耳蝸毛細(xì)胞的細(xì)胞電生理實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展

田超永 查定軍

中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科全軍航空航天醫(yī)學(xué)內(nèi)耳研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（西安 710032）

耳蝸毛細(xì)胞（Hair Cells,HCs）位于耳蝸Corti器（螺旋器），能夠編碼不同頻率和強(qiáng)度的聲音信號(hào)，毛細(xì)胞靜纖毛彎曲，通過(guò)牽拉頂鏈而產(chǎn)生機(jī)械電流，毛細(xì)胞去極化釋放化學(xué)遞質(zhì)進(jìn)一步興奮聽(tīng)神經(jīng)纖維將電信號(hào)傳至大腦聽(tīng)覺(jué)皮層產(chǎn)生聽(tīng)覺(jué)應(yīng)答。因此了解其電生理特性對(duì)我們研究生理及病理狀態(tài)下的耳蝸信息轉(zhuǎn)導(dǎo)很有意義。本文就耳蝸毛細(xì)胞的細(xì)胞電生理實(shí)驗(yàn)現(xiàn)狀做一綜述。

1 毛細(xì)胞的分類

耳蝸HCs分為兩種，即內(nèi)毛細(xì)胞（Inner Hair Cell,IHC）和外毛細(xì)胞（Outer Hair Cell,OHC）。IHC作為聽(tīng)覺(jué)感受器，將聲信號(hào)傳遞到中樞神經(jīng)系統(tǒng)。OHC轉(zhuǎn)導(dǎo)聽(tīng)覺(jué)信號(hào)，但不能直接將信號(hào)傳入到大腦，其對(duì)聲音信號(hào)具有放大作用，可使耳蝸對(duì)聲音頻率有高度的敏感性和選擇性。

2 毛細(xì)胞的離子通道

耳蝸HCs存在多種離子通道，包括鉀離子通道、鈉離子通道以及鈣離子通道及其他離子通道等。在HCs的胞膜上除離子通道外尚存在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、動(dòng)力蛋白以及膜受體等。

2.1 鉀通道

目前對(duì)內(nèi)耳HCs鉀通道的研究已深入到了分子水平，耳蝸HCs基底部外側(cè)存在KCNQ4、KCNMA1和KCNN2（SK2或小電導(dǎo)鈣激活鉀通道）鉀通道。大量研究表明，大電導(dǎo)鈣激活鉀通道包括KCNQ4和KCNMA1，二者在離子從HCs到外淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中起重要作用[1,2]。有學(xué)者報(bào)道，KCNQ4在耳蝸OHC的底部表達(dá)[3]，其對(duì)聽(tīng)覺(jué)功能有重要作用，KCNQ4受體突變與常染色體顯性非綜合征性耳聾（autosomal dominant non-syndromic hearing loss,ADNSHL-DFNA2A）相關(guān)[2,4]，相關(guān)研究進(jìn)一步表明，KCNQ4通道可直接傳導(dǎo)OHC鉀離子到外淋巴，其突變可導(dǎo)致通道對(duì)鉀離子的傳導(dǎo)和選擇性改變。KCNMA1通道為第二個(gè)Ca2+激活鉀通道，表達(dá)于內(nèi)耳HCs中，二型絲氨酸蛋白酶TMPRSS3的表達(dá)行使其功能，但它的復(fù)雜作用機(jī)制仍未闡明[5]。有學(xué)者研究表明，由于KCNMA1通道的廣泛表達(dá)[6]，TMPRSS3直接影響KCNMA1的功能，所以其對(duì)聽(tīng)力的產(chǎn)生具有重要作用。Laurence Molina等也提出TMPRSS3缺失可導(dǎo)致內(nèi)毛細(xì)胞KCNMA1鉀通道的表達(dá)減少。有研究報(bào)道，在雞的耳蝸中，Slo（kcnma1）基因?qū)Χ丠Cs頻率敏感性的確定提供了相關(guān)信息。Surguchev等[7]報(bào)道蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）的增加引起了HCs表面Slo的成簇增加，因此，PKC活性的增加可能促進(jìn)高頻HCs上大量的離子通道聚集。小電導(dǎo)鈣激活鉀通道KCNN2表達(dá)于哺乳動(dòng)物耳蝸HCs，Tao Yu等[8]研究表明，蜂毒明肽可對(duì)其功能產(chǎn)生特異性阻斷作用，并且其與nAChRs的α9和α10亞基協(xié)同在橄欖耳蝸傳出神經(jīng)支配中產(chǎn)生抑制調(diào)控作用[9]。

