基于高效凝膠滲透色譜法和離子色譜法的棘托竹蓀提取物的質量控制

李鷗葉 張全才 施曉丹 黃延盛 殷軍藝 張 爽 聶少平*

（1 南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室 南昌 330047

2 無限極（營口）有限公司 遼寧營口 115000）

竹蓀屬（Dictyophora indusiata）隸屬于擔子菌亞門、鬼筆科、竹蓀屬，又名竹蕈、竹參、竹笙、仙人簽、竹君等，其營養(yǎng)物質豐富，是我國著名大型食用菌之一，享有“菌中皇后”、“山珍之花”、“雪裙仙子”、“人類植物性食品的頂峰”等美譽[1-3]。竹蓀含有蛋白質、多種氨基酸、維生素、多糖和多種微量元素等營養(yǎng)成分。多糖作為竹蓀的主要生物活性，在調機體免疫[4]，抗氧化[5]，抗凝血[6]，抗炎癥[7]，抑制腫瘤和癌細胞生長[8-9]，以及降血壓、血糖[10]方面都有一定的療效。竹蓀多糖在醫(yī)藥、食品、化工方面具有巨大的開發(fā)利用價值，已成為生物醫(yī)藥、食品營養(yǎng)健康等領域研究的熱點[11]。

由于多糖化學結構復雜多樣，其質量控制一直是工業(yè)生產(chǎn)中的重點和難點。多糖的質量控制方法至今較少，手段單一，僅采用測定總糖含量的方法已遠遠不能滿足當下多糖質量控制的需求。近年來常見的多糖質量控制方法，主要通過測定總糖含量、分子質量大小和分布、單糖組成、物質的量比測定和雜質檢測等方法來進行質量控制[12]。李紹平等[13]利用糖譜法研究中藥多糖的表征及活性相關特性，從而建立質量控制方法。劉芹等[14]采用高效凝膠滲透色譜法測定銀耳多糖的相對分子質量及其分布，從而建立銀耳多糖的質量控制方法。王巖等[15]提出“多糖水解-衍生化-HPLC指紋圖譜”的研究思路，建立桂附地黃方多糖的質量控制方法等。

本試驗中采用高效凝膠滲透色譜法和離子色譜法對棘托竹蓀提取物的相對分子質量及其分布、單糖組成及含量進行定性和定量檢測。此外，由于前期研究顯示棘托竹蓀中的多糖組分具有線性α-1，4-葡聚糖的結構，與直鏈淀粉的結構極其類似，因此本文從紅外光譜特征、溶解性、與碘液顯色反應的現(xiàn)象及固體形貌等方面比較棘托竹蓀提取物與淀粉的性質差異，試圖建立一種更為準確和全面的竹蓀提取物的質量控制模式。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

棘托竹蓀提取物共14批 （編號依次為：CZUS20150408、CZUS20151006、CZUS 20160301、CZUS20160425、CZUS20160429、CZUS20160430、CZUS20160819、CZUS20160820、CZUS20160830、CZUS20161005、CZUS20161202、CZUS20161203、CZUS20161204、CZUS20161204-5%），由無限極（中國）有限公司提供。

8種單糖標準品（巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖）和2種糖醛酸標準品（半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸），美國Sigma公司；不同分子質量的葡聚糖系列標準品（Dextran T-10、Dextran T-40、Dextran T-50、Dextran T-70、Dextran T-500、藍色葡聚糖），美國 Pharmacia公司；醋酸鈉、飽和氫氧化鈉溶液、疊氮鈉均為分析純。

1.2 儀器與設備

Aligent 1260高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；Dionex ICS-5000 DC離子色譜儀，美國戴安公司；Nicolet 5700傅里葉紅外光譜儀，美國Thermo公司；AL 104電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；場發(fā)射掃描電鏡帶能譜儀，日本電子等。

1.3 方法

1.3.1 棘托竹蓀提取物高效液相色譜表征 采用高效凝膠滲透色譜法對竹蓀提取物的分子質量分布進行表征[14-16]。色譜條件為保護柱：UltrahydrogelTMGuard Column （6×40 mm，10 μm）；分離柱：UltrahydrogelTMLinear Column （7.8 mm×300 mm，10 μm）；柱溫：35℃；流動相：水溶液（添加 0.02%NaN3）；流速：0.6 mL/min；進樣量：20 μL。采用G1362A示差檢測器進行檢測，示差檢測器溫度：35℃；紫外檢測器的波長為280 nm。利用Chem-Station色譜工作站采集分析數(shù)據(jù)。

