林炯臻 綜述 謝宇杰 審校

1.廣東醫(yī)科大學研究生院，廣東 湛江 524000；2.高州市人民醫(yī)院胸外科，廣東 茂名 525200

食管癌是世界上發(fā)病率排第十一、死亡率第六的一種常見惡性腫瘤，但在我國，食管癌的發(fā)病率明顯升高，發(fā)病率高居第六，死亡率排第四[1]。我國的食管癌與西方國家的食管癌病理類型差異較大，西方國家的食管癌病理類型以食管腺癌為主，而在我國，食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)占據(jù)著食管癌的總病理類型90%以上。食管鱗癌的生存預后差，5年生存率僅為20%左右[2]。食管鱗癌治療的主要難點在于術后的復發(fā)轉(zhuǎn)移、抗放化療、無靶向治療藥物等。因此，對于食管鱗癌中具有較強的耐藥性及復發(fā)轉(zhuǎn)移能力的腫瘤細胞進行研究十分重要，而這些具有該特性的細胞群即被稱為腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSC)。

腫瘤干細胞理論是目前解釋腫瘤起源、發(fā)生及發(fā)展的公認熱門理論，該理論認為腫瘤干細胞起源于正常組織干細胞的突變失控，這些極少數(shù)細胞群具有自我更新(self-renewal)能力及分化(differentiation)潛能，奠定了腫瘤發(fā)生及腫瘤耐藥，并導致復發(fā)轉(zhuǎn)移的基礎。應用腫瘤干細胞特定的相關標志物可以鑒定及分離食管鱗癌腫瘤干細胞，其中包括CD44、ABCG2、CD90等[3]。另外，在體外應用成球培養(yǎng)等特殊細胞培養(yǎng)技術[4]及有限細胞成瘤動物模型等驗證。目前多項研究表明HIPPO/YAP 信號通路、Hedgehog 信號通路、Notch 信號通路、Wnt/β-catenin 信號通路等是維持食管鱗癌腫瘤干細胞干性特征主要的信號調(diào)控通路。

1 食管鱗癌腫瘤干細胞的研究方法

腫瘤干細胞是一種具有自我更新能力的細胞，這意味著它們可以經(jīng)過不對稱的分裂，產(chǎn)生細胞團和多種分化的子細胞，從而形成大量的其他腫瘤細胞。在不同的腫瘤中，不同的生物分子標志物被用來檢測和分離腫瘤干細胞[5-6]。首先在分選腫瘤干細胞方面，在食管鱗癌細胞的原代培養(yǎng)中，用CD44 干性標志物流式分選后的腫瘤細胞具有更強的生長、侵蝕等腫瘤干細胞干性特征[5]。乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)也是一種富集腫瘤干細胞的重要方法，有研究表明用該方法分選后的腫瘤細胞，成球培養(yǎng)的自我更新能力增強，及對化療藥物產(chǎn)生抵抗[7]。其他的細胞分子標志物例如CD90、CD271 等也被用于食管鱗癌腫瘤干細胞的分選。但單一的細胞分子標志物并不能有效地分選腫瘤干細胞，多種細胞分子標志物的聯(lián)合可以提高分選的效率。其次在檢測腫瘤干細胞方面，由于腫瘤缺乏特異性表型與腫瘤干細胞相關，使得腫瘤干細胞檢測很難被特異性檢測。目前較有說服力的是側(cè)群細胞分析法，該方法為多種腫瘤干細胞的分選提供一個很有應用價值的手段。側(cè)群細胞分析法分離出來的旁群(side population，SP)，對其功能特征以及表面標志物分子進行研究后發(fā)現(xiàn)，它們比普通腫瘤細胞具有更強的致瘤能力、對化療藥物具有更強耐藥性、更強的自我更新能力和多向分化潛能以及表達更多的腫瘤干細胞相關標志物[8]。目前在動物模型方面，有多種方法檢測腫瘤干細胞，其中在免疫缺陷鼠體內(nèi)移植腫瘤，能夠復制腫瘤干細胞啟動腫瘤發(fā)生、發(fā)展的能力，也被認為檢測腫瘤干細胞干性特征存在的重要手段。

