李 婷 翁武銀，2*

（1 集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 福建廈門 361021

2 廈門市海洋功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福建廈門 361021）

在正常生理狀態(tài)下機(jī)體都具備抗氧化防御系統(tǒng)，可以維持體內(nèi)自由基的代謝平衡。當(dāng)自由基失去動(dòng)態(tài)平衡后，易造成機(jī)體功能紊亂與病變。雖然BHT、BHA、TBHQ等人工合成抗氧化劑具有良好的抗氧化活性，但它們對(duì)機(jī)體具有潛在毒副作用而受到消費(fèi)者的抵觸[1]。多肽類的天然抗氧化劑不僅可以為機(jī)體提供營(yíng)養(yǎng)，還有助于預(yù)防氧化應(yīng)激和慢性炎癥引起的機(jī)體損傷，作為功能性食品和營(yíng)養(yǎng)品的原料極具潛力[2]。

鮑魚內(nèi)臟富含蛋白和多糖，其提取物和酶解物均有良好的抗氧化活性[3-4]。葉燕軍等[5]也報(bào)道鮑魚內(nèi)臟酶解物經(jīng)不同超濾膜截留后，可獲得不同抗氧化活性成分。通常，蛋白肽的抗氧化活性取決于它的分子質(zhì)量、氨基酸組成和氨基酸序列[6]。由于蛋白肽經(jīng)過(guò)胃、腸道各種酶作用后一級(jí)結(jié)構(gòu)可能會(huì)發(fā)生變化，進(jìn)而影響它的抗氧化活性[7]，因此有必要通過(guò)體內(nèi)抗氧化試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究考察了鮑魚內(nèi)臟蛋白肽（AVP）的理化性質(zhì)及其體外抗氧化活性，探究AVP對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠的抗氧化作用，旨在為鮑魚內(nèi)臟蛋白肽功能性產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮑魚內(nèi)臟蛋白肽（AVP），廈門市百肽生物科技有限公司；還原型谷胱甘肽（GSH），上海捷瑞生物工程有限公司；1，1-二苯基-2-2三硝基苯肼（DPPH），日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社；亞油酸、硫酸亞鐵，美國(guó)Sigma公司；多元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心。4月齡雌性小鼠（20 g±2 g），上海史萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；D-半乳糖，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-8000A紫外分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；Agilent 1200高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司；Optima 7000 DV電感耦合等離子發(fā)射光譜儀（ICP-OES），美國(guó) Agilent公司。

1.3 基本成分的測(cè)定

粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、水分和灰分的含量按照國(guó)標(biāo)法測(cè)定；粗多糖含量采用苯酚硫酸法[8]測(cè)定。

1.4 礦物質(zhì)的測(cè)定

樣品經(jīng)550℃灰化、0.2%HNO3溶解、經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后，礦物質(zhì)含量利用ICP-OES進(jìn)行測(cè)定[9]。各元素含量依據(jù)最適吸收波長(zhǎng)下所得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。

1.5 分子質(zhì)量的測(cè)定

利用凝膠滲透色譜（GPC）[8]測(cè)定分子質(zhì)量分布的情況。色譜柱為TSKgel G2000 SWXLL（300 mm×7.8 mm），流動(dòng)相為乙腈/雙蒸水/TFA（45∶55∶0.1，V/V/V）。在柱溫 30℃、流速 0.5 mL/min、紫外檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm的條件下，以細(xì)胞色素C（12 327 u）、抑肽酶（6 533 u）、氧化型谷胱甘肽（613 u）、Gly-Gly-Gly（189 u）和 Gly（75 u）作為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.6 氨基酸的測(cè)定[10]

