蓮子殼多酚的抗氧化活性和穩(wěn)定性

顏 征 張海暉 李亞群 段玉清* 陸玉洪 孫冀平

（1 江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 江蘇鎮(zhèn)江 212013

2 江蘇怡味蓮朗伯食品有限公司 江蘇寶應(yīng) 225800）

蓮子殼是睡蓮科植物蓮種子的殼，蓮子殼作為蓮子加工的副產(chǎn)物，通常被焚燒而未被充分利用，造成資源浪費(fèi)。有文獻(xiàn)報(bào)道新鮮蓮子殼富含單寧、黃酮[1]、花青素[2]等多酚類(lèi)物質(zhì)，具有很高的利用價(jià)值。植物多酚又稱(chēng)植物單寧或鞣質(zhì)，是一種植物體內(nèi)多元酚類(lèi)次生代謝物，廣泛存在于植物的皮、根、葉和果實(shí)中[3]。植物多酚具有良好的抗氧化、抑菌、抗腫瘤等生物活性[4-8]。亞臨界水是介于其沸點(diǎn)和臨界溫度（100～374℃）之間，維持在適當(dāng)壓力下的水[9]。常溫常壓下，水的極性較強(qiáng)，在亞臨界條件下，隨著溫度的升高，水的氫鍵被打開(kāi)或減弱，對(duì)中性或非極性有機(jī)物的溶解能力也會(huì)增加[10]，從而可以連續(xù)提取天然產(chǎn)物中的水溶性成分和脂溶性成分。亞臨界水對(duì)多糖類(lèi)、皂甙類(lèi)、黃酮類(lèi)大分子化合物的提取效果較優(yōu)[11]。亞臨界水萃取技術(shù)以?xún)r(jià)廉、無(wú)污染的水作為溶劑，被視為綠色環(huán)保、前景廣闊的一項(xiàng)變革性技術(shù)[12]。本文采用亞臨界水萃取技術(shù)和大孔樹(shù)脂聯(lián)用制備蓮子殼多酚，并對(duì)多酚的抗氧化活性和儲(chǔ)藏穩(wěn)定性進(jìn)行研究，以期提高蓮子殼多酚的利用率，為后期產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)[13]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮蓮子殼購(gòu)于江蘇省鎮(zhèn)江市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。AB-8型大孔樹(shù)脂購(gòu)于滄州寶恩吸附材料科技有限公司。沒(méi)食子酸、福林-酚試劑、亞硫酸氫鈉、無(wú)水碳酸鈉、三氯化鐵、DPPH、ABTS、VC、乙醇等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SGH型亞臨界水反應(yīng)釜，鎮(zhèn)江丹徒環(huán)球機(jī)電配件廠生產(chǎn)；UV-1601紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器公司；ALPHAI-4/2-4冷凍干燥機(jī)，德國(guó)CHRIST公司；DL-5C離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；DHG-9015A電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；JA2003分析天平，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；GFB型中藥粉碎機(jī)，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 蓮子殼多酚的制備 將蓮子殼烘干后粉碎，過(guò)100目篩。稱(chēng)取一定量的蓮子殼粉末，按水料比 30∶1（mL/g）加入萃取釜中，并加入溶劑量1‰的NaHSO3作為輔助萃取劑，控制萃取溫度160℃下萃取15 min。將萃取液經(jīng)4 000 r/min離心8 min，并抽濾得到蓮子殼多酚粗提液，粗提液過(guò)AB-8大孔吸附樹(shù)脂柱分離/富集，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇水溶液洗脫（流速2 mL/min），收集洗脫液，45℃下減壓濃縮，將濃縮液真空冷凍干燥，即為蓮子殼多酚粉末。

1.3.2 多酚含量的測(cè)定 采用福林-酚法[14]稍作修改。取一定體積的Folin試劑稀釋10倍，取該稀釋液4 mL加入到1 mL樣液中，然后加入7.5%的碳酸鈉溶液5 mL，25℃靜置2 h后，于765 nm測(cè)定吸光度。以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，配成濃度梯度為 12.5，25，50，100，150，200μg/mL 的樣液，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得沒(méi)食子酸濃度與吸光度的回歸方程。

1.3.3 蓮子殼多酚的抗氧化性測(cè)定

1.3.3.1 還原能力測(cè)定 還原能力測(cè)定，參照李金鳳等[15]的方法。取25～200 μg/mL的蓮子殼多酚樣品1 mL分別加入pH值為6.6的磷酸鹽緩沖液2.5 mL和10 mg/mL的鐵氰化鉀溶液2.5 mL，搖勻，50℃保溫20 min后取出，加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，混勻后于700 nm處測(cè)定吸光度。以不加多酚樣品為空白對(duì)照。與VC比較。吸光度越大，表明樣品還原能力越強(qiáng)。

