薛海燕，操 歌，賀寶元，樊嬌嬌，薛麗歡

（1.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021；2.陜西科技大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710021）

牛乳中大約含有30 種以上具有潛在致敏性的蛋白質(zhì)，酪蛋白（casein，CN）、β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-Lg）和α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-LA）等都是牛乳的主要過敏原[1]。其中CN占牛乳中蛋白的80%左右，主要由α-CN、β-CN和κ-CN組成[2]。Anguita等[3]研究發(fā)現(xiàn)β-CN在牛乳CN中的抗原性最強(qiáng)，而α-CN是牛乳中所含有且人乳中不存在的蛋白[4]，因此CN中更易含有可以被人體免疫系統(tǒng)識別的抗原表位，容易導(dǎo)致過敏反應(yīng)。

目前已報(bào)道多種乳蛋白改性技術(shù)可以降低其過敏性。蛋白質(zhì)改性就是用生物和化學(xué)因素（如微生物發(fā)酵、酶制劑等）或物理因素（如加熱、超聲波、超高壓等）使蛋白質(zhì)的氨基酸殘基和多肽鏈發(fā)生某種變化，引起蛋白質(zhì)的大分子空間構(gòu)象和理化性質(zhì)發(fā)生改變，一定程度消除或掩埋抗原表位從而降低牛乳的致敏性，得到功能特性和營養(yǎng)特性較好的乳蛋白及其制品[5]。Bu Guanhao等[6]通過不同溫度加熱處理乳清分離蛋白后，測定其抗原性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)加熱溫度在90 ℃以下時(shí)，α-LA和β-Lg的抗原性增加，當(dāng)溫度高于90 ℃時(shí)，兩種蛋白的抗原性均顯著下降。Enomoto等[7]將麥芽五糖利用干熱法結(jié)合到α-LA上，結(jié)果顯示其抗原性降低，其中，糖與蛋白的比例和加熱溫度都不同程度地影響著抗原抑制率。廖萍等[8]將復(fù)原脫脂牛乳經(jīng)德氏乳桿菌保加利亞乳桿菌亞種進(jìn)行發(fā)酵及冷藏，用間接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法測定了凝乳中β-CN的抗原性，結(jié)果表明，復(fù)原脫脂乳發(fā)酵會降低其抗原殘留量。Lee等[9]發(fā)現(xiàn)γ射線照射牛乳中α-CN和β-Lg后，可能改變蛋白抗原表位的結(jié)構(gòu)，降低其抗原性。

超聲波是一種頻率大于20 kHz的聲波，其頻率高、波長短，不僅方向性好、功率大、穿透力強(qiáng)，還能引起空化作用和一系列的反應(yīng)效應(yīng)、乳化效應(yīng)、熱學(xué)效應(yīng)、力學(xué)效應(yīng)等，這些效應(yīng)可以改變食品的某些性質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞破壞、酶失活、病毒失活等。這種無危害、無化學(xué)添加的非熱處理手段使其在食品加工中受到了人們越來越多的關(guān)注[10]。超聲波處理在乳品中的應(yīng)用越來越廣泛，Wu Yuwei等[11]利用超聲波處理β-Lg并對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測，得出超聲處理該蛋白質(zhì)具有改善抗氧化活性的潛力。Zhang Ruihua等[12]利用高強(qiáng)度超聲對膠束CN濃縮物進(jìn)行預(yù)處理，綜合分析其結(jié)構(gòu)與溶解度、乳化性、膠凝率的變化，推測出高強(qiáng)度超聲預(yù)處理有利于膠束CN濃縮物功能特性的改變。近年來也有部分學(xué)者研究了超聲波處理對致敏食物抗原性的影響，鄧涵等[13]通過超聲波改性大豆7S蛋白，結(jié)果顯示超聲80 min可降低大豆7S蛋白致敏性。馬濤等[14]用超聲波處理三文魚并研究蛋白結(jié)構(gòu)的變化，得出過敏原蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變導(dǎo)致了其抗原性降低。Li Zhenxing等[15]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)超聲處理后的蝦肉蛋白，純化蝦原肌球蛋白免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）E的結(jié)合能力降低了80%。李雪等[16]研究0～500 W超聲處理對β-Lg抗原性的影響，結(jié)果表明該蛋白抗原性呈先升高后降低的趨勢，在400 W、25 min時(shí)達(dá)到最大，比未處理時(shí)增加了133%，500 W時(shí)抗原性有所回落，結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)的檢測結(jié)果，得出超聲處理可能改變β-Lg高級結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其過敏表位的暴露。鄒麗[17]利用輻照協(xié)同超聲對β-Lg進(jìn)行改性，并結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)變化，得出蛋白的部分抗原決定簇被破壞、蛋白抗原性降低的結(jié)論。