樣品利用6 mol/L HCl溶解后，在110℃下水解消化22 h，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除酸后，在利用0.02 mol/L HCl溶解，過(guò)0.22 μm濾膜，利用高效液相色譜儀測(cè)定結(jié)構(gòu)氨基酸組成。另一方面，鮑魚蛋白肽水溶液通過(guò)三氟乙酸和磺基水楊酸除蛋白后，再利用 0.02 mol/L HCl溶解，過(guò)0.22 μm濾膜，利用高效液相色譜儀測(cè)定游離氨基酸。

1.7 體外抗氧化活性的測(cè)定

1.7.1 羥自由基清除能力 參照Gu等[11]報(bào)道的方法并稍作修改。在1 mL樣品中依次加入0.3 mL 8 mmol/L FeSO4、0.25 mL 20 mmol/L H2O2和1 mL 3 mmol/L水楊酸溶液，混勻后在 37℃水浴保溫30 min，經(jīng)流水冷卻后，加入0.45 mL蒸餾水，測(cè)定510 nm下的吸光值，記為As，同樣，以1 mL蒸餾水替代水楊酸作為樣品對(duì)照值，記為A，空白組則以蒸餾水替代樣品，記為A0。根據(jù)以下公式計(jì)算羥自由基清除率：

羥自由基清除率（%）=[1-（As-A）/A0]×100%

1.7.2 DPPH自由基清除能力 根據(jù)Hsu等[12]報(bào)道的方法稍作修改。在2 mL樣品中加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液，于暗處室溫下靜置反應(yīng)30 min，測(cè)定在517 nm下的吸光值，記為As，以2 mL乙醇替代DPPH乙醇溶液作為樣品對(duì)照值，記為A，空白組則以蒸餾水替代樣品，記為A0。根據(jù)以下公式計(jì)算DPPH自由基清除率：

DPPH 自由基清除率（%）=[1-（As-A）/A0]×100%

1.7.3 還原能力 根據(jù)Tsai等[13]報(bào)道的方法稍作修改。在1 mL樣品中依次加入1 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）和1 mL 1%鐵氰化鉀溶液，在50℃水浴下反應(yīng)20 min后，加入1 mL 10%三氯乙酸，離心（4 000 r/min，10 min），在 2 mL 的上清液中依次加入2 mL蒸餾水和0.4 mL 0.1%Fe-Cl3，靜置10 min后，在波長(zhǎng)700 nm下測(cè)定吸光值。

1.7.4 亞油酸氧化抑制活性[14]在0.5 mL樣品中依次加入2.0 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）和2.5 mL 50 mmol/L亞油酸乳化液，混勻放在37℃下避光反應(yīng)9 d。期間每隔24 h用硫氰酸銨法測(cè)定亞油酸的自動(dòng)氧化。也就是，在0.1 mL亞油酸反應(yīng)液中依次加入4.7 mL 75%乙醇溶液、0.1 mL 30%硫酸氰胺溶液和0.1 mL 20 mmol/L FeCl2溶液，混勻后于室溫下靜置3 min，測(cè)在波長(zhǎng)500 nm下測(cè)定吸光值。以蒸餾水替代樣品作為空白，以維生素C替代樣品作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.8 體內(nèi)抗氧化活性的測(cè)定

1.8.1 動(dòng)物的氧化損傷模型及灌胃[15]60只雌性健康小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成6組，每組10只。除正常組外，其余小鼠注射500 mg/（kg·d）D-半乳糖，連續(xù)造模6 w后，正常組（NOR）和模型（MOD）灌服生理鹽水；GSH 對(duì)照組（GSH）和低劑量組 （AVP-L）、中劑量組 （AVP-M） 及高劑量（AVP-H） 分別灌胃 125 mg/（kg·d） GSH和 125 mg/（kg·d）、250 mg/（kg·d）、500 mg/（kg·d） AVP。在給受試樣品的同時(shí)，GSH對(duì)照組和各劑量組繼續(xù)給予相同劑量的D-半乳糖注射，持續(xù)4 w。

