熊海蓉 饒椏楠 史萬杰 熊遠(yuǎn)福 黃敏

摘要 [目的]獲得蒼耳子中抗寒物質(zhì)的最佳提取工藝條件。[方法]以蒼耳子為原料、水稻為試驗(yàn)對象，研究提取劑的篩選，探討料液比、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)等因素對蒼耳子中抗寒物質(zhì)提取的影響，通過L9（34）正交試驗(yàn)確定最佳提取條件。[結(jié)果]蒼耳子中抗寒物質(zhì)的最佳提取工藝條件為提取劑50%乙醇、料液比1∶9（g∶mL）、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間40 min、提取3次;粉體抗寒物質(zhì)的產(chǎn)率為10.0%。[結(jié)論]該提取工藝簡便、成本較低，獲得的抗寒物質(zhì)能顯著提高秧苗游離脯氨酸含量。

關(guān)鍵詞 蒼耳子;抗寒物質(zhì);提取工藝;抗寒性;水稻

中圖分類號 Q945.78;S-3文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 0517-6611（2020）24-0171-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.24.048

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Study on Extraction Technology of Coldresistant Substances in Fructus xanthii

XIONG Hairong1， RAO Yanan2， SHI Wanjie1 et al

（1.Chemistry and Materials Science， Hunan Agricultural University， Changsha，Hunan 410128;2.Agricultural College of Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225000）

Abstract [Objective]To obtain optimal conditions of extraction technology of coldresistant substances in Fructus xanthii.[Method]Using Xanthium as raw material and rice as the test object，the effects of the solidliquid ratio， extraction temperature， extraction time and extraction times on the extraction of coldresistant substances in Fructus xanthii were studied， and the optimal extraction conditions were determined by orthogonal experiment L9（34）.[Result]The optimal conditions of the extraction technology of coldresistant substances in Fructus xanthii were as followed：the extractant was 50% ethanol， 1∶9 （g∶mL） as solidliquid ratio，80 ℃ as extraction temperature，40 min as extraction time， and extraction 3 times. The yield of powder coldresistant substances was 10.0%. [Conclusion]The extraction process was simple with low cost， and the subsequent coldresistant substances could significantly increase the content of proline in rice seedlings.

Key words Fructus xanthii;Coldresistant substance;Extraction technology;Cold resistance;Rice

低溫寒害是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常見的自然災(zāi)害，能影響作物的正常生理代謝，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致作物死亡造成大面積減產(chǎn)[1-2]。我國是農(nóng)業(yè)種植大國，每年因低溫寒害遭受了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。如何提高作物抗寒性能，探索相關(guān)的耐寒基因，尋求增強(qiáng)作物抗寒能力的抗寒物質(zhì)是農(nóng)業(yè)科研領(lǐng)域的重要方向，對于預(yù)防低溫寒冷對作物的危害具有重要意義?？购畡┗蚩购镔|(zhì)是指在低溫脅迫下能夠穩(wěn)定植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使其發(fā)生一系列的生理生化活動(dòng)，從而增強(qiáng)其抗寒能力的藥品、試劑或植物生長調(diào)節(jié)劑等的統(tǒng)稱[2]。國內(nèi)外關(guān)于植物抗寒性及抗寒物質(zhì)的研究取得了不少成果。脯氨酸是植物體內(nèi)調(diào)節(jié)滲透壓最有效的物質(zhì)之一，它不僅能在低溫脅迫下提高細(xì)胞液濃度，保持細(xì)胞液與環(huán)境的滲透平衡，防止水分喪失，還能在低溫脅迫過后為植物提供營養(yǎng)[3];其含量與植物抗寒性呈正相關(guān)性[4]。為了減少低溫寒害對植物的傷害，研究者運(yùn)用水楊酸[5-6]、脫落酸（ABA）[7]、脯氨酸[8]、植物提取物[1-2]等抗寒物質(zhì)來增強(qiáng)植物的抗寒能力，取得了良好效果。就水稻而言，Lee等[9-10]分別利用ABA、Tachigrance預(yù)防寒害對水稻的影響，效果明顯。張海清等[11]用抗寒種衣劑處理水稻種子，能提高水稻游離脯氨酸、可溶性蛋白質(zhì)含量，使水稻在低溫脅迫下保持良好的代謝。熊遠(yuǎn)福等[12]將從木賊中提取出的抗寒成分與黏合劑等助劑經(jīng)過溶解混合，配制成了水稻抗寒劑。熊海蓉等[13]從小茴香果中提取出抗寒成分，與殺菌劑、殺蟲劑等活性成分，成膜劑等非活性成分，經(jīng)粉碎混合配制出了一種防病防蟲抗寒水稻種衣劑，具有良好的抗寒和防病防蟲效果。