目前有關(guān)超聲處理對CN影響的研究多為探究蛋白結(jié)構(gòu)與理化特性方面的關(guān)系，或者單獨(dú)探究抗原性及致敏性的變化，而對CN的結(jié)構(gòu)變化與抗原性相關(guān)關(guān)系的研究較少，本研究采用不同的功率超聲處理牛乳α-CN和β-CN，并結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)的變化，綜合分析超聲處理對CN結(jié)構(gòu)和抗原性影響的相互關(guān)系。研究旨在探究利用超聲處理改變CN致敏性的現(xiàn)實(shí)意義，為降低致敏蛋白的抗原性提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

α-CN和β-CN標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司；兔抗α-CN和β-CN多克隆抗體為本實(shí)驗(yàn)室自制；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG北京博奧森生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其余化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JY92-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；電泳儀 北京百晶生物技術(shù)有限公司；UV75-18紫外-可見分光光度計(jì) 上海江岳儀器儀表有限公司；全波長掃描式多功能讀數(shù)儀 美國賽默飛世爾科技有限公司；圓二色光譜儀 英國應(yīng)用光物理公司。

1.3 方法

1.3.1 超聲處理CN

用0.01 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）將樣品配成1 mg/mL的α-CN、β-CN溶液，取25 mL于燒杯中，放入超聲波細(xì)胞破碎儀中（探頭直徑為6 mm）進(jìn)行超聲波處理。設(shè)置超聲功率分別為0（對照）、150、300、500、650 W，超聲時(shí)間為15 min。其間，脈沖工作3 s，休息8 s，整個超聲過程使用冰浴降溫，使樣品的溫度保持在10 ℃以下，超聲完畢后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 超聲處理后蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

1.3.2.1 分子質(zhì)量的分析

參照程妮[18]的方法，將超聲處理后的CN配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溶液，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)12.5%的分離膠進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），上樣量為10 μL，分析超聲處理對兩種蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的影響。

1.3.2.2 羰基含量的測定

在Wehr等[19]的方法上有所改進(jìn)。取蛋白樣品溶液3 mL于10 mL離心管中，加入1 mL的10 nmol/L鄰甲苯甲醛（2,4-dinitrophenylhydrazone，DNPH）溶液（由2 mol/L HCl配制），漩渦振蕩，充分混勻，室溫下避光放置30 min，每5 min漩渦振蕩1 次。加入1 mL終質(zhì)量濃度20 g/100 mL的三氯乙酸，離心（4 000×g、20 min），加入1 mL乙醇-乙酸乙酯（1∶1，V/V）混合溶液洗滌沉淀3 次去除多余的DNPH。將所得沉淀溶解在6 mol/L的鹽酸胍溶液（由0.01 mol/L的PBS配制）中，37 ℃放置15 min至完全溶解，4 000×g離心3 min除去不溶物。以不加蛋白樣品為空白，在370 nm波長處測量上清液的吸光度，用Bradford法測上清液中的蛋白質(zhì)含量。羰基含量按朗伯-比爾定律（式（1））計(jì)算。

