李文博，羅玉龍，劉 暢，竇 露，趙麗華，蘇 琳，靳 燁*

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

蘇尼特羊身體結(jié)構(gòu)均勻，肉層厚實緊湊，具有良好的營養(yǎng)特性和食用品質(zhì)[1]。香味是較為重要的品質(zhì)，由各種有機小分子揮發(fā)性物質(zhì)共同形成，主要包括醛、醇、酮、酯、酸、烴、吡嗪、呋喃、萜、含氮和硫類化合物等[2]。針對蘇尼特羊的風味品質(zhì)，羅玉龍等[3]分析了不同部位肌肉中的揮發(fā)性風味物質(zhì)，確定背最長肌具有良好風味，代表性風味物質(zhì)有己醛、壬醛、1-辛烯-3-醇和2,3-辛二酮等。目前國家禁牧政策的施行，蘇尼特羊由傳統(tǒng)的放牧飼養(yǎng)方半放牧甚至圈養(yǎng)轉(zhuǎn)變。研究表明，飼養(yǎng)方式對羊肉的風味有較大影響，王朕朕[4]研究了限時放牧對灘羊風味沉積的影響，發(fā)現(xiàn)放牧羊肌肉中的風味前體物質(zhì)多不飽和脂肪酸含量較高，使風味物質(zhì)的沉積更加多元化，有更好的風味品質(zhì)。錢文熙[5]對比了不同飼養(yǎng)方式下灘羊風味前體物質(zhì)的差異，實驗結(jié)果表明放牧羊的膻味比舍飼羊重，原因是放牧羊中脂肪酸含量較高；但針對飼養(yǎng)方式對蘇尼特羊風味影響的研究還相對較少。本研究選擇氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測不同飼養(yǎng)方式的蘇尼特羊揮發(fā)性風味物質(zhì)和脂肪酸組成，對比不同飼養(yǎng)方式下蘇尼特羊肉風味物質(zhì)的差異，分析脂肪酸組成對風味特性的影響，確定飼養(yǎng)方式對羊肉風味的影響及原因，為今后肉品風味研究和優(yōu)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從內(nèi)蒙古烏拉特中旗蘇尼特羊育種園區(qū)隨機選擇放牧和圈養(yǎng)2 種飼養(yǎng)條件下發(fā)育正常，健康無病，公、母各占一半的12 月齡蘇尼特羊各12 只。放牧組主要以烏拉特中旗荒漠化草原的牧草為食（芨芨草、蒙古蔥、沙生冰草和堿韭等），舍飼組則以農(nóng)區(qū)草料為主食（玉米秸稈、葵盤粉等，并補充玉米精飼料和育肥料）。24 只蘇尼特羊經(jīng)宰前停飼24 h，致暈后屠宰，取背最長肌肉約50 g，置于-20 ℃冰箱冷藏待用。

三氯甲烷、氯化鈉、氫氧化鈉、三氟化硼-乙醚絡(luò)合物、無水硫酸鈉（均為分析純），甲醇、正己烷（均為色譜純），37 種脂肪酸甲酯混合標準品 美國Sigma公司；RNAiso Plus、6×loading buffer、Marker DL 2000、Premix Taq?Version 2.0、Preme ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR?Premix Ex TaqTM大連寶生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、手動式固相微萃取手柄美國賽默飛世爾科技公司；固相微萃取頭 美國Supelco公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；5810R臺式低溫冷凍離心機 德國Eppendorf公司；BG-power5000穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京百晶生物科技有限公司；水平電泳槽、凝膠成像分析儀、CFX96TM實時聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 揮發(fā)性風味物質(zhì)的測定

1.3.1.1 揮發(fā)性物質(zhì)的萃取

取解凍后的肉樣，切除筋膜，剁成肉糜，準確稱取5 g置于20 mL樣品瓶中，擰緊瓶蓋，放入60 ℃水浴鍋中，插入老化后的萃取頭，吸附40 min后取出，直接插入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進樣口，在250 ℃條件下解吸3 min。