蒼耳（Xanthium sibiricum Patr.）為菊科一年生草本植物，具有耐嚴(yán)寒、抗干旱等特殊生物學(xué)特性，其果實(shí)名為蒼耳子。蒼耳子含有較多的戊聚糖、蒼耳子苷、脂肪酸、維生素C等植物抗寒成分，以及氨基酸、礦質(zhì)元素等植物營養(yǎng)成分[2]，屬于廉價(jià)中藥材，是提取植物源性抗寒物質(zhì)較理想的原料之一。該研究以蒼耳子為原料、水稻為試驗(yàn)對象，通過提取劑篩選、單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，探討蒼耳子中抗寒物質(zhì)的最佳提取工藝條件，以期為植物源性抗寒物質(zhì)的提取與應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

蒼耳子，市售，粉碎后備用;乙醇，95%，食品級;早稻種子，中嘉早17，湖南省水稻科學(xué)研究所。

1.2 主要儀器

PYX-300G-B光照培養(yǎng)箱，韶關(guān)市科力儀器有限公司;DK-S24恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;Heidolph旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國Heidolph公司;2000型可見分光光度計(jì)，尤尼柯儀器有限公司;TF-D-1L冷凍干燥器，上海拓紛機(jī)械設(shè)備有限公司;AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 抗寒物質(zhì)提取工藝流程。

5.0 g蒼耳子→放入三頸燒瓶（帶攪拌、冷凝裝置）→加提取劑（料液比1∶8）→水浴恒溫?cái)嚢杼崛。?0 ℃、40 min）→過濾并收集濾液→濾渣重復(fù)提取2次→合并濾液→減壓蒸餾乙醇→濃縮至5.0 mL→液體抗寒物質(zhì)→濃縮至濃稠液→冷凍干燥→粉碎→粉狀抗寒物質(zhì)。

1.3.2 種子包衣、發(fā)芽及抗寒試驗(yàn)方法。

1.3.2.1

種子包衣方法。稱取25.0 g水稻種子放入燒杯內(nèi)，按照包衣比（液體抗寒物質(zhì)∶種子，質(zhì)量比）1∶12.5，稱取液體抗寒物質(zhì)2.00 g，緩慢加入裝有種子的燒杯中，邊加邊攪拌，直至種子表面被抗寒物質(zhì)包衣均勻，置于烘箱內(nèi)38 ℃烘干。對照（CK）：種子不包衣。

1.3.2.2

發(fā)芽及抗寒試驗(yàn)。采用泥床發(fā)芽法，處理包括種子包衣（T）和對照（CK），每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)取100粒種子置于塑料發(fā)芽盒內(nèi)，于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室中進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)[14]，播種后第7天測定發(fā)芽率，繼續(xù)培養(yǎng)至2葉1心，然后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)箱內(nèi)，在7～8 ℃低溫下處理36 h，采樣后按照張殿忠等[15]方法測定秧苗體內(nèi)脯氨酸含量，以鮮重計(jì)。以脯氨酸含量高低作為液體抗寒物質(zhì)的抗寒效果優(yōu)劣的考察指標(biāo)。

1.3.3 抗寒物質(zhì)提取劑篩選試驗(yàn)。

按照“1.3.1”工藝流程，稱取蒼耳子3份，分別用提取劑水、50%乙醇和95%乙醇進(jìn)行提取，其他提取條件固定不變，得到3份液體抗寒物質(zhì)。按照“1.3.2”方法試驗(yàn)3份液體抗寒物質(zhì)的抗寒效果，并與CK比較，選出最佳提取劑。

1.3.4 抗寒物質(zhì)提取單因素試驗(yàn)。

以“1.3.3”獲得的最佳提取劑為基礎(chǔ)，分別探討料液比（g∶mL）、提取溫度（T）、提取時(shí)間（min）、提取次數(shù)4個(gè)單因素對抗寒物質(zhì)提取的影響。