式中：A為所測樣品的凈吸光度；ε為DNPH的摩爾吸光系數(shù)（22 000 L/（mol·cm））；b為比色皿厚度/mm；c為羰基含量/（nmol/g）。

1.3.2.3 自由巰基含量的測定

在Ellman's DTNB方法[20]上有所改進(jìn)。取1.0 mL的樣品溶液與4.0 mL Tris-Gly緩沖溶液（含0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L Gly、5 mmol/L乙二胺四乙酸，pH 8.0）混勻，再加入50 μL 4 mg/mL的Ellman's試劑（4.0 mg DTNB溶于1.0 mL的Tris-Gly緩沖液），37 ℃反應(yīng)15 min，在412 nm波長處測其吸光度。按式（2）計(jì)算自由巰基含量。

式中：A為吸光度；D為稀釋倍數(shù)；ρ為樣品質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.2.4 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的測定

超聲處理前后的兩種牛乳CN樣品用PBS配制成0.01 mg/mL溶液，利用圓二色光譜儀對其進(jìn)行檢測。測定條件：掃描范圍210～280 nm，石英樣品池光程為0.01 cm，掃描速率為100 nm/min，帶寬為0.5 nm，步長為1 nm。圓二色光譜測定的譜圖結(jié)果，通過系統(tǒng)自帶的分析軟件進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)相對含量分析。

1.3.2.5 疏水性的測定

用8-苯氨基-1-萘磺酸銨鹽（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid ammonium salt，ANS）熒光探針法[21]對疏水性進(jìn)行測定。取不同功率下超聲處理的0.1 mg/mL CN樣品，將20 μL 5 μmol/L的ANS溶液加入到4 mL 0.1 mg/mL的待測樣品中，混勻放置5 min，用全波長掃描式多功能讀數(shù)儀掃描樣品的熒光光譜。測定條件如下：激發(fā)波長為370 nm，掃描發(fā)射波長范圍為400～600 nm，電壓為400 V，狹縫寬度均為10 nm。用熒光強(qiáng)度表示疏水性的大小。

1.3.3 CN抗原濃度的測定

用間接競爭ELISA法測定被處理的α-CN和β-CN的殘余抗原性[22]。在間接競爭ELISA體系中待測抗原與包被抗原競爭結(jié)合抗體血清，因此被測抗原的抗原性與吸光度成反比。把α-CN和β-CN分別稀釋至最佳包被質(zhì)量濃度6.25 μg/mL和12.5 μg/mL，取100 μL包被96 孔板，4 ℃過夜；加入待測抗原（或系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)抗原用來建立標(biāo)準(zhǔn)曲線）與羊抗兔IgG預(yù)混液進(jìn)行競爭反應(yīng)1 h，對照組不加待測抗原；加入4 000 倍體積稀釋的羊抗兔IgG-HRP標(biāo)記物進(jìn)行檢測并顯色，測得吸光度，無抗原競爭時(shí)的吸光度為A0，各相應(yīng)濃度抗原抑制時(shí)的吸光度為A，以ln（A/（A0-A））為縱坐標(biāo)，以CN相應(yīng)濃度的對數(shù)（lg[α-CN]或lg[β-CN]）為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算得待測抗原濃度，反映抗原性的變化。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS軟件的單因素方差分析方法進(jìn)行顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 CN分子質(zhì)量分析結(jié)果

圖1 超聲功率對α-CN（A）、β-CN（B）分子質(zhì)量的影響Fig. 1 Effect of ultrasound power on molecular mass of α-CN (A) and β-CN (B)

從圖1A的SDS-PAGE圖可以看出，在150～650 W的超聲功率內(nèi)，α-CN電泳條帶所出現(xiàn)的位置與對照組比較無明顯變化，說明在實(shí)驗(yàn)條件下，不同的超聲功率處理對α-CN的分子質(zhì)量無明顯影響。圖1B中顯示，β-CN的電泳條帶在150～500 W的超聲功率范圍內(nèi)無明顯變化，但在650 W時(shí)其灰度明顯降低，卻未出現(xiàn)新條帶，這可能是由于超聲引起的空化效應(yīng)和局部高溫過于劇烈時(shí)，CN部分亞基發(fā)生了降解，蛋白質(zhì)分子間的氫鍵和二硫鍵等相互作用形成分子質(zhì)量大的聚合體，無法進(jìn)入凝膠中所致[23]。