1.3.1.2 氣相色譜-質(zhì)譜測定條件

氣相色譜條件：DB-5色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為氦氣，流速1.0 mL/min；進樣口與接口溫度為250 ℃；不分流進樣。程序升溫條件：起始溫度為40 ℃，以4 ℃/min的速率升溫至150 ℃，持續(xù)3 min；以5 ℃/min的速率升溫至200 ℃，保持1 min；以20 ℃/min的速率升溫到230 ℃，時間5 min。

質(zhì)譜條件：電子電離源；電離電壓70 eV；離子源溫度250 ℃；傳輸線溫度250 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 30～400；溶劑延遲時間1 min。

1.3.1.3 定性與定量分析

將總離子流色譜圖中的每個峰與NIST、Wiley和Menalib數(shù)據(jù)庫中已知物質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行檢索定性，以匹配度大于800為鑒定依據(jù)。物質(zhì)的定量用峰面積代替，并除以樣品質(zhì)量，單位為AU/g。

1.3.2 脂肪酸成分的測定

1.3.2.1 脂肪酸成分的提取

參考Folch等[6]的方法并進行適當調(diào)整。取解凍的肉樣，切除筋膜后剁碎，稱取5 g置于三角瓶中，加入CH3OH-CHCl3混合溶液（1∶2，V/V），加熱攪拌2 h，過夜后經(jīng)G3漏斗過濾，濾液與5 mL 2% NaCl溶液充分混合，待靜置分層，取底層液體加入適量Na2SO4溶液，濃縮蒸發(fā)得到粗脂肪，并進行脂肪皂化（粗脂肪加入5 mL 2% CH3OH-NaOH溶液，70 ℃水浴5 min）和甲酯化（皂化后的樣品加入3 mL BF3-C4H10O溶液，70 ℃水浴2 min），隨后與2 mL正己烷溶液混合，70 ℃水浴1 min，再滴加5 mL飽和NaCl溶液，靜置10 min，最后加入適量Na2SO4溶液，經(jīng)有機系濾膜過濾后置于樣品瓶中，上機測定。

1.3.2.2 氣相色譜-質(zhì)譜測定條件

氣相色譜條件：Rt-2560石英毛細管柱色譜柱（100 m×0.25 mm，0.20 μm）；程序升溫條件：以30 ℃/min的速度從60 ℃升至120 ℃，穩(wěn)定5 min；再以5 ℃/min的速率升至250 ℃，穩(wěn)定25 min。

氦氣載氣流速1.1 mL/min，分流比為20∶1，進樣口和檢測器溫度分別為250 ℃和280 ℃，進樣量1 μL。

質(zhì)譜條件：電子電離源；電離能量70 eV；離子源溫度280 ℃；傳輸線溫度250 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z30～500；溶劑延遲時間4 min。

1.3.2.3 定性與定量分析

將色譜圖中的每個峰與NIST、Wiley和Menalib數(shù)據(jù)庫中已知物質(zhì)進行對比檢索，同時結(jié)合脂肪酸標準品的出峰時間與含量進一步篩選定性。脂肪酸定量同風味物質(zhì)定量方法。

1.3.3 基因表達量的測定

1.3.3.1 引物與探針設(shè)計

脂肪氧合酶基因（lipoxygenase，LOX）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ基因（peroxisome proliferatoractivated receptorγ，PPARγ）、乙酰輔酶A羧化酶基因（acetyl-CoA carboxylase，ACC）、18S rRNA引物序列由上海生工生物工程有限公司設(shè)計與合成，序列見表1，管家基因為18S rRNA。

表1 實時熒光定量引物Table 1 Primers used for quantitative real-time PCR

1.3.3.2 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

參照王樂[7]的方法提取后，分別在260、280 nm波長處測定吸光度和濃度，而后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量，隨后將其稀釋至500 ng/μL，再按照試劑盒（Preme ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser）的方法將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并存放于-20 ℃冰箱，待用。

