王虎玄，張淑晴，廖 川，鐘小榮，孫宏民

(陜西科技大學 食品與生物工程學院，陜西 西安 710021)

0 引言

魯氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)屬于擲孢酵母科，具有嗜高滲、耐酸等特性，能夠引起蜂蜜、濃縮果蔬汁、果醬、餅干、糕點、面包等食品腐敗變質[1].該菌的污染負面影響食品的外觀、口感風味以及營養(yǎng)價值，對人體健康具有一定潛在危害.該菌還能代謝產氣，引發(fā)脹包，特別是玻璃瓶密封包裝，嚴重脹包會引發(fā)爆瓶，對消費者身體造成物理傷害[2,3].因此，研究建立安全、高效的控制方法，及時去除Z.rouxii污染，切實保證相關食品的質量安全，對保障消費者健康具有現(xiàn)實意義.

目前，對食品儲存過程中腐敗酵母的污染主要通過低溫和添加防腐劑進行防控.但低溫只能減緩腐敗的發(fā)生，并不能防止腐敗；傳統(tǒng)防腐劑存在效果差、具有潛在毒性等弊端.隨著現(xiàn)代食品質量標準的提高，對天然、無害、高效食品防腐劑的研究已成為熱點[4].

植物源抑菌物質是指來源于植物的根、莖、葉、花、果、種子或其次生代謝產物，具有抑菌作用的活性物質[5].植物源抑菌物質在自然界分布廣泛，具有多種生理活性，符合目前食品產業(yè)提倡的天然、營養(yǎng)、功能化食品添加劑的發(fā)展方向，并且來源廣泛，消費者認可程度高[6,7].研究表明，來源于不同草本植物的精油提取物由于含有大量具有生理活性的次級代謝產物從而表現(xiàn)出高效抑制甚至殺滅細菌[8]、酵母菌[9]和霉菌[10]防腐效果.但有關植物源活性物質對食品中魯氏接合酵母污染的防控研究尚未見報道.

基于此，本研究選取包括多酚類、黃酮類、醌類、萜類和皂苷類等16種天然植物源化合物為潛在食品防腐劑，首先通過抑菌試驗篩選對魯氏接合酵母菌(標準菌株和食品來源分離菌株)具有高效抑菌活性的植物源物質，然后從細胞膜通透性、完整性等方面對目標植物源物質的潛在抑菌機制進行解析，最后通過場發(fā)射掃描電鏡觀察細胞形態(tài)變化，以驗證植物源抑菌物質對酵母細胞膜特性的影響.實驗結果可為天然、高效食品防腐劑開發(fā)并有效防控食品中魯氏接合酵母的污染奠定理論基礎.

1 材料和方法

1.1 菌種與試劑

酵母菌種：魯氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)分離菌株B-WHX-12-53及魯氏接合酵母標準菌株ATCC 2623由西北農林科技大學食品科學與工程學院健康食品制造實驗室提供.

植物源抑菌物質：硫辛酸(1077-28-7)、咖啡酸(331-39-5)、沒食子酸(149-91-7)、大蒜素(539-86-6)、表兒茶素(490-46-0)、綠原酸(327-97-9)、丁香酸(530-57-4)、丹皮酚(552-41-0)、阿魏酸(1135-24-6)、槲皮素(117-39-5)、檸檬醛(5392-40-5)、原兒茶酸(2954-52-1)、香荊芥酚(499-75-2)、百里醌(490-91-5)、肉桂醛(104-55-2)、麝香草酚(89-83-8),以上植物源抑菌物質均由上海源葉生物科技有限公司提供，且均為食品級標準品，純度99%以上.

YPD培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母浸粉10 g，蒸餾水1 000 mL，如需固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉20 g.

生理鹽水：氯化鈉8.5 g，用蒸餾水定容至1 000 mL.

磷酸緩沖液(pH 7.4)：A液(0.2 M NaH2PO4·H2O)，稱取2.76 g NaH2PO4·H2O溶于蒸餾水，稀釋定容至100 mL；B液(0.2 M Na2HPO4·H2O)，稱取5.36 g Na2HPO4·H2O溶于蒸餾水，稀釋定容至100 mL.取A液19.00 mL，B液81.00 mL混合，測定混合液pH.

2.5%戊二醛：10 mL 50%戊二醛，加蒸餾水定容至200 mL.

