李清清，余旭亞，耿樹香，馬婷，寧德魯，韓本勇*

1(昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明，650500) 2(云南省林業(yè)和草原科學(xué)院，云南 昆明，650204)

核桃(JuglansregiaL.)具有很高的經(jīng)濟價值，是中國主要核桃區(qū)當(dāng)?shù)剞r(nóng)民的主要收入來源[1]。其中核桃油(walnut oil)含有豐富的脂肪酸(飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸)和天然生物活性成分(維生素E、多酚和甾醇)，日常飲食可預(yù)防癌癥和降低患心血管疾病的風(fēng)險[2-3]。核桃油不飽和脂肪酸含量在85 %以上，在儲藏過程中極易氧化，導(dǎo)致核桃油不同程度的酸敗，營養(yǎng)價值下降，顯著影響了核桃油的品質(zhì)與保質(zhì)期[4]。因此，在保證核桃油穩(wěn)定和高品質(zhì)的前提下，尋找一種方法來提高核桃油的抗氧化能力就顯得特別重要。

為了保證食用油的安全性和有效性，抑制脂質(zhì)氧化十分必要[5]。添加適量抗氧化劑可延緩脂質(zhì)氧化，延長食用油的貨架期，人工合成抗氧化劑如丁基羥基茴香醚(butyl hydroxyanisole,BHA)、二丁基羥基甲苯(butylated hydroxytoluene,BHT)和沒食子酸丙酯(propyl gallate,PG)廣泛用于食品添加劑，但其有潛在的毒性積累，安全性一直受到質(zhì)疑，因此尋找安全、無毒或低毒的天然抗氧化劑是預(yù)防脂質(zhì)過氧化的新趨勢[6]。

美藤果(PlukenetiavolubilisL.)是大戟科的一種產(chǎn)油植物，其種子富含油脂(35%～60%)和蛋白質(zhì)(27%)[7]。美藤果油(Sacha Inchi oil)含有大量的亞麻酸和亞油酸等多不飽和脂肪酸，對人體有益，能夠降低肥胖、糖尿病、過敏、老年癡呆癥、冠心病和神經(jīng)退行性等疾病的發(fā)生率，還具有護膚功效[8-10]。其維生素E、多酚等天然抗氧化劑的豐富性，讓美藤果油具有較強的氧化穩(wěn)定性[11-12]。添加人工抗氧化劑是增加核桃油氧化穩(wěn)定性的一種常用方法，其中特丁基對苯二酚(tert-butylhydroquinone,TBHQ)對核桃油的抗氧化作用較明顯[13-14]。

鑒于目前還未有用美藤果油來提高核桃油的氧化穩(wěn)定性和品質(zhì)，及其用TBHQ聯(lián)合美藤果油延長核桃油貨架期的相關(guān)研究報道。本研究以核桃油為對象，以添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02% BHT的核桃油為對照組，采用Schaal烘箱法，在不同溫度(25、35、45、55 ℃)避光條件下，篩選最佳的美藤果油比例，來提升核桃油的品質(zhì)和氧化穩(wěn)定性。并在60 ℃避光條件下，預(yù)測核桃油在添加TBHQ和美藤果油后的貨架期，為核桃油保存提供一種新策略。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃油,迪慶香格里拉舒達(dá)有機食品有限公司；美藤果油,西雙版納印奇生物資源開發(fā)有限公司。

硫代硫酸鈉、三氯甲烷、冰醋酸、KI、淀粉、無水乙醚、無水乙醇、KOH、重鉻酸鉀、H2SO4等，分析純，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；特丁基對苯二酚(TBHQ)，上海麥克林生化科技有限公司；2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)，生工生物工程(上海)股份有限公司；19烷基磺酸甲酯，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

DHG-9053A 真空干燥箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司；高效液相色譜，Water USA；FA2004N分析天平,上海箐海儀器有限公司；HHw-D6水浴鍋,金壇雙捷實驗儀器廠；DS.85 10DTH超聲波微波組合體系,上海生析超聲儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 核桃油氧化穩(wěn)定性測定

本研究采用超聲混合的方法，在核桃油里添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0、1%、5%、10%、15%和20%的美藤果油，同時添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02% 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)的核桃油作為空白對照。將油樣分別儲藏在25、35、45和55 ℃溫度下，根據(jù)GB 5009.227—2016和GB 5009.229—2016定期測定核桃油的過氧化值(peroxide value,POV)和酸價(aeid value,AV)，以此來表示溫度和不同比例美藤果油對核桃油氧化穩(wěn)定性的影響。

1.3.2 核桃油脂肪酸組成測定

核桃油脂肪酸組成采用氣相質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)法測定。將油脂加入2 mL體積分?jǐn)?shù)3%硫酸甲醇，70 ℃水浴甲酯化4 h，再加入100 μL 19烷基磺酸鈉和2 mL正己烷，萃取4 h，取正己烷相進行分析[15]。GC-MS條件[16]：HP-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，高純氦氣為載氣，流速1 mL/min。進樣口溫度250 ℃，不分流；柱溫50 ℃保持5 min，以3 ℃/min的速度升至210 ℃保持3 min。質(zhì)譜條件：EI離子源，電離能70 eV，離子源溫度230 ℃。