2.2 CN羰基含量變化

圖2 超聲波處理功率對α-CN（A）、β-CN（B）羰基含量的影響Fig. 2 Effect of ultrasound power on carbonyl contents of α-CN (A)and β-CN (B)

蛋白質(zhì)中許多側(cè)鏈氨基酸官能團(tuán)容易氧化生成羰基衍生物，因此羰基含量通常被認(rèn)為是判斷蛋白氧化的指標(biāo)之一，一般來說，羰基含量越高，氧化程度越大[24]。從圖2中可以看出，當(dāng)超聲功率增加至650 W時(shí)，α-CN和β-CN的羰基含量分別增加了12%和15%。說明超聲處理在一定程度上會使得α-CN和β-CN被氧化，且隨著超聲功率的增加，被氧化程度也隨之增加。這是因?yàn)棣?CN和β-CN含有較多的無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，該類蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是疏松無序，超聲的空化效應(yīng)會產(chǎn)生局部高溫，會導(dǎo)致蛋白中的還原性氨基酸等被氧化形成羰基[25]。

2.3 自由巰基含量變化

圖3 超聲功率對α-CN（A）、β-CN（B）自由巰基含量的影響Fig. 3 Effect of ultrasound power on free sulfhydryl group contents of α-CN (A) and β-CN (B)

蛋白質(zhì)中重要的官能團(tuán)之一便是巰基基團(tuán)，巰基相互交聯(lián)形成二硫鍵以維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[26]。導(dǎo)致自由巰基含量變化的原因有二，一方面超聲波作用過程中氣泡破裂會產(chǎn)生高強(qiáng)度的振動波和剪切力，造成α-CN和β-CN結(jié)構(gòu)改變，使得α-CN和β-CN內(nèi)部的自由巰基暴露到蛋白表面，導(dǎo)致自由巰基含量增多；另一方面，超聲波的空化效應(yīng)會使水分子分解成高活性的氫自由基和羥自由基，并氧化掉暴露到蛋白表面自由巰基，使得自由巰基含量減少[27]。從圖3可以看出，α-CN和β-CN在超聲條件到達(dá)500 W時(shí)的自由巰基含量較對照組分別降低了22.3%和23.8%，但在650 W時(shí)，α-CN和β-CN的自由巰基含量比對照組分別下降了16.9%和16.7%，比500 W時(shí)略有回升。這是由于超聲功率在小于500 W時(shí)，自由巰基暴露速率低于其被氧化的速率，因此總含量減少；而功率達(dá)到650 W時(shí)，超聲效應(yīng)過于劇烈導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)更加無序松散，二硫鍵更易遭到破壞，此時(shí)產(chǎn)生自由巰基的速率大于其被氧化的速率，最終導(dǎo)致α-CN和β-CN自由巰基含量回升。

2.4 二級結(jié)構(gòu)相對含量的變化

表1 不同超聲波功率對α-CN二級結(jié)構(gòu)各組分相對含量的影響Table 1 Effect of ultrasound power on secondary structure content of α-CN

表2 不同超聲波功率對β-CN二級結(jié)構(gòu)各組分相對含量的影響Table 2 Effect of ultrasound treatment power on secondary structure content of β-CN