1.2 主要儀器及設備

JM-B20001型電子天平，余姚市紀銘稱重校驗設備有限公司；手提式高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2F 超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；101-2型電熱鼓風干燥箱，北京科偉永興儀器有限公司；TDL-40B型臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；SHA-BA 恒溫振蕩器，常州澳華儀器有限公司；SP-756P紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；DDS-11D電導率儀，上海儀電科學儀器股份有限公司；飛納Phenom pro臺式掃描電鏡，飛納科學儀器(上海)有限公司；Imager M2熒光顯微鏡，卡爾蔡司光學(中國)有限公司.

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化

將凍存于-40 ℃的魯氏接合酵母在YPD培養(yǎng)基中活化兩次.挑取單菌落接種于YPD液體培養(yǎng)基中，置于27 ℃培養(yǎng)48 h后經離心(6 000 g，10 min)收集菌體，并使用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)洗滌菌體3次.隨后使用磷酸鹽緩沖液重懸菌體，測定并調整菌懸液OD600，使菌懸液菌體濃度約為6.0 log CFU/mL(血球計數(shù)板計數(shù)).

1.3.2 抑菌圈的測定

使用濾紙片擴散法進行抑菌圈測定[11].取100μL菌懸液均勻涂布于YPD培養(yǎng)基上，靜置5 min.取直徑6 mm左右的無菌濾紙片分別于各植物源化合物溶液(10 mg/mL，YPD液體溶解)中浸泡10 min.然后夾取浸泡濾紙片輕置于YPD培養(yǎng)基上.隨后將培養(yǎng)基正置于27 ℃培養(yǎng)72 h后用游標卡尺測量抑菌圈直徑.以不含有植物源化合物的YPD液體作為對照組.每個樣品做3次平行測定.

1.3.3 最小抑菌濃度(MICs)的測定

采用雙倍稀釋法測定最小抑菌濃度[12].利用無菌YPD液體培養(yǎng)基將植物源化合物稀釋成系列雙倍濃度梯度的溶液，分別取10 mL置于無菌試管中.向每支試管中加入50μL菌懸液，充分混勻后置于搖床培養(yǎng)48 h(27 ℃，200 rpm).采用紫外分光光度計測定培養(yǎng)液OD600，運用t檢驗對0 h(接種后立即所測光密度值)和48 h光密度值進行比較，如果0 h與48 h測量值無顯著差異(p<0.05)，則認為該植物源化合物濃度為MIC.以不含有植物源化合物的YPD培養(yǎng)基作為對照組.每種處理做3次平行測定.

1.3.4 優(yōu)選植物源化合物對魯氏接合酵母菌生長曲線的影響

參照前人研究方法[13]，調整菌懸液OD600= 0.1并按1%的接種量接種于YPD培養(yǎng)液中.然后向培養(yǎng)液中加入優(yōu)選植物源化合物溶液(使用YPD配制)，使其終濃度分別為1/2MIC、MIC和 2MIC.將樣品置于27 ℃培養(yǎng)48 h，每隔4 h測定培養(yǎng)液OD600.樣品對照組不添加植物源化合物，空白對照組不添加菌懸液和植物源化合物.每種處理做3次平行測定.

1.3.5 優(yōu)選植物源化合物對魯氏接合酵母菌細胞膜通透性的影響

參考郭崇婷[14]的方法采用電導率儀進行細胞膜通透性測定.離心收集酵母菌體，磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)洗滌3次后用無菌生理鹽水稀釋菌體濃度至6.0～7.0 log CFU/mL.按1%的接種量取菌懸液接種至YPD液體培養(yǎng)基中，隨后向培養(yǎng)基中添加優(yōu)選植物源化合物溶液，使其終濃度分別為MIC和2MIC.將培養(yǎng)基置于搖床培養(yǎng)(27 ℃，150 rpm)，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h各取5 mL菌懸液，離心(6 000 g，10 min)取其上清液檢測電導率.以不添加優(yōu)選植物源化合物的培養(yǎng)液為對照組，各處理平行測定3次.