1.8.2 血液和臟器組織的生化指標(biāo) 末次灌胃結(jié)束后并禁食12 h，眼球采血后加入0.2%肝素鈉-生理鹽水，通過(guò)離心（4℃，3 000 r/min，10 min），上清利用試劑盒檢測(cè)SOD活力和MDA含量。

小鼠頸椎脫臼處死取其肝臟，加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液制備成10%勻漿液，通過(guò)離心（4℃，3 000 r/min，10 min），上清利用試劑盒測(cè)定SOD活力和MDA含量。

1.8.3 肝組織切片 小鼠肝臟利用10%甲醛溶液固定、包埋后，切片成厚度為4 μm的肝組織切片，依次經(jīng)蘇木精染料和伊紅染料（HE）染色、梯度酒精和二甲苯脫水、透明后封片觀察。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果以（x±s）表示，采用 SPSS 19.0單因素方差分析 （ANOVA）和顯著性檢驗(yàn)方法為Duncan多重比較，顯著性分析取95%置信度（P＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 基本成分

AVP中蛋白、碳水化合物和脂肪的含量分別為 65.07%±1.71%、5.11%±0.35%和0.58%±0.11%（表1），表明AVP可能還存在一小部分糖肽。此外，AVP的灰分含量高達(dá)6.60%±0.26%，因此對(duì)蛋白肽的礦物質(zhì)組成進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表1所示。AVP中P元素含量最高，其次是Mg元素。另一方面，鮑魚蛋白肽的微量元素主要以Fe和Zn元素為主，其它元素含量較低或未檢測(cè)到。

表1 鮑魚內(nèi)臟蛋白肽的礦物質(zhì)組成Table1 Mineral composition of abalone visceral peptide

2.2 分子質(zhì)量分布

AVP的分子質(zhì)量主要集中分布在340 u附近，其中分子質(zhì)量分布為 180～500 u組分含量占74.57% （圖1），這表明該蛋白肽主要由2～4個(gè)氨基酸殘基組成的寡肽。

2.3 氨基酸組成

AVP的結(jié)構(gòu)氨基酸含量為68.40 g/100 g，而游離氨基酸只有7.10 g/100 g（表2），表明AVP主要是由寡肽組成。在AVP的結(jié)構(gòu)氨基酸中，含量最高的是 Leu，其次為 Arg、Ala、Lys和 Glu。此外，疏水性氨基酸和支鏈氨基酸在總氨基酸中的占比分別高達(dá)49.77%和22.92%。

圖1 鮑魚內(nèi)臟蛋白肽的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of abalone visceral peptide

表2 鮑魚內(nèi)臟蛋白肽的氨基酸組成（g/100g）Table2 Amino acid composition of abalone visceral peptide （g/100g）

2.4 體外抗氧化活性

當(dāng)?shù)鞍纂馁|(zhì)量濃度低于5 mg/mL時(shí)，AVP的自由基清除活性及還原能力與質(zhì)量濃度之間存在明顯的線性關(guān)系（圖2）。AVP對(duì)羥自由基清除能力的EC50為1.54 mg/mL±0.04 mg/mL，比GSH（EC50=2.13 mg/mL ± 0.04 mg/mL） 還低 （圖2a）。AVP濃度對(duì)DPPH自由基清除能力的影響趨勢(shì)（圖2b）類似于羥自由基的清除效果。然而，AVP對(duì)DPPH自由基清除能力的EC50（1.51 mg/mL±0.09 mg/mL）卻高于 GSH（EC50=0.32 mg/mL±0.08 mg/mL）。當(dāng)AVP質(zhì)量濃度達(dá)到7 mg/mL時(shí)，還原能力在A500nm波長(zhǎng)下的吸光值可以達(dá)到1.8（圖2c）。添加0.2 mg/mL AVP的亞油酸在37℃下放置7 d，其吸光值明顯低于空白組，表明AVP可以抑制亞油酸的自氧化（圖2d）。AVP抑制亞油酸自氧化的能力伴隨AVP濃度的提高而增加。當(dāng)亞油酸中AVP質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL時(shí)，其吸光值低于添加2 mg/mL維生素C，表明AVP抑制亞油酸自氧化的能力優(yōu)于維生素C。

