。沉淀加去離子水復(fù)溶后，經(jīng)凍干得到鐵皮石斛粗多糖 （Crude polysaccharides of Dendrobium Officinale，DOC）。再通過(guò) α-淀粉酶酶解、多次凍融離心與透析等方式以達(dá)到純化目的，得到鐵皮石斛精多糖 （Purified polysaccharides of Dendrobium Officinale，DOP）。

采用梯度醇沉法對(duì)鐵皮石斛精多糖進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量的分級(jí)處理。稱取10 g DOP溶于1 L去離子水中，形成1%的多糖溶液，向其中緩慢滴加無(wú)水乙醇并攪拌，形成30%乙醇體積分?jǐn)?shù)的混合物，靜置 12 h，冷凍離心 20 min（4℃，10 000×g），沉淀復(fù)融凍干后得到F30組分。收集離心后的上清液，向其中緩慢滴加無(wú)水乙醇直到乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%，靜置12 h，同樣條件下冷凍離心20 min，沉淀復(fù)融凍干后得到F40組分。同樣，再收集上清液，滴加無(wú)水乙醇直到乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%，沉淀復(fù)融凍干后得到F50組分。最后將離心后收集的上清在60℃下旋蒸，凍干后得到F50S組分。利用高效陰離子交換色譜層析法測(cè)得DOP及分級(jí)組分（F30、F40、F50和 F50S）主要由甘露糖和葡萄糖組成，其組成比例為 5.16∶1，3.67∶1，4.16∶1，5.62∶1和 5.86∶1，利用分子大小排阻色譜法測(cè)得其平均分子質(zhì)量大小分別為262.4，314.5，248.3，202.9和 136.2 ku。

1.4.2 試驗(yàn)動(dòng)物分組與處理 所有小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后隨機(jī)分成8組，每組12只，分別為空白對(duì)照組（正常組）、免疫抑制模型組（模型組）、陽(yáng)性對(duì)照組、DOP組和4個(gè)多糖分級(jí)組。除空白對(duì)照組之外，其余各組小鼠第1，2，3天均腹腔注射環(huán)磷酰胺80 mg/kg，建立免疫抑制小鼠模型。造模后，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃香菇多糖水溶液 （160 mg/kg），各鐵皮石斛多糖組分別灌胃相應(yīng)多糖 （160 mg/kg），連續(xù)灌胃7 d?？瞻讓?duì)照組、模型對(duì)照組給予等體積的生理鹽水，每天觀察并記錄各組小鼠體重的變化。

1.4.3 計(jì)算小鼠胸腺指數(shù) 末次給藥24 h后，稱重，頸椎脫臼處死小鼠并取出胸腺，用0.9%的NaCl溶液清洗后吸去多余NaCl溶液，再次稱重，以胸腺（mg）與體重（g）的比值表示胸腺指數(shù)。

1.4.4 血清細(xì)胞因子與免疫球蛋白含量的測(cè)定末次給藥24 h后，摘除眼球取血，室溫放置2 h，離心并收集血清。參考ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，測(cè)定 IFN-γ、TNF-α、IL-6和 IgE 的含量。

1.4.5 脾臟中細(xì)胞因子含量的測(cè)定 取適量脾臟組織，用磷酸鹽緩沖液制成10%的組織勻漿，離心20 min（4℃，3 000 r/min），收集上清液，保存于-80℃冰箱中備用。參考ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，測(cè)定IL-4、IFN-γ的含量。

1.4.6 小鼠腸道pH值與短鏈脂肪酸（Short-chain fatty acids，SCFA）含量的測(cè)定 取結(jié)腸內(nèi)容物樣品100 mg左右，用1∶7比例的去離子水進(jìn)行稀釋?zhuān)啻伍g歇性渦旋與冰浴超聲后，靜置20 min，離心 20 min（7 800×g），收集上清并過(guò)膜，用于測(cè)定糞便pH值和SCFA含量。SCFA標(biāo)準(zhǔn)品包括乙酸、丙酸、丁酸和戊酸，按本實(shí)驗(yàn)室前期建立的分析方法進(jìn)行氣相色譜分析[9]。

1.4.7 小鼠糞便含水量的測(cè)定 在小鼠處死前收集糞便。將收集到的糞便樣品置于 （105±2）℃烘箱，干燥至恒重，再置于干燥器中冷卻至室溫，稱重。記錄干燥前后的糞便質(zhì)量，差值即為水分含量。每個(gè)樣品測(cè)定3次平行。