1.3.3.2 DPPH自由基清除能力測(cè)定 參照Choe等[16]的方法。將蓮子殼多酚樣品配成25～200 μg/mL的溶液（無(wú)水乙醇配制），取2 mL于試管中，加入 2 mL DPPH·無(wú)水乙醇溶液（200 μmol/L）?；靹蚝笤谑覝叵卤芄夥磻?yīng)30 min，于517 nm處測(cè)定吸光度，記為Ax?？瞻捉M：2 mL無(wú)水乙醇和2 mL多酚樣品溶液（不同濃度）；對(duì)照組：2 mL的DPPH·溶液和2 mL無(wú)水乙醇，在517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，記為Ao。與VC比較。DPPH·清除率的計(jì)算見(jiàn)公式（1）：

1.3.3.3 ABTS自由基清除能力測(cè)定 參照Akkarih等[17]的方法，稍作改進(jìn)。

（1） ABTS+·溶液的配制：7 mmol/L ABTS 溶液與 4.9 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液以 1∶1（V/V）充分混勻，室溫避光放置 12～16 h（避光），形成 ABTS+·儲(chǔ)備液，備用。使用時(shí)稀釋?zhuān)沟孟♂屢?34 nm處的吸光值0.7±0.02，現(xiàn)用現(xiàn)配。

（2）試驗(yàn)方法：用無(wú)水乙醇配制質(zhì)量濃度分別為25～200 μg/mL的蓮子殼多酚樣液，各取200 μL于試管中，加入4 mL的ABTS+·溶液，充分振搖30 s，室溫下反應(yīng)6 min（避光），于724 nm處測(cè)定反應(yīng)后樣液的吸光值，記為Ai。對(duì)照管：200 μL無(wú)水乙醇和4 mL ABTS+·溶液，于724 nm處測(cè)定反應(yīng)后樣液的吸光值，記為Ao；標(biāo)準(zhǔn)管：200 μL樣液和4 mL無(wú)水乙醇，于724 nm處測(cè)定反應(yīng)后樣液的吸光值，記為Aj。與VC比較。ABTS+·清除率的計(jì)算見(jiàn)公式（2）：

1.3.3.4 O·2-清除能力測(cè)定 參照Z(yǔ)hang等[18]的方法，稍作改進(jìn)。配制質(zhì)量濃度分別為25～200 μg/mL的蓮子殼多酚樣液。取4.5 mL Tris-Hcl緩沖液于10 mL具塞比色管中，在20℃水浴預(yù)熱20 min后，分別加入不同濃度的多酚樣品溶液1 mL和25 mmol/L鄰苯三酚溶液0.4 mL，搖勻后用蒸餾水稀釋至刻度。置于25℃水浴反應(yīng)5 min，取出后立即加入8 mol/L HCl溶液1 mL，終止反應(yīng)。于299 nm處的吸光度Ai?？瞻滓哉麴s水代替樣品溶液，測(cè)定吸光度Ao；考慮到樣品液本底的影響，同時(shí)測(cè)定不加鄰苯三酚溶液的相同濃度的樣品溶液的吸光度Aj，并與VC做比較。O·2-清除率的計(jì)算見(jiàn)公式（3）：

1.3.3.5 NO2-清除能力測(cè)定 參照龔明貴等[19]的方法。配制質(zhì)量濃度分別為25～200 μg/mL的蓮子殼多酚樣液。準(zhǔn)確吸取5 mg/L的NaNO2溶液2 mL置于25 mL比色管中，分別加入2 mL不同濃度的多酚樣品溶液，25℃下水浴30 min，取出后立即加入1 mL對(duì)氨基苯磺酸溶液（4 g/L），搖勻后于25℃下水浴5 min，再分別加入1 mL鹽酸萘乙二胺溶液（2 g/L），用蒸餾水定容至刻度，搖勻，于25℃水浴15 min后于538 nm處測(cè)定吸光度。以蒸餾水為參比，并于VC比較。NO2-清除率的計(jì)算見(jiàn)公式（4）：

式中：Ao——空白對(duì)照液的吸光度；Ax——加入樣品后的吸光度；Axo——樣品本底的吸光度。

1.3.4 蓮子殼多酚的穩(wěn)定性研究

1.3.4.1 pH值對(duì)蓮子殼多酚穩(wěn)定性的影響 用1 mol/L的鹽酸和1 mol/L的氫氧化鈉配成pH分別為 2，4，6，8，10，12 的溶液，加入適量多酚樣品，每隔3 d取樣1 mL，并稀釋4倍，在280 nm下測(cè)其吸光度。