2.2 鈉通道

耳蝸被證實(shí)存在許多Na+通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，包括上皮Na+通道（ENaC）、非選擇性陽(yáng)離子通道、Na+,H+-交換器（NHE-3）、Na+泵（Na+,K+-ATP酶）和Na+,K+,Cl--協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（NKCC1）。Tobias Eckrich[10]等學(xué)者研究了耳蝸IHC發(fā)育過(guò)程中鈉離子電流（Na+current,INa）對(duì)動(dòng)作電位的具體作用、通道攜帶電流的性質(zhì)和INa在低頻和高頻IHC中是否具有不同的生理特性。

2.3 鈣通道

2.3.1 電壓依賴性鈣通道

鈣結(jié)合蛋白2(Ca2+-bingding protein 2,CaBP2)表達(dá)在耳蝸HCs，特別是IHC，但在耳蝸螺旋神經(jīng)元突觸后缺少表達(dá)。Tobias Mosera等學(xué)者提出CaBP2抑制CaV1.3 Ca2+-通道的失活，同時(shí)維持CaV1.3 Ca2+-通道作用對(duì)突觸后聲音進(jìn)行編碼[11]。有學(xué)者研究的電流結(jié)果表明，CaV1.3 Ca2+-通道作為IHC主要的CaV通道有重要的作用。CaV1.3 Ca2+-通道在不同的系統(tǒng)表達(dá)符合IHC CaV通道的一系列特征[12]。膜片鉗記錄和鈣成像實(shí)驗(yàn)表明，ATP在IHC通過(guò)消耗Ca2+-ATP酶避免了胞漿Ca2+增加及鈣調(diào)蛋白依賴的CaV1.3 Ca2+-通道失活從而維持突觸內(nèi)的Ca2+流入[13]。Philippe F.Y.Vincent等[14]則報(bào)道IHCs通過(guò)Ca2+胞吐作用使帶狀突觸持續(xù)快速的將聲音編碼為神經(jīng)沖動(dòng)，這個(gè)突觸過(guò)程涉及到長(zhǎng)和短C-端亞型的CaV1.3 Ca2+-通道，它們?cè)贑a2+依賴性失活和對(duì)L-型Ca2+通道阻滯劑硝苯地平的相對(duì)敏感性的動(dòng)力學(xué)上是不同的。短C-端亞型對(duì)硝苯地平失活快，對(duì)硝苯地平敏感性低，其主要控制了易釋放池(RRP)的快速融合。長(zhǎng)C-端亞型對(duì)硝苯地平的失活慢，但對(duì)其敏感性卻高，主要調(diào)節(jié)RRP囊泡持續(xù)的胞吐。D.Monzani等[15]也報(bào)道尼莫地平對(duì)L-型鈣電流具有選擇性阻斷作用，所以其在耳蝸的相關(guān)通道病治療中具有重要作用。

2.3.2 受體操縱性鈣通道

在內(nèi)耳，鈣離子參與了耳蝸HCs的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)、適應(yīng)、調(diào)諧、受體電位的形成和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放等多種細(xì)胞活動(dòng)。耳蝸內(nèi)Ca2+濃度的穩(wěn)定對(duì)正常聽(tīng)覺(jué)功能至關(guān)重要[16]，目前對(duì)受體操縱性鈣通道在內(nèi)耳功能相關(guān)研究較少。Xie等報(bào)道ACh通過(guò)產(chǎn)生第二信使IP3使OHC內(nèi)Ca2+濃度發(fā)生變化，這在維持OHC靜息狀態(tài)下的機(jī)械運(yùn)動(dòng)和調(diào)控OHC電致運(yùn)動(dòng)方面發(fā)揮重要作用[17]。

