劉茂林，Rippley Berry，Lee Soyoeng

(1. 杭州師范大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 311121；2. 日本國(guó)立大阪大學(xué) 免疫學(xué)前沿研究中心，日本 大阪 565-0871)

沙利度胺(thalidomide, Thal)作為一種治療免疫介導(dǎo)性疾病的免疫調(diào)節(jié)劑，被用于強(qiáng)直性脊柱炎(AS)、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)、白塞氏病(BD)等自身免疫性疾病(autoimmune disease, AID)的治療[1-3]。研究表明[4]，Thal能減少TNF-α及相關(guān)基因的表達(dá)，減少TNF-α誘導(dǎo)的NF-κβ活化，繼而減弱免疫反應(yīng)。樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells, DCs)在激發(fā)和控制獲得性免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，是啟動(dòng)、調(diào)控和維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)，溝通固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的重要橋梁細(xì)胞。許多證據(jù)表明[5]，DCs不僅是機(jī)體免疫應(yīng)答的始動(dòng)者，而且在誘導(dǎo)免疫耐受等方面發(fā)揮重要作用。DCs通過(guò)分泌細(xì)胞因子和趨化因子調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、RA、BD、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、銀屑病、哮喘等多種AID的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要調(diào)控作用[6-7]。有研究表明[5,8]，DCs已成為免疫治療的靶點(diǎn)細(xì)胞。本研究通過(guò)觀察Thal對(duì)Toll樣受體7/9(toll-like receptor 7/9, TLR7/9)介導(dǎo)的脾臟DCs分泌的AID相關(guān)細(xì)胞因子變化，探討Thal對(duì)DCs免疫調(diào)節(jié)作用的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用C57BL/6J小鼠12只，雄性，8周齡，體重20±2 g，購(gòu)自日本CLEA股份有限公司。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)日本國(guó)立大阪大學(xué)生物科學(xué)院動(dòng)物保護(hù)和使用倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑和儀器 RPMI 1640 培養(yǎng)基購(gòu)自Sigma公司。小鼠DCs分離盒、CD11c Micro Beads、免疫磁珠分選儀、分選柱購(gòu)自德國(guó)Miltenyi Biotec公司。RNA RNeasy 購(gòu)自Qiagen公司。小鼠白介素-6 (IL-6)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、干擾素-α (IFN-α)引物購(gòu)自Applied Biosystems公司。TLR9激動(dòng)劑CpG-A、CpG-B購(gòu)自Gene Design公司，TLR7激動(dòng)劑咪喹莫特(Imiquimod)購(gòu)自3M Health Care公司，Thalidomide購(gòu)自Sigma公司。小鼠IL-6、TNF-α、IFN-α ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Biolegend公司。ABI PRISM 7900 HT熒光定量PCR儀購(gòu)自Applied Biosystems公司。

1.3 小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞的制備 小鼠斷頸處死，無(wú)菌取脾臟，PBS沖洗2次后，去除脾臟表面被膜。于220目金屬濾網(wǎng)上，無(wú)菌注射器活塞反復(fù)研磨脾臟釋放細(xì)胞，采用70 μm細(xì)胞過(guò)濾器過(guò)濾細(xì)胞液，收集細(xì)胞并加入PBS稀釋至14 mL。

1.4 小鼠脾臟CD11c+樹(shù)突狀細(xì)胞的提取 采用免疫磁珠細(xì)胞分選(MACS)法收集小鼠脾臟CD11c+樹(shù)突狀細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。細(xì)胞懸液(1×108個(gè)細(xì)胞)中加入0.25 μg小鼠Fc受體阻滯劑(CD16/CD32)單克隆抗體、100 μL CD11c微珠。通過(guò)MACS分選柱收集磁性標(biāo)記細(xì)胞，所得脾臟CD11c+樹(shù)突細(xì)胞用10 mL RPMI 1640培養(yǎng)基(5×105細(xì)胞/mL)重懸后備用。