通過在線軟件對超聲處理后的α-CN和β-CN圓二色光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到兩種CN二級結(jié)構(gòu)相對含量結(jié)果如表1、2所示，其中，近60%的二級結(jié)構(gòu)是以α-螺旋、β-折疊的形式存在，這些都是蛋白的彈性結(jié)構(gòu)；β-轉(zhuǎn)角相對含量是反映蛋白結(jié)構(gòu)松散性的指標(biāo)之一[28]；無規(guī)卷曲對蛋白構(gòu)象有著重要作用。在α-CN和β-CN二級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋和無規(guī)卷曲相對含量最高，分別為36%～39%和30%～32%，β-轉(zhuǎn)角相對含量約為16%～19%，而β-折疊相對含量最少，約為14%～17%。從表中顯著性分析可看出，α-CN和β-CN的α-螺旋結(jié)構(gòu)經(jīng)超聲處理后與對照組相比顯著性減少，這是由于超聲波空穴作用產(chǎn)生的局部高溫使得螺旋結(jié)構(gòu)部分展開或斷裂[23]；β-轉(zhuǎn)角相對含量隨著超聲功率的增加總體呈現(xiàn)出顯著性增長趨勢，該現(xiàn)象會增加蛋白的比表面積，一般來說蛋白的抗原結(jié)合位點(diǎn)多存在于β-轉(zhuǎn)角區(qū)域，該結(jié)果或?qū)?dǎo)致抗原表位的暴露。在超聲功率小于500 W時(shí)，α-CN和β-CN的無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的相對含量隨著超聲功率的增強(qiáng)而增加，推測是剪切效應(yīng)導(dǎo)致CN分子結(jié)構(gòu)變得無序松散；超聲功率達(dá)到650 W時(shí)，相對含量卻開始下降，該現(xiàn)象與自由巰基含量的變化結(jié)果一致，無規(guī)卷曲相對含量變化或?qū)?dǎo)致蛋白功能實(shí)施和構(gòu)象發(fā)生改變。β-折疊相對含量在功率小于500 W時(shí)，隨著超聲功率的增加呈現(xiàn)顯著性降低趨勢，α-CN和β-CN分別減少了21.0%和27.4%，功率達(dá)到650 W時(shí)卻分別減少了12.7%和19.5%，比500 W時(shí)略有回升，這表明在超聲處理過程中，CN的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了去折疊變化，一定程度破壞了蛋白的彈性結(jié)構(gòu)；當(dāng)功率到達(dá)650 W時(shí)，過于劇烈的空化效應(yīng)導(dǎo)致蛋白的結(jié)構(gòu)更加扭曲復(fù)雜，產(chǎn)生新的折疊結(jié)構(gòu)。綜上所述，超聲波處理會使得CN的空間結(jié)構(gòu)內(nèi)部發(fā)生變化，同時(shí)，結(jié)構(gòu)的改變或?qū)?dǎo)致蛋白抗原性發(fā)生改變。

2.5 CN的疏水性變化

圖4 不同超聲功率下α-CN（A）、β-CN（B）的熒光光譜Fig. 4 Fluorescence spectra of α-CN (A) and β-CN (B) treated with different ultrasonic powers

表3 不同超聲波功率對CN疏水性檢測最大熒光強(qiáng)度的影響Table 3 Effect of ultrasonic power on maximum fluorescence intensity for hydrophobicity of caseins

圖4是由ANS檢測法得到的兩種CN不同超聲處理?xiàng)l件下的熒光光譜圖。蛋白質(zhì)疏水性基團(tuán)的相互作用力是維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的重要的作用力，通過檢測蛋白質(zhì)表面疏水性的變化就可以了解蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的變化。目前，應(yīng)用最為廣泛的方法是熒光探針法，在一定范圍內(nèi)，最大熒光強(qiáng)度與蛋白表面的疏水性呈線性關(guān)系[29]。結(jié)合表3可以看出，經(jīng)過不同超聲功率處理后，α-CN的最大熒光強(qiáng)度在超聲功率小于500 W時(shí)顯著增強(qiáng)，結(jié)合二級結(jié)構(gòu)的變化，說明當(dāng)二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋結(jié)構(gòu)向無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變時(shí)，分子結(jié)構(gòu)變得松散，包埋在內(nèi)部的疏水性區(qū)域外翻到蛋白分子表面，與疏水性探針ANS結(jié)合，使熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，此時(shí)表面疏水性增加；在功率為650 W時(shí)略有降低，這是由于隨著超聲波處理強(qiáng)度進(jìn)一步增大，局部高溫和劇烈的空化效應(yīng)使蛋白分子內(nèi)部的電荷分布發(fā)生改變，導(dǎo)致α-CN的內(nèi)部基團(tuán)相互靠近交聯(lián)，且結(jié)合β-折疊的增多可知此時(shí)蛋白結(jié)構(gòu)再次發(fā)生折疊，使分子表面的疏水性氨基酸重新掩埋到分子內(nèi)部無法與熒光探針結(jié)合[30]，此時(shí)熒光強(qiáng)度降低，表明疏水性減弱；β-CN在功率小于500 W時(shí)與α-CN疏水性變規(guī)律一致，而當(dāng)超聲功率為650 W時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，但其吸收峰發(fā)生了藍(lán)移現(xiàn)象，結(jié)合SDS-PAGE圖分析結(jié)果，可能是由于在此超聲條件下β-CN的蛋白內(nèi)部聚集，產(chǎn)生了大分子物質(zhì)使得熒光強(qiáng)度增大。