1.3.3 核桃油多酚含量測定

多酚提取[17]：10 g油脂溶于50 mL正己烷中，用20 mL體積分?jǐn)?shù)60%的甲醇溶液提取3次；提取液真空干燥，殘余物用一定體積甲醇進行溶解；然后用福林酚試劑測定油樣中的多酚含量，并以沒食子酸當(dāng)量表示，標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制如下：

(1)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1 mg/mL)：稱取(0.100±0.001)g沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，加入少量甲醇溶解后，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻。

(2)沒食子酸工作液：用移液管分別移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液于100 mL容量瓶中，分別用水定容至刻度，搖勻，濃度分別為10、20、30、40、50 μg/mL。

(3)用移液管移取沒食子酸工作液1 mL于刻度試管中，加入0.5 mL福林酚試劑、2 mL質(zhì)量濃度75 g/L Na2CO3溶液和6.5 mL水，渦旋振蕩1 min，70 ℃水浴中反應(yīng)30 min，用10 mm比色皿，在750 nm波長下測定吸光度。根據(jù)沒食子酸工作液的吸光度與各工作溶液的沒食子酸濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

核桃油多酚含量測定[18]：用移液管分別移取水(空白)及樣品待測液各1 mL于刻度試管中，加入0.5 mL福林酚試劑、2 mL質(zhì)量濃度75 g/L Na2CO3溶液和6.5 mL水，渦旋振蕩1 min，70 ℃水浴中反應(yīng)30 min，用10 mm比色皿，在750 nm波長下測定吸光度。若吸光度不在0.3～0.8之間，應(yīng)適當(dāng)調(diào)整待測樣品的稱樣量或稀釋待測溶液，再重新進行測定。多酚含量如公式(1)所示:

(1)

式中：X，核桃油中多酚的含量，mg/kg；C，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得多酚濃度，μg/mL；D，樣品定容后的稀釋倍數(shù)，如未進行稀釋，則D=1；E，取液定容體積，mL；m，試樣質(zhì)量，g。

1.3.4 核桃油其它理化指標(biāo)測定

維生素E含量根據(jù)GB 5009.82—2016第一法測定。水分含量根據(jù)GB 5009.236—2016測定。皂化值根據(jù)GB/T 5534—2008測定。碘值根據(jù)GB/T 5532—2008測定。

1.3.5 核桃油貨架期預(yù)測

采用SCAAL烘箱法[19]，將分別添加20%美藤果油和0.02% TBHQ的核桃油及同時添加20%美藤果油和0.02% TBHQ的核桃油樣品放在60 ℃恒溫烘箱加速氧化，定期測定其POV和AV。按照GB/T 2716—2018規(guī)定，油脂的POV上限為10 mmol/kg，AV上限為3 mg/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度和美藤果油對核桃油過氧化值和酸價的影響

油脂酸價(AV)即中和1 g油脂中游離脂肪酸所需KOH或NaOH的毫克數(shù)，過氧化值(POV)即1 kg油脂中活性氧的含量，這2項指標(biāo)反映了油脂質(zhì)量及貯藏品質(zhì)的變化，是評價食用油脂品質(zhì)的重要指標(biāo)[20-21]。不同比例美藤果油和溫度條件下，核桃油的過氧化值和酸價測定結(jié)果見圖1、圖2。

在25、35、45和55 ℃避光條件下檢測比例0、1%、5%、10%、15%、20%美藤果油及0.02% BHT(對照)對核桃油POV的影響。如圖1-a，25 ℃時20%美藤果油組的POV顯著低于0%美藤果油組和0.02% BHT組，也低于1%、5%、10%和15%美藤果油組但無顯著性。圖1-b、c，35和45 ℃時對照組的POV值顯著低于所有的美藤果油組，而20%美藤果油組的POV值比其他美藤果油組低，但無顯著性差異。如圖1-d所示，55 ℃時20%美藤果油組POV顯著低于其他比例的美藤果油組。結(jié)果表明，20%美藤果油的添加降低了核桃油的POV值，顯著提高了核桃油的氧化穩(wěn)定性。這可能與美藤果油本身具有較低的POV值(0.57～3.05 mmol/kg)和富含維生素E(177.99～208.12 mg/100 g)、多酚(6.46～8 mg/kg)等天然抗氧化劑有關(guān)[22-24]。

GB/T 2716—2018規(guī)定食用植物油的POV國家標(biāo)準(zhǔn)為<10 mmol/kg，圖1顯示，氧化穩(wěn)定性最好的20%美藤果油組在溫度25、35、45和55 ℃條件下，核桃油的保質(zhì)期分別為>43、>20、>10、>5 d，說明溫度的提高會降低油脂的保質(zhì)期，且溫度越低(≤25 ℃)，越有利于油脂的長期保存，這與文獻(xiàn)報道的純美藤果油[12]及鐵核桃油[25]的結(jié)果一致。