1.5 脾臟CD11c+樹(shù)突細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組 每孔100 μL 2.5×105個(gè)小鼠脾臟CD11c+樹(shù)突細(xì)胞于5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，37℃孵育2 h，設(shè)置①不加細(xì)胞的質(zhì)控孔(100 μL PBS，50 mg/mL Thal 1.5 μL)用于控制批間、批內(nèi)標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果的一致性，②Control組(100 μL 2.5×105個(gè)CD11c+樹(shù)突細(xì)胞，PBS 200 μL), ③CpG-A組(100 μL 2.5×105個(gè)CD11c+樹(shù)突細(xì)胞，1 μmol/L CpG-A 100 μL)，④CpG-B組(100 μL 2.5×105個(gè)CD11c+樹(shù)突細(xì)胞，1 μmol/L CpG-B 100 μL)，⑤Imiquimod組(100 μL 2.5×105個(gè)CD11c+樹(shù)突細(xì)胞，500 μg/mL Imiquimod 20 μL)，⑥CpG-A+Thal組(100 μL 2.5×105個(gè)CD11c+樹(shù)突細(xì)胞，1 μmol/L CpG-A 100 μL，50 mg/mL Thal 1.5 μL)，⑦CpG-B+Thal組(100 μL 2.5×105個(gè)CD11c+樹(shù)突細(xì)胞，1 μmol/L CpG-B 100 μL，50 mg/mL Thal 1.5 μL)，⑧ Imiquimod+Thal組(100 μL 2.5×105個(gè)CD11c+樹(shù)突細(xì)胞，500 μg/mL Imiquimod 20 μL，50 mg/mL Thal 1.5 μL)，各組用PBS調(diào)整至300 μL，共同培養(yǎng)24 h。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞因子水平 采用ELISA試劑盒分別檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α、IFN-α水平，各組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) 采用RNeasy試劑盒提取小鼠脾臟CD11c+樹(shù)突狀細(xì)胞的總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，所有操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。使用小鼠IL-6引物：5′-TGTGCAATGGCAATTCTGAT-3′，5′-GGTACTCCAGAAGACCAGAGGA-3′；TNF-α引物：5′-TGCCTATGTCTCAGCCTCTTC-3′，5′-GGTCTGGG CCATAGAACTGA-3′；IFN-α引物：5′-TGGTGCATGAGATGCTCCA-3′，5′-GCCGAGCCCTCTGTGCT-3′。以GAPDH為內(nèi)參對(duì)照，定量PCR過(guò)程：50 ℃2 min，95 ℃10 min，95 ℃循環(huán)40次15 s，60 ℃1 min。IL-6、TNF-α、IFN-αmRNA相對(duì)表達(dá)量采用ΔΔCt法，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Thal對(duì)小鼠脾臟樹(shù)突細(xì)胞表達(dá)IL-6的影響 單用TLR9激動(dòng)劑CpG-A、CpG-B的CpG-A組、CpG-B組，單用TLR7激動(dòng)劑的Imiquimod組的小鼠脾臟樹(shù)突細(xì)胞IL-6 mRNA和IL-6表達(dá)量均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CpG-A+Thal組、CpG-B+Thal組、Imiquimod+Thal組小鼠脾臟樹(shù)突細(xì)胞IL-6 mRNA和IL-6表達(dá)量均分別低于CpG-A組、CpG-B組、Imiquimod組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；見(jiàn)圖1、圖2。

2.2 Thal對(duì)小鼠脾臟樹(shù)突細(xì)胞表達(dá)TNF-α的影響 單用激動(dòng)劑的CpG-A組、CpG-B組和 Imiquimod組的小鼠脾臟樹(shù)突細(xì)胞TNF-α mRNA和TNF-α表達(dá)量均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CpG-A+Thal組、CpG-B+Thal組、Imiquimod+Thal組小鼠脾臟樹(shù)突細(xì)胞TNF-α mRNA和TNF-α表達(dá)量均分別低于CpG-A組、CpG-B組、Imiquimod組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；見(jiàn)圖3、圖4。

與Control組比較，**P<0.01,***P<0.001; 與各單用激動(dòng)劑組比較，### P<0.001。圖1 沙利度胺對(duì)小鼠脾臟樹(shù)突細(xì)胞IL-6 mRNA表達(dá)的影響