2.4 瞬時(shí)感受器電位（Transient receptor potential,TRP）通道

TRP通道是一種非選擇性陽(yáng)離子通道，主要通過(guò)離子為Ca2+、Na+，但是不同的TRP通道對(duì)Ca2+和Na+的選擇性存在差異[18,19]。內(nèi)耳聲音的轉(zhuǎn)導(dǎo)依賴于內(nèi)、外淋巴液中鉀離子的循環(huán)，TRP通道作用為內(nèi)淋巴到HCs中鉀離子的流入，長(zhǎng)期以來(lái)一直存在爭(zhēng)議，最近研究表明，這些通道屬于TRP通道，例如TRPN1、TRPV4、TRPML3、TRPA1[1,2,20]。有研究表明TRP通道在離子流出的起始步驟可能不是唯一的陽(yáng)離子通道家族。尤其是部分關(guān)于大鼠的研究表明，TRP通道家族的基因敲除鼠不能表現(xiàn)出耳聾，表明這些通道在陽(yáng)離子從內(nèi)淋巴到HCs起始流入過(guò)程中不是唯一的類型[21]。此外，最新的關(guān)于離子通道中TRP通道家族作用的研究對(duì)每個(gè)已知的成員都做了詳細(xì)的綜述。結(jié)果表明，基因敲除鼠在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中是充足的。然而，結(jié)果同時(shí)表明，TRP通道家族不包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道[22]。另外一些研究結(jié)果表明，TRPC3和TRPC6雙基因敲除鼠在聽(tīng)覺(jué)和前庭功能中存在明顯缺失[23]。TRPC1、TRPC3、TRPC5和TRPC6基因敲除鼠也有明顯的增加。這些結(jié)果表明，TRP通道家族在內(nèi)耳功能中有重要作用。然而，闡明TRP通道家族在聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)的作用還需要更進(jìn)一步研究。

2.5 氯離子通道

Gitter等學(xué)者用膜片鉗技術(shù)驗(yàn)證了OHC上存在氯離子通道。正氯離子通道5（Chloride intracellular channel 5 protein，CLIC5）主要集中在 HCs纖毛的底部，其在小鼠的正常聽(tīng)覺(jué)和平衡中起作用。Chunhui Gu等[24]報(bào)道了MiR-183家族可調(diào)控內(nèi)耳毛細(xì)胞CLIC5的表達(dá)。Jbg小鼠缺失CLIC5后與RDX,TPRN,PTPRQ和MYO6協(xié)同在出生后發(fā)育和維持毛束底部膜細(xì)胞骨架中起重要作用[25]。

3 Prestin蛋白

2000年，Jing Zheng等[26]首次應(yīng)用抑制消減雜交PCR法報(bào)道prestin蛋白是OHC的動(dòng)力蛋白，在耳蝸IHC未發(fā)現(xiàn)Prestin蛋白表達(dá)[27]，它是耳蝸OHC電運(yùn)動(dòng)和耳蝸放大效應(yīng)的分子基礎(chǔ)[28]，同時(shí)它也是獲得性感音神經(jīng)性耳聾早期診斷的一個(gè)生化指標(biāo)[29]。Prestin有SLC26A蛋白家族的整個(gè)結(jié)構(gòu)域[30]，氯離子為其外部電壓感受器，可在OHC電位變化時(shí)驅(qū)動(dòng)OHC胞體產(chǎn)生電運(yùn)動(dòng)。Jinghan Wang等[31]報(bào)道Spag6基因敲除小鼠OHC中prestin的表達(dá)降低，而Spag6基因在外毛細(xì)胞機(jī)械感覺(jué)功能中發(fā)揮主要作用。Harasztosi等[32]將氯離子通道阻斷劑蒽甲酸加入到豚鼠耳蝸OHC和經(jīng)Prestin轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞內(nèi)后培養(yǎng)，測(cè)量其非線性膜電容（nonlinear capacitance,NLC），兩者NLC均呈可逆性、劑量反應(yīng)關(guān)系的下降，在排除PH、細(xì)胞骨架的影響后，得出氯離子通道阻斷劑可致耳蝸功能改變，且可以調(diào)控Prestin蛋白功能的結(jié)論。