在25、35、45和55 ℃避光條件下檢測不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)0、1%、5%、10%、15%、20%美藤果油及0.02% BHT(對照)對核桃油AV的影響。由圖2看出，核桃油的AV隨著儲藏時間的增加而增加，但不同比例美藤果油和溫度條件下，核桃油AV無顯著性變化，但添加20%的美藤果油的核桃油AV值較其他比例的美藤果油組略低，說明美藤果油對核桃油酸值增長具有一定的抑制作用。

2.2 添加20%美藤果油對核桃油理化指標(biāo)的影響

如表1所示，添加20%美藤果油后，核桃油的各項理化指標(biāo)均符合國家標(biāo)準(zhǔn)，其碘值增加，天然生物活性成分如多酚和維生素E的含量也均有顯著性提高，分別比未添加前提高了46.25%和32.89%，皂化值、水分及揮發(fā)物顯著降低。油脂含有越多的天然活性成分，其氧化穩(wěn)定性和品質(zhì)越好[26]。研究表明δ-生育酚具有很強的抗氧化能力，γ-生育酚次之，由此可知富含δ-生育酚和γ-生育酚的美藤果油具有較強的抗氧化能力[23]。由于其抗氧化性能，美藤果油的多酚含量(6.46～8 mg/kg)和生育酚的豐富性保證了多不飽和脂肪酸的氧化穩(wěn)定性，賦予了油脂特有的風(fēng)味[24]。因此美藤果油的添加可顯著提高核桃油的氧化穩(wěn)定性及品質(zhì)。

注：*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01)。下同。

2.3 添加20%美藤果油對核桃油脂肪酸組成的影響

不飽和脂肪酸暴露在氧氣、光照、水分和溫度下，容易氧化變質(zhì)，導(dǎo)致核桃油營養(yǎng)價值下降[4]。如表2所示，其中添加前核桃油的飽和脂肪酸為9.32%，不飽和脂肪酸達(dá)到89.44%，而添加后的飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸分別為6.661%和85.32%。結(jié)果表明，添加20%美藤果油后，核桃油的飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸含量降低，但必需脂肪酸如亞麻酸含量顯著升高。多不飽和脂肪酸包括亞麻酸和亞油酸是人類必需脂肪酸，亞麻酸的增加對人類健康有好處，可預(yù)防癌癥、冠心病和高血壓等疾病，還可降低膽固醇[27]。而美藤果油是亞油酸和亞麻酸的良好來源，具有含量較高的亞麻酸(占總脂肪酸44.28%～46.45%)和亞油酸(占37.88%～40.19%)，是一種優(yōu)質(zhì)的天然不飽和植物油[24]。因此添加20%美藤果油后，核桃油的亞麻酸含量顯著提高了87.04%，并在一定程度上提高了核桃油的品質(zhì)。

2.4 0.02% TBHQ和20%美藤果油對核桃油貨架期的影響

據(jù)Arrhenius公式，油脂在60 ℃存放1 d相當(dāng)于10 ℃存放1個月(32 d)[28-29]。在溫度60 ℃避光條件下，預(yù)測分別添加20%美藤果油和0.02%TBHQ的核桃油及同時添加20%美藤果油和0.02%TBHQ的核桃油的貨架期。如圖3所示，60 ℃避光條件下，核桃油貨架期預(yù)測為<3個月，而添加20%美藤果油后，其貨架期預(yù)測為5個月左右，這可能是由于美藤果油的添加增加了核桃油中多酚和維生素E等天然活性成分的含量，從而提升了核桃油的抗氧化性。研究表明，TBHQ是最有效的抗氧化劑，其次是BHT和BHA[30-31]，且TBHQ與天然抗氧化劑(如：迷迭香提取物、茶多酚和維生素E等)復(fù)配使用，對提高棉籽油的氧化穩(wěn)定性具有良好的協(xié)同增效作用[32]。本研究添加TBHQ后，核桃油和添加20%美藤果油的核桃油的貨架期預(yù)測為>29、>33個月，結(jié)果顯示0.02% TBHQ+20%美藤果油組的核桃油的貨架期比0.02% TBHQ組延長了4個月，說明TBHQ與復(fù)合油脂中富含的VE和多酚等天然抗氧化劑具有協(xié)同增效作用，從而顯著延長核桃油的貨架期，且在貨架期間各組核桃油的AV均未超出國家標(biāo)準(zhǔn)范圍值。

3 結(jié)論

添加20%美藤果油后，核桃油的各項理化指標(biāo)均在國家標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，天然抗氧化成分包括多酚和維生素E的含量比添加前提高了46.25%和32.89%，飽和脂肪酸含量略有降低，而多不飽和脂肪酸如亞麻酸的含量增加了87.04%。在0.02% TBHQ和20%美藤果油的協(xié)同作用下，60 ℃核桃油的貨架期預(yù)測為>33個月。

本研究結(jié)果表明,20%美藤果油的添加量能夠顯著提高核桃油的氧化穩(wěn)定性和品質(zhì)，同時添加0.02% TBHQ和20%美藤果油可為延長核桃油的貨架期提供一種新策略。