1.3.6 優(yōu)選植物源化合物對魯氏接合酵母菌細胞膜完整性的影響

參照黃云坡等[15]的方法，利用PI染料熒光特性探究優(yōu)選植物源化合物對魯氏接合酵母細胞膜完整性的影響.離心收集酵母菌體，磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)洗滌3次后重懸.向離心管中分別加入2 mL的菌液，分成A、B管：A管加入2 mL磷酸緩沖液(陰性對照)；B管中加入2 mL優(yōu)選植物源化合物溶液，使其終濃度為MIC.27 ℃處理2 h后分別在A、B管中加入終濃度為10μg/mL的PI溶液，4 ℃下沾染20 min.離心收集菌體(6 000 g，10 min)，磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)洗滌3次后重懸.分別取10μL A管和B管菌液滴在載玻片上，室溫半干后蓋上蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察，得到綠光激發(fā)下的圖像.各處理平行測定3次.

1.3.7 優(yōu)選植物源化合物對魯氏接合酵母菌細胞形態(tài)的影響

參考Vivek等[16]的方法采用場發(fā)射掃描電鏡解析優(yōu)選植物源化合物對魯氏接合酵母細胞形態(tài)的影響.離心收集酵母菌體，磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)洗滌3次后加入優(yōu)選植物源化合物溶液，使其終濃度分別為MIC和2MIC，27 ℃下?lián)u床處理(120 rpm)處理6 h.使用磷酸緩沖液(0.1 mol/mL，pH 7.4)洗滌菌體3次后重懸浮于2.5%戊二醛中，4 ℃過夜固定.固定后菌體使用乙醇溶液(30%、50%、70%、90%、100%，v/v)梯度逐級脫水.脫水菌體60 ℃烘干12 h后鍍金處理并置于掃描電鏡下觀察并拍照.以不含優(yōu)選植物源化合物的菌懸液為對照組，各處理平行測定3次.

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標準差的形式表示，使用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行必要統(tǒng)計分析.

2 結果與討論

2.1 植物源化合物對魯氏接合酵母的抑制活性測定

采用濾紙片擴散法對16種植物源化合物抑制魯氏接合酵母菌株LB生長的活性進行了測定.結果如表1所示，16種植物源化合物對魯氏接合酵母均有一定的生長抑制活性.麝香草酚、香荊薺酚和百里醌表現(xiàn)出較強抑制活性，抑菌圈直徑超過14 mm；肉桂醛、槲皮素、檸檬醛、原兒茶酸、丹皮酚和阿魏酸也具有一定抑制作用，抑菌圈直徑介于13～14 mm之間.其余化合物的抑制活性相對較弱，抑菌圈直徑小于13 mm.總的來說，麝香草酚抑制活性最強，沒食子酸抑制作用最弱.

表1 16種植物源化合物對魯氏接合酵母的抑菌圈直徑和最小抑制濃度

注：不同上標字母表示差異顯著(p <0.05,鄧肯檢驗)

進一步采用雙倍稀釋法檢測了16種植物源化合物對魯氏接合酵母的最小抑菌濃度,如表1所示.結果表明：在所檢測的16種物質中，麝香草酚和香荊芥酚對魯氏接合酵母具有較強的抑制效果，其MICs分別為0.062 5 mg/mL和0.125 mg/mL.槲皮素、百里醌和肉桂醛對魯氏接合酵母也有較好的抑制活性，其MICs分別為0.25 mg/mL、0.25 mg/mL和0.312 5 mg/mL.而沒食子酸對魯氏接合酵母的抑菌效果最差，MIC高達10.0 mg/mL.結合抑菌圈測定結果，可以看出麝香草酚對魯氏接合酵母的生長抑制效果最好，而沒食子酸的抑制效果最差.因此麝香草酚即為優(yōu)選出來的植物源化合物進行后續(xù)研究.

本文選取了16種植物源活性物質，其中多酚類化合物有10余種(阿魏酸、綠原酸等)，由實驗結果可知，除沒食子酸外的其他酚類物質對魯氏接合酵母有較強的抑制活性(MICs≤5 mg/m L).多酚類化合物化學結構多樣化，是生物體次級代謝產物中結構變化較多的一類化合物，其-OH與抑菌活性密切相關.此外，該類化合物也被證實可與細胞膜相互作用，破壞膜結構引起胞內物質泄露，從而起到抑菌效果[11].

在本研究中，麝香草酚、香荊芥酚、百里醌和肉桂醛對魯氏接合酵母具有較好的抑菌效果，上述物質已經被美國藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準為食品添加劑，也被歐盟委員會(EU)批準可作調料添加于食品中.前人研究也表明上述物質對一些致病菌和食品腐敗菌具有較好的抑制效果[11,17].因此，上述化合物有潛力作為天然植物源防腐劑添加于食品中，或應用于食品加工、包裝、儲存、運輸和銷售過程的抑菌處理.