2.6 CN抗原性的變化

圖5 超聲功率對α-CN（A）、β-CN（B）抗原性的影響Fig. 5 Effect of ultrasonic power on antigenicity of α-CN (A) and β-CN (B)

如圖5所示，α-CN的抗原性總體大于β-CN的抗原性，兩種蛋白隨著在0～500 W時(shí)均呈現(xiàn)上升趨勢，在功率為500 W時(shí)，抗原性分別上升了41.1%和71.7%。在功率達(dá)到650 W時(shí)，α-CN和β-CN抗原性有所下降，但仍高于對照組的抗原性，結(jié)合游離巰基和羰基含量的變化以及二級結(jié)構(gòu)無規(guī)卷曲和β-折疊相對含量變化綜合分析，可以推測CN的抗原性或與β-螺旋相對含量呈負(fù)相關(guān)，與無規(guī)卷曲相對含量呈正相關(guān)，且與其氨基酸側(cè)鏈修飾也有一定關(guān)聯(lián)。

3 討 論

超聲處理在乳制品加工中運(yùn)用廣泛，但在乳品致敏蛋白方面的研究卻較少。李雪[16]、馮景麗[28]等的研究結(jié)果表明超聲波處理會使蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，且對致敏蛋白的抗原性產(chǎn)生一定的影響，因此通過超聲處理改變致敏蛋白結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改變其抗原性的方法是可行的。本研究對牛乳的α-CN和β-CN進(jìn)行不同功率的超聲處理，通過SDS-PAGE、表面羰基及巰基含量測定以及二級結(jié)構(gòu)和疏水性分析，探究CN結(jié)構(gòu)是否會影響抗原性，為研究超聲處理是否可以改變過敏蛋白的致敏性提供理論參考。

本研究中，隨著超聲功率的增加，α-CN的分子質(zhì)量并沒有顯著變化，這與Stanic-Vucinic等[31]關(guān)于超聲對β-Lg結(jié)構(gòu)影響研究中的結(jié)果相似，但β-CN在超聲功率為650 W時(shí)發(fā)生了蛋白聚集等現(xiàn)象，導(dǎo)致條帶變淺。α-CN和β-CN羰基含量都有不同程度的增加，說明超聲在一定程度上導(dǎo)致了CN發(fā)生氧化。巰基含量的減少與氧化有關(guān)，其中，α-CN內(nèi)部折疊發(fā)生改變，導(dǎo)致巰基基團(tuán)的暴露或掩埋；同時(shí)超聲波的空化效應(yīng)會使水分子分解成高活性的氫自由基和羥自由基，與暴露到蛋白表面自由巰基發(fā)生氧化反應(yīng)，最終使得α-CN和β-CN的自由巰基含量減少。

隨著超聲功率的增加，兩種CN的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了非常復(fù)雜的改變，圓二色光譜結(jié)果顯示：隨著超聲功率的增加，α-CN和β-CN中的α-螺旋相對含量持續(xù)減少，β-轉(zhuǎn)角相對含量呈現(xiàn)增多趨勢，無規(guī)卷曲相對含量先增多后降低，在500 W時(shí)達(dá)到最大，β-折疊相對含量則呈現(xiàn)與無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)相反的變化規(guī)律。表明超聲功率會導(dǎo)致蛋白的彈性結(jié)構(gòu)減少，無序性增強(qiáng)，蛋白比表面積增大，從而暴露出一些原本掩埋的抗原表位[32-33]。