1.4.8 統(tǒng)計(jì)分析 所有樣品進(jìn)行3次平行測(cè)定，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用x±S表示，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，并進(jìn)行t檢驗(yàn)，分析各組間顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛多糖不同分級(jí)組分對(duì)小鼠胸腺指數(shù)的影響

胸腺是機(jī)體中重要的免疫器官，是T細(xì)胞分化、成熟的場(chǎng)所，對(duì)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)起著重要作用[10]，胸腺指數(shù)的高低可以在一定程度上體現(xiàn)機(jī)體的非特異性免疫能力。由表1可知，注射了環(huán)磷酰胺的模型組小鼠胸腺指數(shù)大幅下降，顯著低于正常組小鼠，說(shuō)明環(huán)磷酰胺可以抑制小鼠的免疫功能，因此該免疫抑制模型造模成功。相比于模型組，F(xiàn)40和F50的胸腺指數(shù)均無(wú)顯著變化，而其它各組胸腺指數(shù)均大幅增加，表明F40和F50對(duì)改善免疫低下小鼠的免疫功能不明顯，而其它多糖組分則有顯著改善作用；與DOP組分相比，F(xiàn)40、F50和F50S改善免疫功能的作用均較DOP弱，而F30對(duì)改善免疫作用與DOP組分相當(dāng)。

表1 各組小鼠胸腺指數(shù)測(cè)定結(jié)果Table1 Effects of polysaccharides fractions from Dendrobium officinale on thymus index of mice

2.2 鐵皮石斛多糖不同分級(jí)組分對(duì)小鼠血清中IFN-γ、TNF-α、IL-6和 IgE 含量的影響

鐵皮石斛多糖不同分級(jí)組分對(duì)小鼠血清中IFN-γ、TNF-α、IL-6和 IgE含量測(cè)定結(jié)果如表2所示。由表2可知，與模型組相比，DOP、F30、F40、F50和F50S對(duì)TNF-α和IL-6含量均有顯著的促進(jìn)作用，對(duì)于 IFN-γ和 IgE 的分泌，DOP、F40、F50和F50S對(duì)免疫抑制小鼠IFN-γ的分泌具有顯著的促進(jìn)作用，卻對(duì)IgE的分泌有一定的抑制作用。與DOP組分相比，對(duì)于IFN-γ的分泌，F(xiàn)30、F40和F50均較DOP組分弱，而F50S較DOP強(qiáng)且有明顯的促進(jìn)作用；對(duì)于TNF-α的分泌，F(xiàn)30、F40、F50和F50S均無(wú)顯著變化；而對(duì)于IL-6的分泌，F(xiàn)40對(duì)IL-6的分泌作用較DOP明顯降低，F(xiàn)30、F50和F50S與DOP的作用效果相當(dāng)。

Th細(xì)胞是初始的CD4+T細(xì)胞，因功能不同分化為不同亞型，如Th1型和Th2型[11]。其中，Th1型細(xì)胞主要分泌 IL-2、IFN-γ、TNF-α和 TNF-β等細(xì)胞因子，參與細(xì)胞免疫應(yīng)答，抵抗細(xì)菌、病毒感染；Th2 型細(xì)胞主要分泌 IL-4、IL-5、IL-6、IL-9等細(xì)胞因子，刺激B細(xì)胞增殖并產(chǎn)生抗體，參與體液免疫反應(yīng)并發(fā)揮重要作用[12]。為保證機(jī)體正常免疫功能和身體健康，Th1和Th2細(xì)胞通常處于平衡狀態(tài)，若一方遭到破壞將打破平衡并發(fā)生“Th1/Th2平衡漂移”[13-14]。TNF-α和IL-6也是機(jī)體重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，TNF-α是參與免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)的重要成員，在抗腫瘤中也發(fā)揮著重要作用[15]。IL-6主要由巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞和T細(xì)胞分泌，與集落刺激因子共同作用于NK細(xì)胞以增強(qiáng)其裂解功能[16]。IgE主要由Th2型細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子共同產(chǎn)生，在I型超敏反應(yīng)中作為重要抗體發(fā)揮作用，由于Th1/Th2的平衡，Th1型的細(xì)胞因子IFN-γ通常會(huì)抑制其分泌[17]。由于IFN-γ會(huì)抑制IgE的分泌作用，當(dāng)IFN-γ分泌增多時(shí)，IgE的分泌量將減少，與試驗(yàn)結(jié)果相符，除F30外，鐵皮石斛多糖及其不同分級(jí)組分均能抑制IgE的分泌作用，且F30和F40較DOP組分的抑制作用明顯減弱，而其它組分無(wú)明顯差異，F(xiàn)50S與DOP作用效果相當(dāng)。