1.3.5 抗寒物質(zhì)提取正交試驗(yàn)。

根據(jù)“1.3.4”單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇料液比、提取溫度、提取時(shí)間和提取次數(shù)共4個(gè)因素，每個(gè)因素取3個(gè)水平，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)（表1），以確定抗寒物質(zhì)的最佳提取工藝條件;用正交設(shè)計(jì)助手ⅡV3.1進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.6 粉狀抗寒物質(zhì)產(chǎn)率的測定。

準(zhǔn)確稱取蒼耳子W（g），按照“1.3.1”工藝流程，在獲得的最佳提取工藝條件下進(jìn)行提取，得到粉狀抗寒物質(zhì)，質(zhì)量為W1（g）。粉狀抗寒物質(zhì)的產(chǎn)率按下式計(jì)算：產(chǎn)率=W1/W×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗寒物質(zhì)提取劑的篩選

由表2可知，用50%乙醇和95%乙醇作提取劑所得到的抗寒物質(zhì)均能顯著提高秧苗脯氨酸含量，其中50%乙醇作提取劑時(shí)脯氨酸含量最高，顯著優(yōu)于95%乙醇、蒸餾水，更比CK提高了134.3%;3種提取劑所得到的抗寒物質(zhì)對種子萌發(fā)均無明顯抑制作用?？梢?，提取劑選50%乙醇較合適。

2.2 抗寒物質(zhì)提取單因素試驗(yàn)

2.2.1 料液比的影響。

按“1.3.1”工藝流程，稱取蒼耳子5份，用50%乙醇作提取劑，料液比設(shè)置為1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10，其他提取條件固定不變，得到液體抗寒物質(zhì)。按“1.3.2”方法試驗(yàn)5份抗寒物質(zhì)的抗寒效果，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，料液比的大小對提取的抗寒物質(zhì)的抗寒效果有顯著的影響。隨著料液比的增加，秧苗脯氨酸含量開始增加較快;當(dāng)料液比達(dá)1∶9之后增加緩慢，此時(shí)蒼耳子中的絕大部分抗寒物質(zhì)已被提取出來，繼續(xù)加大料液比脯氨酸含量增加很少?？紤]到料液比過大、溶劑回收等成本較高，料液比選1∶9 較合適。

2.2.2 提取溫度的影響。

按“1.3.1”工藝流程，稱取蒼耳子5份，用50%乙醇作提取劑，提取溫度設(shè)置為50、60、70、80、90 ℃，其他提取條件固定不變，得到液體抗寒物質(zhì)。按“1.3.2”方法試驗(yàn)5份抗寒物質(zhì)的抗寒效果，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，提取溫度對抗寒效果的影響很明顯，當(dāng)提取溫度小于80 ℃時(shí)，脯氨酸含量隨著提取溫度的升高持續(xù)上升;但溫度超過80 ℃之后脯氨酸含量有所下降，可能是提取溫度過高導(dǎo)致抗寒物質(zhì)分解了。可見，提取溫度選80 ℃較合適。

2.2.3 提取時(shí)間的影響。

按“1.3.1”工藝流程，稱取蒼耳子5份，用50%乙醇作提取劑，提取時(shí)間設(shè)置為20、30、40、50、60 min，其他提取條件固定不變，得到液體抗寒物質(zhì)。按“1.3.2”方法試驗(yàn)5份抗寒物質(zhì)的抗寒效果，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，隨著提取時(shí)間的增加，秧苗體內(nèi)脯氨酸含量初期增加較快;提取時(shí)間超過40 min之后，脯氨酸含量的增加幅度已很小，說明此時(shí)原料蒼耳子中的抗寒物質(zhì)已基本提取出來。可見提取時(shí)間選40 min 較合適。

2.2.4 提取次數(shù)的影響。

按“1.3.1”工藝流程，稱取蒼耳子5份，用50%乙醇作提取劑，提取次數(shù)設(shè)置為1、2、3、4和5次，其他提取條件固定不變，得到液體抗寒物質(zhì)。按“1.3.2”方法試驗(yàn)5份抗寒物質(zhì)的抗寒效果，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，隨著提取次數(shù)的增加，秧苗體內(nèi)脯氨酸含量開始增加較快，提取次數(shù)達(dá)2次之后其增加幅度已經(jīng)比較小。提取次數(shù)較多，則提取劑用量大、回收成本較高;為了節(jié)約成本，提取次數(shù)選2次較合適。