1.3.4.2 光照對(duì)蓮子殼多酚穩(wěn)定性的影響 配制一定濃度的多酚水溶液，搖勻，將其分別放置于避光和自然光的條件下，每隔3 d取樣1 mL，并稀釋4倍，在280 nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度。

1.3.4.3 溫度對(duì)蓮子殼多酚穩(wěn)定性的影響 配制一定濃度的多酚水溶液，搖勻，將其分別放置于37℃、室溫（25℃）、4℃的條件下，每隔3 d取樣1 mL，并稀釋3倍，在280 nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度。

1.3.4.4 食鹽對(duì)蓮子殼多酚穩(wěn)定性的影響 配制濃度分別為0.02，0.04，0.06 g/mL的食鹽溶液，加入適量多酚樣品，每隔3 d取樣1 mL，并稀釋4倍，在280 nm下測(cè)其吸光度。以蒸餾水加入適量多酚樣品作為對(duì)照。

1.3.4.5 糖對(duì)蓮子殼多酚穩(wěn)定性的影響 配制質(zhì)量濃度為0.1 g/mL的葡萄糖溶液和0.1 g/mL的蔗糖溶液，加入適量多酚樣品，每隔3 d取樣1 mL，并稀釋4倍，在280 nm下測(cè)其吸光度。以蒸餾水加入適量多酚樣品作為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 總多酚測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線和多酚含量

通過(guò)沒(méi)食子酸濃度和吸光度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為：y=0.005 x-0.0274，R2=0.992，表明沒(méi)食子酸濃度與吸光度間具有良好的線性關(guān)系。通過(guò)該方程，求得蓮子殼多酚粉末得率為4.03%，其粉末中多酚純度為99.50%。

2.2 蓮子殼多酚的抗氧化性

2.2.1 蓮子殼多酚的還原能力 抗氧化物在酸性條件下，將Fe3+還原成顯藍(lán)色的Fe2+，測(cè)定其吸光度，就能得到被測(cè)液體的還原力[20]。由圖1可知，蓮子殼多酚和VC均有較強(qiáng)的還原能力，且隨樣品濃度增大，吸光度不斷增大，說(shuō)明樣品質(zhì)量濃度越高，還原能力越強(qiáng)。

2.2.2 蓮子殼多酚清除DPPH自由基的能力 當(dāng)溶液中存在抗氧化劑時(shí)，抗氧化劑能夠給DPPH自由基提供氫原子和電子使其發(fā)生褪色，吸光值變小，其顏色變得越淺表明抗氧化劑的抗氧化能力越強(qiáng)[21]。從圖2中可以得出，蓮子殼多酚和VC均有較好的清除DPPH自由基效果。隨著樣品溶液濃度增大，DPPH自由基清除率增大，當(dāng)樣品溶液質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)，蓮子殼多酚對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到95.45%。

圖1 蓮子殼多酚的還原能力Fig.1 Reducing power of polyphenols in lotus seeds hull

2.2.3 蓮子殼多酚清除ABTS+·的能力 抗氧化劑會(huì)將藍(lán)綠色的ABTS+·還原成無(wú)色的ABTS，在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，吸光度變化越大，其清除能力越強(qiáng)[22]。蓮子殼多酚和VC的清除ABTS+·能力如圖3所示，隨著樣品濃度的增大，清除ABTS+·的能力增強(qiáng)。蓮子殼多酚和VC均有較強(qiáng)的ABTS+·清除能力，當(dāng)樣品濃度低于100 μg/mL時(shí)，蓮子殼多酚清除ABTS+·的能力強(qiáng)于VC；當(dāng)樣品質(zhì)量濃度達(dá)到100 μg/mL以上時(shí)，蓮子殼多酚和VC對(duì)ABTS+·的清除率均接近100%。

圖2 蓮子殼多酚清除DPPH自由基的能力Fig.2 DPPH free radicals scavenging ability of lotus seeds hull polyphenols

2.2.4 蓮子殼多酚清除O·2-的能力 超氧陰離子自由基是反應(yīng)性氧中間物的一種，其與羥基結(jié)合后的產(chǎn)物會(huì)對(duì)細(xì)胞DNA造成損壞，清除超氧陰離子自由基在抗氧化過(guò)程中起著重要作用[23]。由圖4可知，蓮子殼多酚和VC對(duì)超氧陰離子均有一定的清除效果，且隨樣品濃度增大，清除能力增強(qiáng)。

圖3 蓮子殼多酚清除ABTS+ ·的能力Fig.3 ABTS+ ·scavenging ability of lotus seeds hull polyphenols

圖4 蓮子殼多酚清除O·2- 的能力Fig.4 O·2- scavenging ability of lotus seeds hull polyphenols

2.2.5 蓮子殼多酚清除NO2-的能力 蓮子殼多酚和VC對(duì)亞硝酸根離子的清除能力如圖5所示，蓮子殼多酚和VC對(duì)亞硝酸根離子均有較好的清除效果，隨著樣品濃度的增大，清除NO2-的能力增強(qiáng)。當(dāng)樣品溶液質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)，蓮子殼多酚對(duì)NO2-的清除率達(dá)到41.20%。