2 HIPPO/YAP信號通路與腫瘤的主要調(diào)節(jié)機制

HIPPO/YAP 信號通路最早被發(fā)現(xiàn)于果蠅器官大小調(diào)節(jié)的信號通路中，后來也發(fā)現(xiàn)了其在哺乳動物中的多種生命活動過程中發(fā)揮著核心的作用[9]。目前認為HIPPO/YAP 信號通路主要組成包括系列的核心激酶鏈：Mst1/2、Sav1、Mob1、Lats1/2，而上游的主要分子包括Mer、Kibra 等，經(jīng)過上述的系列激酶的磷酸化作用，最終作用于下游核心效應因子Yes 相關蛋白(Yes-associated protein，YAP)；因此YAP 是該信號通路的核心組成，研究表明人類的YAP基因定位于染色體11q13 上，廣泛表達于人體各組織中。YAP 不是直接與DNA結(jié)合而發(fā)揮生物學作用的，而是在進入細胞核后與特定的轉(zhuǎn)錄因子TEAD結(jié)合后啟動系列的下游基因從而發(fā)揮惡性生物學行為。因此YAP 是一個癌基因，HIPPO/YAP 信號通路若失調(diào)后，YAP 則發(fā)揮其促進細胞增殖、轉(zhuǎn)移、抗凋亡等惡性生物學能力。此外該生物學行為亦取決于YAP在細胞的定位，若YAP被磷酸化后，其滯留于細胞質(zhì)中，因而被降解，不能進入細胞核中從而作用于下游的系列癌基因。正常生理條件下，該信號通路為激活狀態(tài)，系列的激酶作用致使磷酸化后的YAP 與細胞質(zhì)中的蛋白結(jié)合并滯留于細胞質(zhì)中，后被泛素化降解，從而抑制YAP 的下游作用的癌基因促生長、促轉(zhuǎn)移、化療耐藥等惡性生物學行為。相反，若YAP 的磷酸化水平降低，則促進YAP的表達水平上升與細胞核內(nèi)表達上升，從而發(fā)揮其促進下游基因的系列作用。

越來越多的研究表明，細胞核內(nèi)的YAP表達水平上升導致腫瘤的惡性生物行為，包括轉(zhuǎn)移、維持干性行為[9]，其中包括乳腺癌、結(jié)直腸癌[10]、肺癌[11]及食管癌[12]等。臨床預后相關方面，也有研究表明YAP的表達水平上升與腫瘤的低分化及不良預后等臨床特征相關[13]。多項研究表明HIPPO/YAP 信號通路參與了腫瘤干細胞的多種惡性生物學行為，包括上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymal transition，EMT)、耐藥性及自我更新能力等方面[14]。

EMT逐漸成為腫瘤干細胞表型的重要特征，同時也是啟動腫瘤轉(zhuǎn)移的重要生物學行為[15]。該理論認為腫瘤細胞劫持該機制，從而發(fā)展侵蝕、轉(zhuǎn)移等能力，發(fā)生EMT 轉(zhuǎn)換的癌細胞能夠穿過內(nèi)皮細胞，進入血液和淋巴系統(tǒng)，一旦到達合適的環(huán)境，就能通過一種稱為間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)變的逆轉(zhuǎn)過程恢復上皮表型。許多研究已證實YAP被激活后，YAP通過激活TEAD轉(zhuǎn)錄因子作用于下游癌基因來促進EMT 發(fā)生從而促進腫瘤細胞的侵蝕、轉(zhuǎn)移[16]。HIPPO/YAP信號通路的系列激酶或者磷酸化YAP 的失活，會導致EMT 相關分子標志物的改變，例如Vimentin 和N-cadherin 等上升，以及E-cadherin 的下降等。此外，EMT 誘導的相關轉(zhuǎn)錄因子Snail，也能結(jié)合YAP 維持腫瘤細胞的干性特征[17]。

耐藥性是惡性腫瘤治療失敗的重要原因，研究表明具有較高YAP 表達水平的腫瘤細胞對化療藥物表現(xiàn)出耐藥性，部分原因是YAP激活后腫瘤細胞獲得的腫瘤干細胞特征[18]。同樣對于腫瘤靶向治療藥物，已有研究顯示靶向RAF 和MEK 的藥物，HIPPO/YAP 信號通路激活后會導致這些治療藥物失效，因此，腫瘤干細胞的耐藥性對于臨床藥物治療腫瘤將是一項巨大的阻礙[19]。

以上各點都是HIPPO/YAP 信號通路參與各類腫瘤多種生物行為的重要過程，同時也說明了HIPPO/YAP 信號通路是維持腫瘤干細胞的多項生物特征的重要通路。也給腫瘤研究者提供一個新的方向，對于食管鱗癌腫瘤干細胞與HIPPO/YAP 信號通路作用的相關研究，可能是未來的潛在治療手段。