圖2 鮑魚內(nèi)臟蛋白肽對(duì)羥自由基、DPPH自由基的清除能力、還原能力和亞油酸的抑制效果Fig.2 Hydroxyl （a），DPPH radical-scavenging ability （b），reducting power （c） and lipid peroxidation inhibitory effect （d） of abalone visceral peptide

2.5 體內(nèi)抗氧化活性

2.5.1 血清和肝臟的生化指標(biāo) 在考察AVP對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)氧化損傷小鼠影響的試驗(yàn)期間，各劑量組AVP對(duì)小鼠肝臟指數(shù)都無(wú)明顯影響（數(shù)據(jù)未顯示），說(shuō)明AVP具有食用安全性。表3顯示了AVP對(duì)氧化損傷小鼠血清、肝臟的MDA和SOD活性的影響。相對(duì)于NOR組，MOD組小鼠血清中的MDA含量出現(xiàn)極顯著增加 （P＜0.01）。經(jīng)灌食AVP后，小鼠血清中的MDA含量出現(xiàn)下降，AVPM和AVP-H組中的血清MDA含量甚至比GSH陽(yáng)性對(duì)照組低。MOD組小鼠血清中的SOD活性明顯低于NOR組（P＜0.05），灌食 GSH后小鼠血清中的SOD活性得到提高并接近NOR組。AVP組小鼠血清中的SOD活性都顯著高于NOR組（P＜0.05），但劑量對(duì)小鼠血清SOD活性沒(méi)有明顯的影響。另一方面，小鼠經(jīng)D-半乳糖誘導(dǎo)氧化損傷后肝臟中的MDA含量沒(méi)有出現(xiàn)明顯的變化，而且除了AVP-H組出現(xiàn)一定程度的下降，其它給樣組也沒(méi)有發(fā)生顯著變化。然而，MOD組小鼠肝臟SOD活性顯著低于NOR組（P＜0.01）。經(jīng)灌喂AVP后，低劑量組小鼠肝臟SOD活性接近GSH組，而中劑量組和高劑量組小鼠肝臟SOD活性均顯著高于NOR組（P＜0.05）。這些結(jié)果表明AVP可以提高D-半乳糖致衰老小鼠血清和肝臟中的SOD活性，進(jìn)而降低血清中MDA的含量。

表3 鮑魚內(nèi)臟蛋白肽對(duì)小鼠肝臟和血清中MDA含量、SOD活性的影響（n=10）Table3 Effect of abalone visceral peptide on MDA leveland SOD activity in serum and liver of mice （n=10）

2.5.2 肝臟組織病理學(xué)的觀察 圖3顯示了小鼠肝臟組織切片的結(jié)果。NOR組小鼠的肝臟組織結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞分界清晰，細(xì)胞核大而圓，胞質(zhì)豐富，而MOD組的肝索紊亂，肝細(xì)胞腫脹疏松，肝竇消失和呈現(xiàn)少許出血點(diǎn)。這說(shuō)明小鼠經(jīng)D-半乳糖氧化損傷后，呈現(xiàn)出細(xì)胞衰老特有的現(xiàn)象，證明衰老模型成功建立。經(jīng)灌食GSH后，發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)已趨于正常，胞質(zhì)均勻，肝小葉細(xì)胞界限清晰。另一方面，AVP各劑量組的作用效果與GSH相當(dāng)，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的量效依賴性。這些結(jié)果說(shuō)明AVP同GSH一樣具有修復(fù)D-半乳糖致衰老小鼠肝細(xì)胞受損的功能。

圖3 小鼠肝臟組織切片 （蘇木精-伊紅染色，200×）Fig.3 Histopathological images of mice liver slices （stained with hematoxylin and eosin，200×）