1.3.3.3 實時熒光定量PCR

PCR定量方法使用CFX96TMReal-Time PCR Detection System的二步法，選擇cDNA作為模板，SYBR為熒光定量染料[8]。25.0 μL反應(yīng)體系為：SYBR?Premix ExTaqTMII （TLi RNaseH Plus）12.5 μL，F(xiàn)引物1.0 μL，R引物1.0 μL，cDNA 2.0 μL，無酶水（RNase Free dH2O）8.5 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃、30 s預(yù)變性；95 ℃、5 s變性；60 ℃、30 s退火；72 ℃、30 s延伸，此過程循環(huán)35 次；72 ℃、10 min延伸。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0軟件方差分析，采用Excel軟件進行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼養(yǎng)方式對蘇尼特羊肉風味成分的影響

表2 飼養(yǎng)方式對蘇尼特羊肉中揮發(fā)性成分的影響（n=12）Table 2 Effects of different feeding methods on volatile components in Sunit sheep meat (n= 12)

續(xù)表2

由表2可知，放牧和舍飼羊分別檢測出42 種和29 種揮發(fā)性成分，其中放牧羊中檢測出醛類物質(zhì)19 種、醇類物質(zhì)11 種、酮類物質(zhì)4 種、酸類物質(zhì)2 種、烴類物質(zhì)4 種以及其他類物質(zhì)2 種；舍飼條件下的蘇尼特羊中，檢測出醛類14 種、醇類8 種、酮類1 種、酸類2 種、烴類2 種以及其他類物質(zhì)2 種。

醛類物質(zhì)是揮發(fā)性風味成分中最主要的物質(zhì)，大部分來自脂肪的氧化水解，極少部分來自糖類的美拉德反應(yīng)[9]。由表2可知，不同飼養(yǎng)方式的蘇尼特羊中檢測到的醛類物質(zhì)種類和含量最高，舍飼組檢測到14 種化合物，而放牧組中則檢測到了19 種，醛類化合物的豐富性造成了放牧與舍飼羊肉風味的差異，賦予了放牧羊肉較好的風味特性；對比2 組羊肉醛類物質(zhì)的總含量，發(fā)現(xiàn)舍飼羊肉高于放牧羊肉，這可能與脂肪氧化有關(guān)，有研究表明，舍飼蘇尼特羊的脂質(zhì)氧化程度高于放牧羊[10]，而脂肪氧化過多會導(dǎo)致肉發(fā)生劣變，對品質(zhì)有消極影響[11]。羊肉的風味是通過揮發(fā)性物質(zhì)協(xié)同產(chǎn)生的，實驗中檢測到的飽和醛占醛類物質(zhì)較大比重，大部分飽和醛在放牧蘇尼特羊肉中的含量均高于在舍飼羊肉中的含量，其中，放牧條件下的蘇尼特羊肉中己醛含量顯著高于舍飼羊肉（P＜0.05），十五醛含量顯著高于舍飼羊肉（P＜0.05）；而舍飼羊肉中的壬醛和十六醛含量均顯著高于放牧羊肉（P＜0.05）。不飽和醛中，3-羥基-丁醛在舍飼羊肉中的含量顯著高于放牧羊肉（P＜0.05）；而放牧羊肉中2-庚烯醛含量顯著高于舍飼羊肉（P＜0.05），(E,E)-2,4-癸二烯醛和(E)-2-辛烯醛含量顯著高于舍飼條件下的羊肉（P＜0.05）。苯甲醛是實驗中檢測到的芳香醛，具有苦杏仁味，對風味有消極影響，其在放牧羊肉中的含量顯著高于舍飼羊（P＜0.05）。醛類物質(zhì)閾值較低，大多具有脂肪香味，對羊肉風味有較大影響[12]。壬醛和己醛含量較高并且閾值較低，在本實驗中被認為是較為主要的揮發(fā)性風味成分，其中己醛還可以作為反映脂肪氧化程度的指標，濃度較低時，可以賦予肉品青草香和花香，當濃度過高時，則會讓肉品有腐臭的味道[13-14]?？傮w來說，放牧組羊肉的醛類揮發(fā)性化合物含量低于舍飼羊肉，可能與運動和牧草中的抗氧化物有關(guān)，使得放牧羊肉中醛類物質(zhì)對風味帶來的消極影響較低。