用流動相配制1.0 mg/mL棘托竹蓀提取物及系列葡聚糖標準品溶液 （Dextran T-10、Dextran T-40、Dextran T-50、Dextran T-70、Dextran T-500、藍色葡聚糖），過 0.22 μm 水系濾膜，然后進樣分析。

1.3.2 棘托竹蓀提取物單糖組成分析 稱取5.0 mg樣品，用0.5 mL蒸餾水攪拌至溶解后，加入0.5 mL 2 mol/L H2SO4于冰浴中攪拌30 min，然后再加入2 mL蒸餾水于100℃水解2 h，用蒸餾水稀釋至50 mL定容，得到多糖水解液。然后用超純水稀釋10倍，過0.22 μm濾膜進樣分析[17-18]。

標準曲線的繪制：精確稱取巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸共10種標準品5.0 mg溶于50 mL容量瓶中，作為混合標準品母液。將單糖混合標準品母液稀釋成不同濃度梯度，過膜進樣，得到不同單糖的標準曲線，進行定量測定。

離子色譜工作條件：Dionex ICS-5000離子色譜系統(tǒng)，脈沖安培檢測器，色譜柱為CarboPacTM PA20（50 mm×4 mm）保護柱和 CarboPacTM PA20分析柱 （250 mm×4 mm）；流動相為 A液（250 mmol/L NaOH 溶液）、B 液（H2O）和 C 液（1 mol/L醋酸鈉）；流速：0.5 mL/min；梯度洗脫，洗脫程序見表1；進樣量：10 μL；柱溫：30℃；系統(tǒng)部件溫度：25℃；用Chromeleon色譜工作站采集和處理數(shù)據(jù)。

表1 高效陰離子色譜梯度洗脫程序Table1 Gradient elution procedure of high performance anion exchange chromatography

1.3.3 棘托竹蓀提取物與淀粉的鑒別

1.3.3.1 棘托竹蓀提取物紅外光譜掃描 取干燥的棘托竹蓀提取物及淀粉樣品1 mg，KBr壓片法，用Nicolet 5700傅里葉紅外光譜儀在4 000～400 cm-1范圍內進行掃描[18-19]。

1.3.3.2 棘托竹蓀提取物與淀粉的溶解性 稱取棘托竹蓀提取物（5個批次的代表樣品）與不同的淀粉樣品（玉米淀粉、大米淀粉、小麥淀粉、直鏈淀粉）各50 mg，加入5 mL蒸餾水，渦旋混勻后，室溫下溶解1 h，比較兩種物質的溶解情況。

1.3.3.3 棘托竹蓀提取物與碘液顯色反應 配制1 mg/mL不同批次的棘托竹蓀提取物水溶液7.0 mL左右，加入200 μL碘液，并以水和玉米淀粉溶液作為對照。

1.3.3.4 棘托竹蓀提取物與淀粉的電鏡觀察 將棘托竹蓀提取物與淀粉樣品配成1 mg/mL，冷凍干燥。然后用Model IB-3離子鍍膜機進行噴金，將樣品固定在樣品臺上，置于電鏡儀中，加速電壓為30 kV，采用XT MicroscopeControl軟件釆集圖譜。

2 結果與分析

2.1 棘托竹蓀提取物高效液相色譜表征

圖1 不同批次棘托竹蓀提取物高效液相凝膠滲透色譜圖Fig.1 High performance gel chromatograph of extracts of different batches from Dictyophora echino-volvata Zane

圖1為14批棘托竹蓀提取物的高效液相凝膠滲透色譜圖。圖1a、圖1b為示差信號圖，圖中出現(xiàn)了3個明顯的出峰區(qū)間，其保留時間依次為13.2～14.4 min，14.4～15.9 min和 15.9～20.2 min。根據(jù)葡聚糖標準曲線，Kav=-0.236 lg MW+1.5246（R2=0.9948），計算出這3個出峰區(qū)間內的特征峰的平均重均分子質量依次為 5.2×104，6.4×103和800 u。圖1c、圖1d）為紫外信號圖中，可以看出棘托竹蓀提取物中的蛋白質分布情況，從紫外信號圖可以看到，棘托竹蓀提取物在12～16 min和32～34 min會出現(xiàn)特征峰，可以作為棘托竹蓀提取物的鑒定標準之一。

2.2 棘托竹蓀提取物中單糖組成的分析

14批棘托竹蓀提取物的單糖組成如圖2所示。以葡萄糖標準品的濃度為橫坐標（x），以峰面積為縱坐標（y），得葡萄糖的標準曲線為：y=1.3512x+1.2958，R2=0.9925。經(jīng)過計算，各個批次提取物的葡萄糖含量結果如表2所示。棘托竹蓀提取物主要由葡萄糖組成，且葡萄糖的含量在75%～90%。