4 毛細(xì)胞EPSCs記錄

HCs傳入突觸的突觸抑制作用可能是快速聽(tīng)覺(jué)適應(yīng)的基礎(chǔ)，Moser等[33]提出這種聽(tīng)覺(jué)快速適應(yīng)與快速可釋放池的耗竭現(xiàn)象相關(guān)。Elisabeth和Fuchs[34]第一次用標(biāo)準(zhǔn)的膜片鉗方法對(duì)傳入突觸的突觸小結(jié)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)記錄。電生理研究表明，IHC傳入突觸的EPSPs由非選擇性陽(yáng)離子通道介導(dǎo)，并且對(duì)AMPN受體阻滯劑敏感[35]。Lisa Grant等[36]報(bào)道，在IHC帶狀突觸，有兩種模式的囊泡釋放形成突觸后反應(yīng)，包括單相EPSCs和多相EPSCs，這進(jìn)一步闡明了聽(tīng)神經(jīng)纖維的基本特征。Cole W.Graydon等[37]報(bào)道，限制突觸前體積，帶狀突觸將會(huì)為小群的?？磕遗萃结尫艅?chuàng)造條件。而Geng-Lin Li等[38]報(bào)道，鎖相精度能夠增強(qiáng)毛細(xì)胞帶狀突觸的多量子釋放。Jacopo Magistretti等[39]報(bào)道Ca2+釋放促進(jìn)谷氨酸在突觸末梢的釋放，細(xì)胞去極化與低中度聲音頻率同步，HCs遞質(zhì)釋放的脈沖導(dǎo)致傳入纖維產(chǎn)生EPSCs，從而解釋了動(dòng)作電位活動(dòng)的鎖相模式。Chao-Hua Huang等[40]報(bào)道，IHC主要通過(guò)胞吐作用釋放囊泡，與胞吐速率和囊泡釋放的動(dòng)力學(xué)受Ca2+流入調(diào)控相一致。

5 毛細(xì)胞機(jī)械傳導(dǎo)

頂鏈(tip link)結(jié)構(gòu)存在于每一根靜纖毛和鄰近高他一頭的靜纖毛之間，其將兩根靜纖毛連在一起。頂鏈本身由兩個(gè)鈣黏連蛋白非對(duì)稱地組成[41]，其上段是CDH23(Cadherin 23)[42]，下端是PCDH15(Protocadherin15)[43]，頂鏈兩端插入靜纖毛膜內(nèi)的部分與若干蛋白形成的結(jié)構(gòu)統(tǒng)稱為機(jī)械傳導(dǎo)復(fù)合體。近幾年已經(jīng)鑒定到3個(gè)參與該復(fù)合體的蛋白。第一個(gè)是TMHS，其突變導(dǎo)致嚴(yán)重耳聾[44]；第二個(gè)是TMC，其致聾性最早被報(bào)道是2002年[45]，2011年研究發(fā)現(xiàn)，共敲除TMC1和TMC2可以導(dǎo)致機(jī)械電流的完全喪失，顯示它們可能作為一個(gè)異聚體在機(jī)械傳導(dǎo)通道復(fù)合體中起作用[46]。2014年，熊巍等研究發(fā)現(xiàn)，TMIE作為一個(gè)二次跨膜蛋白，也參與機(jī)械傳導(dǎo)復(fù)合體[47]。2018年Bifeng Pan等研究人員報(bào)道TMC1形成了脊椎動(dòng)物內(nèi)耳HCs機(jī)械感覺(jué)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道的孔道[48]。

6 光敏感通道(Channelrhodopsin-2,ChR2)

Bryan D.Monesson-Olson等[49]在毛細(xì)胞特殊myo6b啟動(dòng)子對(duì)照下應(yīng)用轉(zhuǎn)基因斑馬魚表達(dá)ChR2，然后通過(guò)水流機(jī)械刺激或用光刺激激活HCs，在體記錄斑馬魚側(cè)線的傳入神經(jīng)元。研究人員為進(jìn)一步明確OHC在耳蝸放大和頻率轉(zhuǎn)換中的作用，Wu Tao[50]等應(yīng)用ChR-2的光遺傳學(xué)方法，獲得了一種OHC生理學(xué)或臨床研究的操作技術(shù)。他們的研究結(jié)果表明ChR-2能夠成功在小鼠耳蝸OHC表達(dá)，并表達(dá)典型的光敏感性電流和去極化。隨后，Eileen L.Troconis等[51]通過(guò)激活內(nèi)耳和側(cè)線毛細(xì)胞ChR-2的表達(dá)誘發(fā)驚嚇?lè)磻?yīng)以及獲得頭部固定幼魚高速錄像，同時(shí)記錄場(chǎng)電位。

HCs上還存在許多目前仍未檢測(cè)到的其他類型的離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，有關(guān)HCs的電生理特性還需要進(jìn)一步研究，這將為我們明確許多遺傳性耳聾及其它聽(tīng)力損傷的發(fā)病機(jī)理，以及探究在細(xì)胞和分子水平上由內(nèi)耳疾病所致的耳聾和聽(tīng)力損傷的診療提供新理念、新思路。