與Control組比較，*P<0.05,***P<0.001; 與各單用激動(dòng)劑組比較，## P<0.01, ### P<0.001。圖2 沙利度胺對(duì)小鼠脾臟樹(shù)突細(xì)胞IL-6表達(dá)的影響

與Control比較，**P<0.01,***P<0.001; 與各單用激動(dòng)劑組比較，## P<0.01, ### P<0.001。圖3 沙利度胺對(duì)小鼠脾臟樹(shù)突細(xì)胞TNF-α mRNA表達(dá)的影響

與Control組比較，**P<0.01,***P<0.001;與各單用激動(dòng)劑組比較，## P<0.01, ### P<0.001。圖4 沙利度胺對(duì)小鼠脾臟樹(shù)突細(xì)胞TNF-α表達(dá)的影響

與Control組比較，***P<0.001; 與單用激動(dòng)劑組比較，## P<0.01。圖5 沙利度胺對(duì)小鼠脾臟樹(shù)突細(xì)胞IFN-α mRNA表達(dá)的影響

與Control組比較，***P<0.001; 與單用激動(dòng)劑組比較，##P<0.01。圖6 沙利度胺對(duì)小鼠脾臟樹(shù)突細(xì)胞IFN-α表達(dá)的影響

2.3 Thal對(duì)小鼠脾臟樹(shù)突細(xì)胞表達(dá)IFN-α的影響 單用激動(dòng)劑的CpG-A組的小鼠脾臟樹(shù)突細(xì)胞IFN-α mRNA和IFN-α表達(dá)量均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CpG-A+Thal組小鼠脾臟樹(shù)突細(xì)胞IFN-α mRNA和IFN-α表達(dá)量均高于CpG-A組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；見(jiàn)圖5、圖6。

3 討論

樹(shù)突狀細(xì)胞在免疫識(shí)別、免疫應(yīng)答和免疫調(diào)控中發(fā)揮作用，決定著免疫應(yīng)答的結(jié)果及強(qiáng)度，并在疾病的免疫治療中有著深遠(yuǎn)的應(yīng)用前景[5-6]。在樹(shù)突狀細(xì)胞各亞型中，CD11c+樹(shù)突狀細(xì)胞有刺激T細(xì)胞增殖以及分泌更多的IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-α等炎性因子的作用，與AID發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9]。樹(shù)突狀細(xì)胞表面的I型跨膜蛋白—Toll樣受體(TLRs)是連接天然免疫和獲得性免疫的關(guān)鍵分子，為細(xì)胞表面重要的模式識(shí)別受體。在機(jī)體獲得性免疫中，TLRs家族成員中的TLR7、TLR8和TLR9高度同源，在細(xì)胞內(nèi)涵體中起作用，結(jié)合其配體可識(shí)別微生物的核酸。TLR7可識(shí)別咪喹啉家族低分子量的Imiquimod等，TLR9可識(shí)別細(xì)菌的CpG-DNA，激活包括機(jī)體最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞(antigen presenting cells, APC) 樹(shù)突狀細(xì)胞的免疫刺激特性，在樹(shù)突狀細(xì)胞成熟過(guò)程中起重要的調(diào)控作用[10]。

TLRs的激活及其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制一直是研究的重點(diǎn)。在特定條件下, TLRs可在細(xì)胞表面異常高表達(dá)和過(guò)度激活, 除外源性配體外，還可識(shí)別一些內(nèi)源性分子，甚至識(shí)別自身組織成分,引發(fā)機(jī)體功能紊亂，導(dǎo)致自身免疫性疾病。研究表明[11-14]，TLRs參與許多慢性炎癥和AID的發(fā)生發(fā)展。因此，TLRs 的激活必須受到嚴(yán)格的負(fù)調(diào)控，以保持免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定。隨著對(duì)TLRs信號(hào)通路認(rèn)識(shí)的逐步深入，基于TLRs及其信號(hào)通路為靶點(diǎn)的干預(yù)治療成為研究的熱點(diǎn)，為AID的治療提供理論基礎(chǔ)及新的藥物靶點(diǎn)[14-15]。