2.2 麝香草酚對魯氏接合酵母菌生長的影響

麝香草酚對魯氏接合酵母測試菌株生長影響的實驗結果如圖1和圖2所示.由圖可以看出，樣品對照組(CK)在0～8 h處于遲滯期，菌體生長緩慢，其后進入對數(shù)生長期，菌體快速增殖.麝香草酚處理后，1/2MIC組生長遲滯期延長至12 h，其后進入對數(shù)生長期，這表明1/2MIC濃度的麝香草酚對魯氏接合酵母測試菌株的生長均產生了抑制作用，將兩菌株的對數(shù)生長期推遲了4 h.而MIC和2MIC處理下兩株菌的生長曲線平坦，酵母菌生長基本被完全抑制，表明麝香草酚的抑菌效果與其濃度正相關，隨著麝香草酚的濃度增高其對魯氏接合酵母生長的抑制作用逐漸增強.

圖1 麝香草酚對LB菌株生長的影響

圖2 麝香草酚對1130菌株生長的影響

2.3 麝香草酚對魯氏接合酵母細胞膜通透性的影響

微生物細胞液電導率變化是衡量微生物細胞膜通透性變化的一個重要指標[18].從圖3及圖4可以看出,未經麝香草酚處理的魯氏接合酵母菌懸液(CK)的電導率呈現(xiàn)微小上升趨勢，如LB菌液由0 h的3.08 mS/cm上升到12 h的3.15 mS/cm，1130菌液由0 h的3.17 mS/cm上升到12 h的3.32 mS/cm，這可能是由于菌體生長過程中少量活性較差的菌體細胞降解死亡引起胞內電解質外流，造成菌液電導率小幅增加.而麝香草酚處理后的魯氏接合酵母菌液電導率上升幅度明顯增大，如MIC組LB菌液電導率由0 h的3.15 mS/cm上升到12 h的3.91 mS/cm,1130菌液的電導率由0 h的3.12 mS/cm上升到12 h的3.85 mS/cm；2MIC組LB菌液的電導率進一步增加到4.24 mS/cm,1130菌液的電導率進一步增加到4.30 mS/cm.可以看出，麝香草酚對菌液電導率的影響程度依次為2MIC>MIC>CK，與麝香草酚濃度正相關.麝香草酚之所以引起菌液電導率增加，可能是由于該植物源活性成分可靶向作用于魯氏接合酵母細胞膜，與細胞膜某些結構成分相互作用，從而影響細胞膜結構，膜滲透性增大，導致胞內電解質如K+、Ca2+、Mg2+外泄增加，從而造成菌液電導率增加[19].且隨著麝香草酚濃度的提高對魯氏接合酵母細胞膜的破壞作用也隨之加強，胞內離子泄漏量逐漸增多，這與何靜如等[20]研究植物源抗菌物質β-蒎烯對沙門氏菌菌懸液電導率影響結果一致.有研究表明[21]，酚類物質能夠與細胞膜磷脂分子相作用、抑制麥角固醇的合成來改變細胞膜的結構，增強膜通透性，但該機制是否可用于解釋麝香草酚對魯氏接合酵母的抑制作用，尚需進一步研究.

圖3 麝香草酚對LB菌株細胞液電導率的影響

2.4 麝香草酚對魯氏接合酵母細胞完整性的影響

采用激光共聚焦倒置熒光顯微鏡分析麝香草酚對魯氏接合酵母細胞膜完整性的影響.本實驗在綠光激發(fā)下觀察PI染料發(fā)出的紅色熒光，從而觀察PI進入破損細胞后的狀態(tài).空白對照組在PI通道熒光顯微圖中沒有細胞被染色，即a組(圖5 中a1和a2)未出現(xiàn)紅色熒光，而經過麝香草酚MIC濃度處理2 h后的b組(圖5 中b1和b2)可以看到有明顯的紅色熒光.