2.3 棘托竹蓀提取物與淀粉的鑒別

2.3.1 棘托竹蓀多糖紅外光譜特征 棘托竹蓀提取物的紅外光譜見圖3a。根據(jù)文獻報道，對棘托竹蓀提取物的紅外圖譜分析如下：在3 380 cm-1處的吸收峰為羥基吸收峰，2 930 cm-1和1 640 cm-1處的微弱吸收峰分別為-CH的伸縮振動和氫鍵振動吸收峰，1 411 cm-1和1 367 cm-1處的吸收峰為-CH變角振動吸收峰。800～1 200 cm-1被認為是多糖的特征吸收區(qū)域，其中1 023，1 081和1 238 cm-1為吡喃環(huán)吸收峰，930，850，761和 709 cm-1處的吸收峰表明棘托竹蓀中的多糖組分的異頭碳構型為α-型。對比棘托竹蓀提取物與不同來源的淀粉樣品紅外圖3b，可以發(fā)現(xiàn)，棘托竹蓀提取物的特征吸收峰與淀粉的樣品大體一致，所以紅外圖譜表征不是理想的鑒定方法[20-23]。

2.3.2 溶解性比較 圖4是棘托竹蓀提取物與淀粉的溶解性比較圖。棘托竹蓀提取物極易溶于水，溶液為澄清的黃色。而淀粉不溶于冷水，只是分散在水中，靜置1 h后會沉在試劑瓶底部。

圖2 不同批次棘托竹蓀提取物的離子色譜圖Fig.2 Ion chromatograms of extracts of different batches from Dictyophora echino-volvata Zane

表2 不同批次棘托竹蓀提取物單糖組成結果Table2 Monosaccharide composition of extracts of different batches from Dictyophora echino-volvata Zane

圖3 14個不同批次的棘托竹蓀提取物紅外圖譜（a）和棘托竹蓀提取物與淀粉的紅外比較圖（b）Fig.3 FT-IR spectra of extracts from Dictyophora echino-volvata Zane （a） and a comparison of the FT-IR of the extracts with starches （b）

圖4 棘托竹蓀提取物與淀粉溶解性比較Fig.4 The solubility of extracts from Dictyophora echino-volvata Zane and starches

2.3.3 與碘液顯色反應 不同批次的棘托竹蓀提取物與碘液反應結果如圖5所示，淀粉與碘液呈現(xiàn)藍色，而提取物與碘液反應后顏色與淀粉的顏色具有明顯的差別，所測所有批次的提取物與碘液反應顏色類似。

2.3.4 電鏡觀察 圖6為棘托竹蓀提取物在不同放大倍數(shù)下的掃描電鏡圖，從圖可以看出，棘托竹蓀提取物以薄片狀和空心柱狀結構為主。圖7為不同的商業(yè)淀粉的電鏡圖 （放大1 000倍），從圖中可以看出，所測商業(yè)淀粉除大米淀粉有一部分絲狀結構外，其它均為規(guī)則或不規(guī)則的顆粒型或球形。對比圖6和圖7可以知道，棘托竹蓀提取物的微觀結構與淀粉完全不同。

圖5 棘托竹蓀提取物與碘液反應Fig.5 Iodine liquid reaction of extracts from Dictyophora echino-volvata Zane

3 結論

本試驗基于高效凝膠色譜法 （配置示差檢測器和紫外檢測器）和離子色譜法對14個批次的棘托竹蓀提取物的分子質量分布和單糖組成及糖含量進行定性分析和定量檢測。結果表明，在示差信號圖中，棘托竹蓀提取物在3個保留時間區(qū)間內具有特征吸收峰 （特征峰的平均重均分子質量依次為 5.2×104、6.4×103和 800 u）。紫外信號圖中（280 nm處），在12～16 min和32～34 min會出現(xiàn)特征峰。單糖組成分析表明棘托竹蓀提取物主要由葡萄糖組成，且葡萄糖的含量在75%～90%。通過傅里葉紅外光譜檢測，推測棘托竹蓀提取物中的多糖組分可能為α-1，4-葡聚糖，這與淀粉的結構類似，因此從溶解性、碘液反應以及電鏡圖3個方面對竹蓀提取物與淀粉進行鑒別。

綜上所述，溶解性和與碘液反應可以作為快速定性的檢測方法，而分子質量大小和單糖組成及含量可以作為定量鑒別的方法。該方法簡便快捷，重現(xiàn)性好，準確度高，可作為棘托竹蓀提取物質量控制的快速檢測方法，也為工業(yè)中富含多糖的天然產(chǎn)物提取物的質量控制方法提供參考。