細(xì)胞因子參與免疫細(xì)胞功能紊亂和自身免疫性疾病的病理進(jìn)程。研究表明[16-19]，包括IL-6、TNF-α、IFN-α在內(nèi)的細(xì)胞因子，通過(guò)TLR7/TLR9信號(hào)通路激活的樹(shù)突狀細(xì)胞分泌，并參與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展[20-21]。IL-6、TNF-α在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，導(dǎo)致滑膜發(fā)炎、血管生成增加和淋巴管減少；IFN-α能通過(guò)調(diào)控多種免疫細(xì)胞的分化影響免疫系統(tǒng)的功能進(jìn)而促進(jìn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)生發(fā)展，通過(guò)干預(yù)IFN-α的活性有益于系統(tǒng)性紅斑狼瘡的控制，可能是治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的新靶標(biāo)。目前，細(xì)胞因子參與自身免疫性疾病是一個(gè)快速發(fā)展的生物學(xué)和臨床研究領(lǐng)域，以細(xì)胞因子、受體和信號(hào)分子為治療靶點(diǎn)的靶向制劑研究取得了較大進(jìn)展。

沙利度胺及其衍生物是以鎮(zhèn)靜、胎兒致畸、抗血管生成和抗炎為特性的免疫調(diào)節(jié)藥物(IMiD)，通常用于治療多發(fā)性骨髓瘤和骨髓增生異常綜合征(MDS)等。IMiD也被用于治療與漢森氏病/麻風(fēng)病相關(guān)的炎癥性皮膚病變。IMiD還在治療自身免疫性疾病方面顯示出應(yīng)用前景，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡和炎性腸病[22]。本研究依據(jù)樹(shù)突狀細(xì)胞的TLRs激活機(jī)制體外選擇Thal，分別與自身免疫性疾病細(xì)胞因子生成相關(guān)的TLR7/TLR9激動(dòng)劑Imiquimod、CpG-A、CpG-B配對(duì)刺激小鼠脾臟樹(shù)突狀細(xì)胞，結(jié)果顯示：與單用激動(dòng)劑組比較，Thal配對(duì)組小鼠脾臟樹(shù)突狀細(xì)胞的IL-6和TNF-α的表達(dá)量均受到明顯抑制，提示Thal對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞分泌的自身免疫性疾病相關(guān)炎性細(xì)胞因子具有較強(qiáng)的抑制作用。與細(xì)胞因子IL-6和TNF-α不同，僅CpG-A組小鼠脾臟樹(shù)突狀細(xì)胞的IFN-α表達(dá)增加，且Thal對(duì)IFN-α的分泌有協(xié)同增強(qiáng)作用。Ma等[23]在對(duì)免疫性血小板減少癥(ITP)的研究中發(fā)現(xiàn)，Thal能恢復(fù)ITP患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞的調(diào)控效應(yīng)。Millrine等[24]的研究表明，Thal衍生物雷利度胺通過(guò)靶分子Rabex-5負(fù)調(diào)控TLRs介導(dǎo)的細(xì)胞因子Ⅰ型干擾素(IFN-Ⅰ)產(chǎn)生。以上研究結(jié)果提示Thal作為IMiD的作用有可能是通過(guò)對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞TLRs介導(dǎo)的細(xì)胞因子分泌的影響得以實(shí)現(xiàn)，Thal對(duì)自身免疫性疾病以及其他血液腫瘤疾病治療的機(jī)制可能涉及樹(shù)突狀細(xì)胞TLRs介導(dǎo)的細(xì)胞因子的作用。后期的研究將以此為基礎(chǔ)進(jìn)一步展開(kāi)，探討Thal對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞TLRs信號(hào)通路靶點(diǎn)的干預(yù)作用，為自身免疫性疾病治療提供理論依據(jù)。

綜上所述，本研究初步探討了免疫調(diào)節(jié)劑Thal對(duì)小鼠脾臟樹(shù)突狀細(xì)胞免疫功能的影響，Thal對(duì)自身免疫性疾病等疾病的治療可能通過(guò)影響TLR7/9介導(dǎo)的樹(shù)突狀細(xì)胞分泌IL-6、TNF-α、IFN-α 的改變而產(chǎn)生作用。