2.3 蓮子殼多酚的穩(wěn)定性

2.3.1 pH對(duì)蓮子殼多酚穩(wěn)定性的影響 由圖6可知，在pH 2～6之間時(shí)，蓮子殼多酚較穩(wěn)定，吸光值變化較小；在pH 8～12條件下，蓮子殼多酚吸光值變化較大，表明在堿性條件下蓮子殼多酚不穩(wěn)定。這是因?yàn)槎喾痈缓恿u基，在酸性或中性條件下，多酚性質(zhì)較為穩(wěn)定；在堿性條件下，破壞了多酚的結(jié)構(gòu)，生成其它物質(zhì)[24]，在pH為12時(shí)，尤其明顯。因此，應(yīng)在酸性條件下保存蓮子殼多酚。

圖5 蓮子殼多酚清除NO2- 的能力Fig.5 NO2- scavenging ability of lotus seeds hull polyphenols

圖6 pH對(duì)蓮子殼多酚穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of pH the stability of polyphenols from lotus seeds hull

2.3.2 光照對(duì)蓮子殼多酚穩(wěn)定性的影響 從圖7可以看出，蓮子殼多酚對(duì)光較敏感。在避光和自然光條件下，密封保存的0～3 d和9～15 d，蓮子殼多酚的吸光度均略有增大，密封保存的3～9 d，蓮子殼多酚的吸光度均略有減小，說(shuō)明多酚類(lèi)物質(zhì)在貯存過(guò)程中可能發(fā)生部分聚合或降解，但兩者具有相同趨勢(shì)。

2.3.3 溫度對(duì)蓮子殼多酚穩(wěn)定性的影響 由圖8可以看出，在4℃條件下保存，蓮子殼多酚溶液吸光值變化很??；在室溫和37℃條件下，蓮子殼多酚溶液吸光值均有明顯變化，說(shuō)明蓮子殼多酚結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，高溫下蓮子殼結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，故應(yīng)在低溫條件下保存蓮子殼多酚。

圖7 光照對(duì)蓮子殼多酚穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of light on the stability of polyphenols from lotus seeds hull

圖8 溫度對(duì)蓮子殼多酚穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of temperature on the stability of polyphenols from lotus seeds hull

2.3.4 食鹽對(duì)蓮子殼多酚穩(wěn)定性的影響 不同濃度食鹽對(duì)蓮子殼多酚穩(wěn)定性的影響如圖9所示，無(wú)食鹽、0.02 g/mL食鹽、0.04 g/mL食鹽和0.06 g/mL食鹽條件下，蓮子殼多酚溶液吸光度變化相似，說(shuō)明食鹽既不會(huì)破壞蓮子殼多酚，也不能保護(hù)蓮子殼多酚。因此生產(chǎn)加工過(guò)程中，添加食鹽不會(huì)影響蓮子殼多酚的穩(wěn)定性。

圖9 食鹽對(duì)蓮子殼多酚穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effect of salt on the stability of polyphenols from lotus seeds hull

2.3.5 糖對(duì)蓮子殼多酚穩(wěn)定性的影響 由圖10可以得出，在無(wú)糖條件下，蓮子殼多酚吸光度變化較明顯，在0.1 g/mL葡萄糖和蔗糖溶液中，蓮子殼多酚吸光變化較小，說(shuō)明蓮子殼多酚比較穩(wěn)定，葡萄糖和蔗糖對(duì)蓮子殼多酚均有一定的保護(hù)作用。這是因?yàn)樘堑奶砑咏档土巳芤核只疃?，從而減少了多酚的破壞[25]。

圖10 糖對(duì)蓮子殼多酚穩(wěn)定性的影響Fig.10 Effect of sugar on the stability of polyphenols from lotus seeds hull

3 結(jié)論

1）經(jīng)亞臨界水萃取和AB-8大孔吸附樹(shù)脂聯(lián)用制備蓮子殼多酚，其得率為4.03%，多酚純度為99.50%。

2） 蓮子殼多酚對(duì)DPPH·、ABTS+·、O·2-、NO2-均有較好的清除效果。蓮子殼多酚在4℃、避光、pH 2～6條件下儲(chǔ)存較穩(wěn)定，食鹽對(duì)蓮子殼多酚的穩(wěn)定性沒(méi)有影響，蔗糖和葡萄糖均對(duì)蓮子殼多酚有一定的保護(hù)作用，可以為多酚產(chǎn)品的加工提供理論基礎(chǔ)。