2.3 鐵皮石斛多糖不同分級(jí)組分對(duì)小鼠脾臟組織中IFN-γ和IL-4含量的影響

由表3可知，與模型組相比，對(duì)于IFN-γ的分泌，DOP、F50和F50S均顯著增加，雖然F30和F40無(wú)顯著變化，但仍呈現(xiàn)增加趨勢(shì)；對(duì)于IL-4的分泌，F(xiàn)40組無(wú)顯著變化，但仍呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而其它多糖組分作用組均顯著降低。與DOP組分相比，其它多糖組分與DOP作用相當(dāng)，并無(wú)顯著性差異。

IFN-γ屬于Th1型細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)Th1細(xì)胞的分化，介導(dǎo)多種免疫應(yīng)答，增強(qiáng)細(xì)胞的毒性作用[18]。IL-4是Th2型細(xì)胞的特征型細(xì)胞因子，能促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞的活化和生長(zhǎng)，還可活化B細(xì)胞，并促使其增值、成熟，從而介導(dǎo)免疫應(yīng)答[19]。此外，Th1與Th2型之間的平衡通常利用IFN-γ與IL-4的比值來(lái)判斷[13]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，鐵皮石斛多糖及其不同分級(jí)組分均能抑制IL-4的分泌并促進(jìn)IFN-γ的分泌，說(shuō)明其能通過(guò)調(diào)節(jié)Th1與Th2型之間的平衡從而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，并使其向Th1型免疫偏移，對(duì)于改善免疫低下小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用有一定的積極作用，這與其它大量研究[20-21]得出的植物多糖促使免疫類(lèi)型向Th1型偏移結(jié)果一致。相對(duì)于DOP組分，其它組分對(duì)于調(diào)節(jié)IFN-γ與IL-4的分泌較弱，即向Th1型免疫偏移的效果較DOP不明顯，但F50、F50S較F30、F40的偏移效果更好。

表2 鐵皮石斛多糖分級(jí)組分對(duì)小鼠血清中IFN-γ、TNF-α、IL-6和IgE的影響Table2 Effects of polysaccharides fractions from Dendrobium officinale on IFN-γ，TNF-α，IL-6 and IgE on serum of mice

表3 鐵皮石斛多糖分級(jí)組分對(duì)小鼠脾臟中IFN-γ和IL-4的影響Table3 Effects of polysaccharides from Dendrobium officinale on IFN-γ and IL-4 on spleen of mice

2.4 鐵皮石斛多糖不同分級(jí)組分對(duì)小鼠糞便含水量的影響

糞便含水量的增加可以提高糞便體積，以形成松弛度適宜的糞便，有利于腸道健康[22]。鐵皮石斛多糖不同分級(jí)組分對(duì)小鼠糞便含水量的影響如圖1所示，與模型組相比，F(xiàn)50組的小鼠糞便含水量無(wú)顯著變化，而其它多糖作用組糞便含水量均顯著增加，表明DOP、F30、F40和F50S組分均能增強(qiáng)糞便的持水力，而F50組分無(wú)明顯作用。與DOP組相比，F(xiàn)50組較DOP組的作用顯著減弱，F(xiàn)30、F40和F50S組與DOP組的作用相當(dāng)。