α-CN結(jié)構(gòu)中只有兩個疏水區(qū)，而β-CN是所有CN中疏水性最強(qiáng)的蛋白[34]，疏水性的變化與其二級結(jié)構(gòu)的變化相關(guān)，結(jié)果顯示超聲功率小于500 W時(shí)，隨著超聲功率的增大，兩種蛋白疏水性均有不同程度的增強(qiáng)，二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)卷曲相對含量增加，結(jié)構(gòu)松散、疏水區(qū)暴露；在650 W的功率下，α-CN的疏水性降低，這是由于過于劇烈的空化效應(yīng)導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)的卷曲變化使分子表面的疏水性氨基酸重新掩埋到分子內(nèi)部，最終疏水性變?nèi)酰@與Silva等[35]利用超聲處理改變蛋白質(zhì)溶液的理化及結(jié)構(gòu)特性的疏水性研究結(jié)論相似；而β-CN經(jīng)處理后疏水性遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于未處理蛋白，這是由于劇烈的超聲波除去了CN膠粒的表面極性靜電，使得疏水區(qū)域增多，疏水性增強(qiáng)，進(jìn)而易產(chǎn)生交替聚集[36]，這與β-CN的分子質(zhì)量變化規(guī)律一致。

CN抗原性的結(jié)果變化趨勢則與二級結(jié)構(gòu)中的無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的含量變化規(guī)律一致，與β-折疊結(jié)構(gòu)的含量變化規(guī)律相反。結(jié)合二級結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果，這是由于在超聲功率小于500 W時(shí)，超聲的空化效應(yīng)導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，無規(guī)卷曲相對含量的增加和β-折疊相對含量的減少使得蛋白結(jié)構(gòu)松散無序，導(dǎo)致蛋白分子表面的抗原表位暴露到分子表面，部分隱性過敏表位變?yōu)轱@性，更易與抗體特異性結(jié)合，抗原性升高。在功率達(dá)到650 W時(shí)，α-CN和β-CN抗原性有所下降，但仍高于未處理時(shí)的抗原性，結(jié)合二級結(jié)構(gòu)的無規(guī)卷曲的增加和β-折疊含量變化分析，這是由于CN的結(jié)構(gòu)再次發(fā)生部分折疊，無序網(wǎng)狀蛋白發(fā)生層片化，使得部分暴露出的抗原表位再度被包埋；再綜合其自由巰基含量和羰基含量的變化結(jié)果綜合分析，推測部分肽段的抗原表位在650 W的高強(qiáng)度超聲功率下，因超聲空化效應(yīng)產(chǎn)生的局部高溫而失活或被氧化，使抗體與抗原表位的結(jié)合率減少，最終導(dǎo)致抗原性降低。李雪[37]在研究超聲波對β-Lg蛋白的抗原性影響時(shí)得到過類似結(jié)果。

綜上所述，經(jīng)過超聲處理后的α-CN和β-CN均發(fā)生了一定程度的氧化；蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了尤為復(fù)雜的變化，最終使得蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致CN疏水性變強(qiáng)，且原本緊密的彈性結(jié)構(gòu)變得空洞化、片層化；無序松散的蛋白結(jié)構(gòu)造成抗原表位發(fā)生一定程度的暴露或包埋，導(dǎo)致其抗原性發(fā)生改變。隨超聲功率增大，兩種CN抗原性先增大后略減小，與疏水性的變化一致，與β-折疊結(jié)構(gòu)相對含量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，與無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)相對含量呈正相關(guān)。但CN的結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，蛋白致敏性結(jié)果并非單因素所致。因此，超聲處理是否會引起致敏性的改變，還需進(jìn)一步結(jié)合模擬腸胃消化及采用對牛乳過敏患者的血清（含IgE）進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)過敏原檢測等深入探討。