醇類主要由肌肉中的共軛亞油酸被脂肪氧合酶和氫過氧化酶降解產(chǎn)生[15]。實驗中檢測到的己醇、1-辛烯-3-醇、庚醇和辛醇含量較高，對羊肉風味有累積加成作用。飽和醇中，舍飼羊肉中的庚醇含量顯著高于放牧羊（P＜0.05），辛醇和己醇的含量也都高于放牧羊（P＞0.05）。不飽和醇中，低閾值的1-辛烯-3-醇在放牧羊中的含量顯著高于舍飼羊（P＜0.05），除此之外，放牧羊肉中還檢測到2-癸烯-1-醇、2-辛烯-3-醇、6-甲基-5-庚烯-2-醇和2-辛烯醇，不飽和醇的閾值較低，并且具有蘑菇香味，對風味有較大貢獻作用[16]。醇類物質(zhì)在放牧羊肉中的種類較多且含量較高，賦予了放牧羊肉較好的風味特性。

酮類是脂質(zhì)氧化和水解的另一產(chǎn)物，大多具有奶油香或水果香味，對肉品風味有積極作用[17]。在舍飼蘇尼特羊肉中檢測到1 種酮類物質(zhì)，放牧羊中檢測到4 種，其中2,3-辛二酮含量較高，有研究表明，喂食牧草的反芻動物肌肉中會存在較多該物質(zhì)，這與本實驗的結(jié)果一致[18]。

短鏈脂肪酸中的直鏈羧酸主要來自不飽和脂肪酸的水解，帶有支鏈的羧酸大多由相應(yīng)的醛衍生而成[19]。短鏈脂肪酸在羊肉中的含量較低，但對羊肉特征風味（膻味）的影響較大[20]。實驗中檢測到3 種酸類，6-壬烯酸和3-羥基月桂酸在舍飼羊中的含量比放牧羊高；壬酸含量較低，只在放牧羊中被檢測到?？傮w看，舍飼羊肉中的酸類物質(zhì)含量比放牧羊肉中的高，可能會造成舍飼羊肉的膻味較重。

烴類物質(zhì)是由脂肪酸的烷氧基均裂形成的，具有較高閾值，被認為對肉品風味的直接作用較低，但對整體風味有修飾作用[21]。由表2可知，實驗中共檢測出4 種烴類化合物，其中，放牧羊肉中的壬烷和甲苯含量顯著高于舍飼羊肉（P＜0.05）；庚烷和對二甲苯的含量則無顯著差異（P＞0.05）。

經(jīng)過含量與閾值的對比篩選，己醛、壬醛、1-辛烯-3-醇和2,3-辛二酮是蘇尼特羊肉中主要的揮發(fā)性風味物質(zhì)，這與本課題組之前的研究結(jié)果相近[3]。整體上，放牧羊肉的揮發(fā)性風味成分優(yōu)于舍飼羊肉，可以說明放牧組的風味品質(zhì)更好，分析原因是放牧羊有較大的運動量和攝入了富含脂肪酸、礦物質(zhì)和抗氧化物的天然牧草，使得放牧羊有合理的脂肪酸分布和風味物質(zhì)的沉積[22-23]。

2.2 飼養(yǎng)方式對蘇尼特羊肉脂肪酸組成的影響

表3 飼養(yǎng)方式對蘇尼特羊肉中脂肪酸含量的影響（n=12）Table 3 Effects of different feeding methods on fatty acid contents of Sunite sheep meat (n= 12)