3 HIPPO/YAP信號通路與食管鱗癌的研究及潛在治療價值

最早有日本學者報道了YAP 是食管鱗癌的潛在癌基因，該研究表明YAP在食管鱗癌的癌組織中顯著增高，同時YAP表達水平的上升和細胞核內(nèi)的增加可促進腫瘤生長及導致不良的預后[12]。另外一項研究顯示YAP能夠上調(diào)Sox9的表達水平，而促使獲得食管鱗癌的腫瘤干性特征，而通過降低YAP表達水平或者使用YAP的特異抑制劑，則使腫瘤干細胞的特征消失[20]。再者，YAP 能夠調(diào)節(jié)EGFR 的表達水平從引起對于化療藥物的耐藥，YAP 和EGFR 在耐藥的食管癌組織中均高表達，并與腫瘤組織和細胞株中的耐藥性獲得有關，YAP-EGFR 信號通路軸可能是食管鱗癌重要的治療靶點[21]。同時對于食管癌的放療相關性研究表明，YAP 作為癌基因可通過介導CK6 引起食管癌的放療抵抗[22]。對于MicroRNA與食管癌的HIPPO/YAP信號通路的研究，CHOE 等[23]有報道過MiR-550a-3-5p 通過直接抑制YAP 作為癌基因的作用來抑制食管鱗癌腫瘤干細胞多種特征，包括癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和自我更新能力等；同樣另一項有關食管鱗癌的MicroRNA研究中，MiR-31可以通過介導HIPPO/YAP信號通路抑制LATS2 的表達和激活EMT 的轉(zhuǎn)變，MiR-31 的高表達水平在食管鱗癌中起著重要作用，可以預測食管鱗癌的復發(fā)風險和預后的新型分子標志物[24]。這些研究都充分說明了HIPPO/YAP 信號通路是維持食管鱗癌腫瘤干細胞特征的重要信號通路，研究食管鱗癌腫瘤干細胞與HIPPO/YAP 信號通路的具體機制有望成為食管鱗癌干性相關的分子標志物及潛在的治療靶點。

腫瘤干細胞理論認為靶向腫瘤干細胞治療可能是根治腫瘤的最終手段，而HIPPO/YAP信號通路提供了一個重要的食管鱗癌潛在治療靶點，但目前靶向HIPPO/YAP信號通路的研究尚處實驗室水平，臨床上仍未有相關的靶向藥物應用于治療食管鱗癌。這些包括了靶向激酶HIPK2 的治療，通過激活P53 介導的DNA 損傷而發(fā)揮潛在的治療目的[25]。直接靶向YAP的小分子抑制物，已經(jīng)在動物實驗中驗證，其中包括抑制肝癌[26]及結(jié)直腸癌[27]等腫瘤的生長。維替泊芬(Verteporfin)從前作為一種光敏劑，后被作為直接靶向YAP的抑制物，已有動物實驗應用維替泊芬阻斷YAP表達，因此可抑制肝癌的生長[15]。另外一種YAP的抑制劑CA3，通過聯(lián)合常規(guī)的食管鱗癌化療藥物5-FU，可以通過抑制腫瘤細胞增殖、誘導凋亡、減少腫瘤球的形成等來抑制腫瘤干細胞的表型[28]。VGLL4 是一種HIPPO/YAP信號通路中YAP的拮抗劑，作為少數(shù)的細胞核內(nèi)的抑制劑，VGLL4 和YAP 形成相互制衡，從而抑制其轉(zhuǎn)錄因子TEAD啟動的下游相關的癌基因作用，從而抑制腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移，有望成為新型的有效手段來治療YAP啟動的相關腫瘤[29]。此外，他汀類藥物亦可抑制腫瘤干細胞的干性特性，如腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、自我更新等。機制上的研究，他汀類藥物與YAP 的抑制作用，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的具體機制還有待進一步揭示，而這也有可能為靶向腫瘤干細胞治療提供理論依據(jù)[30]。

4 小結(jié)

總體而言，腫瘤干細胞理論的提出使科學家對于腫瘤的認識有了更多的見解。盡管對于食管癌腫瘤干細胞的研究尚有許多問題有待解答，但食管鱗癌腫瘤干細胞的自我更新、耐藥性等干性相關特征的研究已有陸續(xù)報道，這些研究表明腫瘤干細胞是腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移及治療失敗的關鍵一步。而HIPPO/YAP信號通路近年來與腫瘤干細胞的關系尤為密切，目前已證實HIPPO/YAP 信號通路通過系列關鍵激酶及其核心的YAP基因而影響下游癌基因，最終發(fā)揮其惡性生物學行為，例如EMT、化療及靶向治療藥物耐藥等。人類對于HIPPO/YAP 信號通路與食管鱗癌的聯(lián)系尚未清晰，具體的作用機制也有待進一步探究，但值得期待的是通過靶向HIPPO/YAP 信號通路有望為靶向腫瘤干細胞治療提供一個有效的手段，但這需要對該信號通路的進一步研究。對于靶向HIPPO/YAP 信號通路的藥物目前已有報道，其中包括了直接或間接靶向YAP 和TAZ 的分子抑制劑等，具體治療手段包括單獨治療或聯(lián)合放化療使用等。這些抑制劑已在食管鱗癌的細胞水平及動物實驗中取得一定的成果，但目前尚無一種靶向HIPPO/YAP 信號通路的藥物應用于臨床。食管鱗癌目前尚無一種靶向治療藥物應用于臨床，而靶向HIPPO/YAP 信號通路是食管鱗癌治療的潛在有效手段，通過充分研究闡述HIPPO/YAP 信號通路的具體機制，才能為最終的臨床應用打好基礎[31]。