3 討論

機(jī)體內(nèi)過(guò)剩的自由基通常會(huì)導(dǎo)致生命體發(fā)生氧化損傷，而抗氧化肽不僅具有抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、清除自由基的能力[16]，還具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和其它保健功能。本研究使用的蛋白肽是來(lái)源于鮑魚內(nèi)臟，通過(guò)酶解和膜分離等技術(shù)精制得到的。鮑魚內(nèi)臟蛋白肽（AVP）的分子質(zhì)量主要分布在180～500 u（圖1），而且富含Leu為主的疏水性氨基酸（表2）。有研究表明，蛋白肽的抗氧化能力與分子質(zhì)量和氨基酸組成緊密相關(guān)[6]，當(dāng)分子質(zhì)量小于500 u時(shí)，抗氧化能力越強(qiáng)[17]。蛋白肽中Leu含量越高，肽的抗氧化活性越強(qiáng)[18]。而且，疏水性氨基酸形成的疏水肽比親水肽具有更強(qiáng)的自由基清除活性[19]。體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果也證明了AVP不僅具有良好還原能力，而且其羥自由基清除能力和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化能力分別優(yōu)于GSH和維生素C（圖2）。因此，小分子寡肽AVP將具有優(yōu)越的抗氧化生物活性功能。

D-半乳糖氧化損傷模型是研究體內(nèi)抗氧化功能中比較成熟的造模方法，常結(jié)合 SOD等體內(nèi)抗氧化酶的活性和MDA等脂質(zhì)過(guò)氧化物含量的變化對(duì)體內(nèi)抗氧化進(jìn)行評(píng)價(jià)[15，20]。在本研究中，小鼠經(jīng)D-半乳糖氧化損傷后血清中的MDA含量出現(xiàn)明顯的增加，SOD活性明顯下降，而且小鼠肝細(xì)胞腫脹，肝索消失，肝血竇內(nèi)呈現(xiàn)出血點(diǎn)等現(xiàn)象，表明D-半乳糖誘導(dǎo)造模成功。D-半乳糖致衰老的小鼠經(jīng)灌食AVP后，發(fā)現(xiàn)小鼠血清和肝臟中的SOD活性均得到提高，而血清中MDA含量出現(xiàn)明顯下降（表3），肝臟組織的損傷明顯得到修復(fù)（圖3），部分效果甚至超過(guò)GSH。有研究報(bào)道，支鏈氨基酸可以緩解氧化應(yīng)激造成的氧化損傷[21]，寡肽的抗氧化活性比蛋白質(zhì)和氨基酸更強(qiáng)[22]，而且二肽、三肽可以直接被小腸吸收，其吸收代謝速度比游離氨基酸還快[23]。因此，富含支鏈氨基酸的AVP經(jīng)過(guò)胃腸道時(shí)可能不需要消化就被吸收，結(jié)果使AVP在體內(nèi)也發(fā)揮良好的抗氧化活性功能。

4 結(jié)論

鮑魚內(nèi)臟蛋白肽 （AVP）是以低分子質(zhì)量（180～500 u）為主的寡肽，富含疏水性氨基酸和支鏈氨基酸，含有少量的多糖和礦物質(zhì)元素。體外抗氧化活性的結(jié)果表明，AVP具有良好的清除自由基活性、還原能力和抑制亞油酸自動(dòng)氧化能力。另一方面，通過(guò)D-半乳糖氧化損傷模型，發(fā)現(xiàn)AVP可以提高D-半乳糖致衰小鼠血清和肝臟中SOD活性，降低血清的MDA含量，減緩肝臟組織氧化損傷。因此，AVP不僅可以提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還具備良好的體內(nèi)外抗氧化活性，在抗氧化抗衰老功能性食品或營(yíng)養(yǎng)品的開發(fā)和運(yùn)用上將具有很大的潛能。