如表3所示，放牧羊肉和舍飼羊肉中分別檢測出23 種和22 種脂肪酸，其中放牧組檢測出8 種飽和脂肪酸，6 種單不飽和脂肪酸，9 種多不飽和脂肪酸；舍飼組檢測出7 種飽和脂肪酸，6 種單不飽和脂肪酸，9 種多不飽和脂肪酸。

由表3可知，飽和脂肪酸中，棕櫚酸和硬脂酸占比較大，其中，放牧羊肉中硬脂酸的含量顯著高于舍飼羊肉（P＜0.05）；棕櫚酸含量在2 組中無顯著差異。飽和脂肪酸因分子內(nèi)不存在雙鍵而比較穩(wěn)定，不易被氧化，但不飽和脂肪酸因雙鍵的存在容易受熱氧化產(chǎn)生醛、酯、酮及烴類等具有風味特性的化合物，對肉品風味有較大影響[11]。在檢測到的單不飽和脂肪酸中，油酸含量較高，在2 組中無顯著差異；反式油酸在放牧羊肉中的含量顯著高于舍飼羊肉（P＜0.05），油酸和反式油酸可以有效降低人體血液中的膽固醇濃度，對人體健康有益[4]。多不飽和脂肪酸中，反式亞油酸在放牧羊肉中的含量高于舍飼羊肉（P＜0.05），其有利于提高人體免疫力，對動脈粥硬化、心血管疾病等有抑制作用[24]；花生三烯酸作為n-6必需脂肪酸，在放牧羊肉中的含量顯著高于舍飼羊肉（P＜0.05）；二十二碳六烯酸是n-3多不飽和脂肪酸，凝血作用較好[25]，其在放牧羊肉中的含量顯著高于舍飼羊肉（P＜0.05）。對比發(fā)現(xiàn)，飽和脂肪酸在蘇尼特羊肉中占比較大，原因是反芻動物瘤胃中微生物多樣性高，存在較多可以將不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為飽和脂肪酸的微生物[26]。綜上所述，放牧羊中16 個碳原子以下不利于人體健康的脂肪酸含量較少，對人體有益的脂肪酸成分含量較高，脂肪酸組成優(yōu)于舍飼羊，原因可能是長期攝入的牧草中富含不飽和脂肪酸，這些不飽和脂肪酸逐漸沉積到羊肉中，使羊肉有更高的營養(yǎng)價值[27]。

2.3 飼養(yǎng)方式對蘇尼特羊肉脂肪代謝相關(guān)調(diào)控基因的影響

圖1 飼養(yǎng)方式對蘇尼特羊肉中脂肪代謝調(diào)控基因表達量的影響（n=12）Fig. 1 Effects of different feeding methods on the expression levels of lipid metabolism-related genes in Sunit sheep meat (n = 12)

大多數(shù)揮發(fā)性風味化合物都是通過脂質(zhì)氧化和水解產(chǎn)生的，而脂肪氧化和水解受到多種酶和基因的調(diào)控。LOX可以催化不飽和脂肪酸氧化，進而生成一些醛酮類的小分子揮發(fā)性物質(zhì)，影響肉品的風味[28]。由圖1可知，LOX基因表達量在放牧羊肉中顯著高于舍飼羊（P＜0.05），原因可能是亞麻酸、亞油酸和花生四烯酸作為LOX參與脂肪氧化反應(yīng)的主要底物[29]，在放牧羊肉中的含量均高于舍飼羊肉，激活了LOX基因的表達。PPARγ基因在脂肪代謝中作為“調(diào)控者”，其通過激活脂肪酸氧化酶體系的表達，進而達到促進脂類代謝的作用[30]，在放牧羊和舍飼羊中的表達量無顯著差異，這與本課題組之前的研究結(jié)果相符[31]。2 組羊肉中的ACC基因表達量無顯著差異，該基因主要參與脂肪酸合成，對脂肪酸合成的第1步反應(yīng)起到限速作用，在脂肪組織中的表達量較高[32]。整體上，蘇尼特羊肉中肌內(nèi)脂肪較少，不足以造成PPARγ和ACC基因表達量的顯著性差異，但是放牧羊中LOX基因的高表達，催化了羊肉中更多的脂肪酸發(fā)生氧化，生成較多風味物質(zhì)，使其風味組成成分更加多樣，賦予放牧羊肉較為豐富的風味，這與Yang Yang等[33]的研究結(jié)果一致。