2.5 鐵皮石斛多糖不同分級(jí)組分對(duì)小鼠結(jié)腸內(nèi)容物pH的影響

鐵皮石斛多糖不同分級(jí)組分對(duì)小鼠結(jié)腸內(nèi)容物pH的影響如圖2所示，與模型組相比，F(xiàn)30組對(duì)小鼠結(jié)腸內(nèi)容物pH無(wú)顯著變化，而其它多糖作用組均表現(xiàn)為顯著降低，表明DOP、F40、F50和F50S組分均能降低小鼠結(jié)腸的pH值，利于小鼠腸道健康，而F30組分無(wú)顯著作用。與DOP組分相比，F(xiàn)30和F40組分降低腸道pH值的作用較SCFA作為結(jié)腸上皮細(xì)胞的主要供能物質(zhì)，能調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞和上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)凋亡，且能抑制結(jié)腸炎與結(jié)腸癌[23]，另外，SCFA還能維持水電解質(zhì)平穩(wěn)，調(diào)節(jié)腸道菌群，改善腸道功能，因此對(duì)腸道健康有積極作用[24]。圖3表示了各組小鼠結(jié)腸DOP組分弱，F(xiàn)50和F50S組分則與DOP組的作用相當(dāng)。

圖1 小鼠糞便含水量差異Fig.1 The differences in water content of mouse feces

圖2 小鼠結(jié)腸內(nèi)容物pH值的差異Fig.2 The differences in pH of mouse colonic feces

2.6 鐵皮石斛多糖不同分級(jí)組分對(duì)小鼠結(jié)腸內(nèi)容物SCFA含量的影響

內(nèi)容物SCFA的含量變化。由圖3可知，模型組小鼠結(jié)腸內(nèi)容物SCFA含量均較正常組顯著降低，而經(jīng)多糖不同分級(jí)組分作用后含量有所變化。對(duì)于總短鏈脂肪酸的濃度水平變化，F(xiàn)30相對(duì)模型組無(wú)顯著變化，但仍呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，而其它多糖分級(jí)組分作用組均顯著增加。相比于模型組，由乙酸、丙酸、丁酸和戊酸濃度水平的變化可知，DOP和F50S組均顯著增加；F30和F40可使丙酸的濃度水平顯著增加，而乙酸、丁酸和戊酸則無(wú)顯著變化；F50可使乙酸和丙酸的濃度水平顯著增加，而丁酸和戊酸無(wú)顯著性變化?？傮w而言，各多糖組分對(duì)于SCFA中乙酸和丙酸的影響較大，而對(duì)于丁酸和戊酸的影響較小。相比于DOP組，F(xiàn)30、F40、F50和F50S組對(duì)促進(jìn)免疫抑制小鼠結(jié)腸內(nèi)乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和總SCFA的產(chǎn)生作用均較DOP組弱，但F50S較其它分級(jí)組分對(duì)SCFA的產(chǎn)生作用更為明顯。

圖3 小鼠結(jié)腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸的含量Fig.3 The content of short chain fatty acids in mouse colonic feces

3 結(jié)論

本研究通過(guò)建立環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫低下小鼠模型，研究發(fā)現(xiàn)小鼠灌胃鐵皮石斛多糖后，各組小鼠胸腺指數(shù)均有所增加，且DOP、F30和F50S組的胸腺指數(shù)相比于模型組顯著增加。通過(guò)比較各分級(jí)組分多糖對(duì)小鼠細(xì)胞因子的分泌作用，發(fā)現(xiàn)各組分均能在一定程度上促進(jìn)或抑制免疫抑制小鼠細(xì)胞因子的分泌，并與DOP的作用效果相當(dāng)或效果更弱，而F50S對(duì)于促進(jìn)IFN-γ的分泌作用較DOP顯著增強(qiáng)。同時(shí)，鐵皮石斛多糖不同分級(jí)組分均能在不同程度上增加糞便含水量，降低糞便pH值，提高SCFA濃度水平，相比于DOP，其它鐵皮石斛多糖分級(jí)組分對(duì)于改善由環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫低下小鼠的腸道健康調(diào)節(jié)作用均較DOP弱，但F50S較其它分級(jí)組分的作用更為明顯。以上研究結(jié)果表明，鐵皮石斛多糖及其分級(jí)組分對(duì)小鼠免疫調(diào)節(jié)和腸道健康均有一定積極作用，不僅能增加免疫器官的質(zhì)量，還能促進(jìn)IFN-γ、TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子的分泌，調(diào)節(jié)Th1與Th2型之間的平衡從而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，并在腸道健康方面發(fā)揮著重要作用。[1]張啟香，方炎明.鐵皮石斛組織培養(yǎng)及試管苗營(yíng)養(yǎng)器官和原球莖的結(jié)構(gòu)觀察[J].西北植物學(xué)報(bào)，2005，25（9）：1761-1765.