a1：LB菌株熒光顯微鏡白光圖(×200)；b1：LB菌株熒光顯微鏡PI通道熒光圖(×200)

a2：1130菌株熒光顯微鏡白光圖(×200)；b2：1130菌株熒光顯微鏡PI通道熒光圖(×200)圖5 麝香草酚對魯氏接合酵母細胞膜完整性的影響

熒光顯微鏡將紫外線作為光源，在激發(fā)波長下使被檢測的物質能夠產生可檢測到的發(fā)射波長(即熒光).在避光條件下，對被檢測物進行照射，然后在熒光顯微鏡下觀察物體所在的位置及其形狀.熒光顯微鏡可以觀察到細胞內物質的分布、運輸、吸收及定位等[22].PI能夠進入死亡細胞并結合核酸發(fā)出紅色熒光，卻不能通過活細胞的細胞膜，因此PI染色程度可以反映細胞膜的破損程度和細胞死亡程度[23,24].結果表明麝香草酚MIC處理對魯氏接合酵母菌細胞膜產生了破壞作用，并最終導致菌體細胞死亡.有研究顯示[21]細胞膜是大多數(shù)外源抗菌物質的作用位點，通過改變細胞膜結構或破壞細胞膜結構導致細胞正常生長受到抑制，甚至死亡，從而達到抑菌或殺菌的目的.

基于此，結合本文2.3中實驗結果，可初步推測麝香草酚對魯氏接合酵母的作用位點也可能在細胞膜上，當麝香草酚在魯氏接合酵母細胞膜表面聚集到一定程度時，會改變細胞形態(tài)，破壞細胞膜完整性，膜上出現(xiàn)破裂或孔洞，細胞膜通透性增加，胞外PI染料可以進入胞內與核酸作用發(fā)出紅色熒光，胞內小分子物質則大量外流導致菌液電導率增加，同時這些胞內小分子物質的流失直接影響細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)，繼而干擾正常新陳代謝，最終造成細胞生長抑制或死亡.

2.5 麝香草酚對魯氏接合酵母細胞形態(tài)的影響

采用場發(fā)射掃描電鏡觀察麝香草酚處理后魯氏接合酵母1130細胞形態(tài)的變化.結果如圖6所示，空白對照組魯氏接合酵母細胞呈現(xiàn)正常的橢圓形(圖6(a))，菌體形狀飽滿，表面光滑無裂紋，細胞之間的界限清晰明了；而經麝香草酚處理后的魯氏接合酵母細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化(圖6(b)和6(c))，酵母細胞出現(xiàn)不同程度的破裂、黏結現(xiàn)象，細胞表面出現(xiàn)凹陷，細胞膜壁出現(xiàn)不同程度穿孔性損傷，細胞形態(tài)受到嚴重破壞，且破壞程度與麝香草酚處理濃度呈正相關.基于前文電導率測定及PI染色結果，可初步認為麝香草酚通過破壞魯氏結合酵母細胞膜結構抑制其生長.以場發(fā)射掃描電鏡觀察經麝香草酚處理后的魯氏接合酵母細胞形態(tài)，可以進一步驗證麝香草酚處理后魯氏接合酵母細胞膜出現(xiàn)通透孔道、內容物外泄，從而導致細胞生長抑制甚至死亡這一推斷，符合一些研究外源抑菌物質抑菌機理的學者提出的“孔道形成理論”[25].

(a)未處理1130菌株(×13 000)

(b)MIC處理1130菌株(×8 000)

(c)2MIC處理1130菌株(×8 000)圖6 麝香草酚處理后魯氏接合酵母菌的細胞形態(tài)

3 結論

本研究對16種植物源化合物抑制魯氏接合酵母活性進行了評價，篩選出對魯氏接合酵母抑制活性最強的麝香草酚，其抑菌圈直徑和最小抑菌濃度分別為15.98±0.67 mm和0.062 5 mg/mL；進一步研究表明麝香草酚可引起菌液電導率增加并破壞酵母細胞膜完整性，導致細胞膜通透性增大，胞內生物活性物質大量泄露，胞內環(huán)境紊亂，導致菌體生長抑制；最后通過掃描電鏡觀察到麝香草酚處理后魯氏接合酵母細胞出現(xiàn)黏結、破裂甚至完全破碎，驗證了細胞膜通透性和完整性研究結果.研究結果為后期天然、高效食品防腐劑開發(fā)并有效防控食品中魯氏接合酵母的污染奠定了理論基礎.本文僅從細胞形態(tài)和細胞膜結構方面對麝香草酚抑制魯氏接合酵母生長的機制進行了初步解析，后續(xù)還應從不同角度(基因表達、代謝調控、細胞凋亡等)深入探究其抑菌機制.