2.4 脂肪酸與特征揮發(fā)性風味物質(zhì)的相關(guān)性分析

表4 不同飼養(yǎng)方式下蘇尼特羊肉中主要脂肪酸與特征揮發(fā)性風味物質(zhì)相關(guān)性分析Table 4 Analysis of correlation between main fatty acids and characteristic volatile fl avor compounds of Sunit sheep meat in different feeding patterns

由表4可知，放牧蘇尼特羊中己醛與花生四烯酸呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與反式亞油酸呈正相關(guān)性（0.804），舍飼組己醛與這2 種脂肪酸也均呈正相關(guān)，這與Elmore等[34]研究結(jié)果相符，即己醛主要是由共軛亞油酸和花生四烯酸氧化產(chǎn)成的。壬醛也是一種主要醛類物質(zhì)，而不飽和脂肪酸的氧化可生成壬醛[12]，在相關(guān)性分析中，放牧和舍飼組中的壬醛與不飽和脂肪酸均呈正相關(guān)，這與Song Shiqing等[35]的研究結(jié)果一致。主要醇類物質(zhì)1-辛烯-3-醇在放牧羊中與花生四烯酸呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與反式亞油酸呈正相關(guān)（0.804），與舍飼羊肉呈現(xiàn)一致性，這說明1-辛烯-3-醇的產(chǎn)生主要由花生四烯酸和反式亞油酸的氧化水解引起，進一步驗證了Elmore等[36]的研究。2,3-辛二酮被認為是動物飲食牧草的指示劑，它能由綠葉植物中特殊的脂氧合酶直接生成[37]，飲食因素對其影響較大，這在一定程度上解釋了舍飼羊中沒有檢測到2,3-辛二酮。

整體上，相關(guān)性分析結(jié)果驗證了當脂肪酸含量升高時，肉中揮發(fā)性風味物質(zhì)含量也隨之增加，這反映了脂肪酸與揮發(fā)性風味物質(zhì)關(guān)系密切，其中，不飽和脂肪酸含量也成為影響風味物質(zhì)產(chǎn)生的主要因素。

3 結(jié) 論

放牧羊與舍飼羊中分別檢測出42 種和29 種揮發(fā)性成分，以醛、醇、酮、酸和烴類化合物為主。己醛、壬醛、1-辛烯-3-醇和2,3-辛二酮是較為主要的風味物質(zhì)，其中舍飼羊肉中的壬醛顯著高于放牧羊肉，1-辛烯-3-醇和2,3-辛二酮含量顯著低于放牧羊肉，總體來說，放牧羊肉的揮發(fā)性風味化合物種類較多并且有利成分含量較高，這可能賦予了其較好的風味品質(zhì)。

在脂肪酸成分測定中，放牧組和舍飼組分別檢測到23 種和22 種，并且放牧羊肉中硬脂酸、反式油酸、反式亞油酸和二十二碳六烯酸含量均顯著高于舍飼羊肉，說明放牧羊肉的脂肪酸組成豐富，有益脂肪酸含量高，有更高的營養(yǎng)價值。

放牧羊中PPARγ和ACC基因表達量高于舍飼羊，說明放牧羊肉中肌內(nèi)脂肪含量較高，解釋了脂肪酸含量較高的實驗結(jié)果；LOX基因表達量顯著高于舍飼羊，同時結(jié)合脂肪酸與風味物質(zhì)的相關(guān)性分析結(jié)果，即脂肪酸與風味成分均呈正相關(guān)，說明放牧羊肉經(jīng)LOX基因的催化，使得較多的脂肪酸被氧化生成了揮發(fā)性物質(zhì)，對羊肉風味品質(zhì)產(chǎn)生影響。