薯蕷粥對(duì)2型糖尿病模型小鼠腸道菌群的影響

謝勇 林中景 葛莉 龐書勤 蔡靜雯

流行病學(xué)資料顯示，2型糖尿病患病人數(shù)正在全世界范圍內(nèi)呈逐步上升趨勢(shì)，病人總數(shù)高達(dá)1億以上，而中國已成為世界第一糖尿病大國?，F(xiàn)代研究認(rèn)為，2型糖尿病屬于常見的慢性綜合性疾病，治療藥物往往難以避免地會(huì)對(duì)人體造成一些副作用。如控制不當(dāng)，2型糖尿病可能發(fā)展并常伴有肝腎功能損害、白內(nèi)障等眼病、心腦血管疾病等并發(fā)癥。由于2型糖尿病患者糖脂代謝紊亂，體內(nèi)自由基生成增加、清除能力受損，并發(fā)癥的發(fā)生與體內(nèi)抗氧化能力與自由基之間的失衡密切相關(guān)，因此，尋求一種既能降低血糖、血脂又兼有抗氧化作用的膳食療法，對(duì)2型糖尿病并發(fā)癥的預(yù)防顯得十分重要。

薯蕷粥是藥膳中的經(jīng)典食療方，出自清代張錫純的《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》，“治陰虛勞熱，或喘，或嗽，或大便滑瀉，小便不利，一切羸弱虛損之證。”薯蕷粥的食材是生懷山藥，山藥具有滋陰清熱、益氣健脾、益胃補(bǔ)腎的功效，對(duì)糖尿病患者能夠發(fā)揮標(biāo)本兼治、益氣養(yǎng)陰、調(diào)節(jié)臟腑氣血陰陽的作用，從而預(yù)防糖尿病性中風(fēng)的發(fā)生?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，懷山藥多糖具有明顯的降血糖作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，懷山藥在一定程度上還能降低血清脂質(zhì)和總膽固醇的水平，預(yù)防血管的脂肪沉積，保持血管的彈性，防止動(dòng)脈粥樣硬化過早發(fā)生，保護(hù)糖尿病患者的微血管。

人體腸道擁有超過1000種微生物，腸道菌群也有“新器官”的稱謂，其結(jié)構(gòu)或分布的改變直接影響人體健康。研究表明，2型糖尿病患者腸道菌群的表現(xiàn)有一定差異，患者體內(nèi)厚壁菌門（Firmicutes）與擬桿菌門（Bacteroidetes）兩者比值相對(duì)升高。這充分說明腸道菌群和糖尿病有著緊密的聯(lián)系，可以考慮通過控制菌群數(shù)量的變化來改善人體健康狀況。例如，調(diào)控?cái)M桿菌、雙歧桿菌、柔嫩梭菌和乳桿菌的變化，或?qū)⒊蔀檎{(diào)理糖尿病的新醫(yī)學(xué)靶點(diǎn)；透過腸道菌群與糖尿病的關(guān)系，更清晰地研究微生物的結(jié)構(gòu)和功能及其影響人體慢性疾病的機(jī)理。

本研究通過建立動(dòng)物模型，從薯蕷粥調(diào)控腸道菌群的角度出發(fā)，旨在探究薯蕷粥對(duì)2型糖尿病小鼠腸道微生物多樣性的影響，為薯蕷粥調(diào)控2型糖尿病的作用提供新的研究視角與思路。

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.薯蕷粥。將新鮮懷山藥按經(jīng)典方《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》制成薯蕷粥，經(jīng)真空冷凍干燥后得到薯蕷粉末，按照不同劑量設(shè)置加入不同克數(shù)的薯蕷粉末并溶于一定量的水，攪拌溶解后放至冰箱冷藏保存。

2.實(shí)驗(yàn)試劑。鹽酸二甲雙胍片，北京京豐制藥集團(tuán)有限公司；鏈脲佐菌素（STZ），上海麥克林；檸檬酸鈉（食品級(jí)）和無水檸檬酸（食品級(jí)），濰坊英軒實(shí)業(yè)有限公司。

3.高脂飼料。高脂飼料（D12492）由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心加工提供，配方組成包括酪蛋白、玉米淀粉、蔗糖、麥芽糖糊精、纖維素、豆油、氯化鈉、維生素、氨基酸和礦物質(zhì)等。飼料成分：膽固醇為300.8mg/kg，碳水化合物質(zhì)量比為26.3%，脂肪質(zhì)量比為34.9%。

4.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。昆明（KM）種小鼠70只，雄性，體重范圍18-22g，清潔級(jí)，購自福建省福州市吳氏動(dòng)物中心；動(dòng)物飼養(yǎng)溫度為20-25℃；實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處理符合動(dòng)物倫理學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.制備受試樣品溶液。（1）配制薯蕷粥受試樣品溶液。本實(shí)驗(yàn)薯蕷粥受試樣品溶液設(shè)置為低、中、高3個(gè)劑量組。低劑量組準(zhǔn)確稱取4.5g薯蕷粉末溶于50mL蒸餾水，設(shè)置給藥濃度為1.125g/kg；中劑量組準(zhǔn)確稱取9g薯蕷粉末溶于50mL蒸餾水，設(shè)置給藥濃度為2.25g/kg；高劑量組準(zhǔn)確稱取13.5g薯蕷粉末溶于50mL蒸餾水，設(shè)置給藥濃度為3.375g/kg。將樣品溶液攪拌均勻后倒入血清瓶中，放入冰箱冷藏留待使用，使用前加熱搖勻，各劑量組每日灌胃量均為0.5mL。（2）陽性對(duì)照樣品的配制。精確稱取0.5g鹽酸二甲雙胍片，研磨搗碎加入燒杯中，加入100mL蒸餾水?dāng)嚢柚寥芙馔耆?，即可獲得濃度為0.06g/kg的陽性樣品。蓋上保鮮膜常溫保存，使用前攪拌均勻。（3）鏈脲佐菌素（STZ）溶液的配制。取0.58g檸檬酸溶于30mL蒸餾水中配置成A液，取0.88g檸檬酸鈉溶于30mL蒸餾水中配置成B液，將A、B兩種溶液混合，通過藍(lán)色石蕊試紙測(cè)量溶液pH值，調(diào)節(jié)pH值在4.4左右，即為所需鏈脲佐菌素緩沖溶液。稱量0.255gSTZ，用23mL鏈脲佐菌素緩沖溶液溶解，即制成138.6mg/kg的鏈脲佐菌素溶液，要求在30分鐘內(nèi)注射完畢，避免失活。

2.糖尿病模型鼠建立及分組給藥。從70只雄性小鼠中隨機(jī)選取10只小鼠記作空白組，自由飲食飲水，采用正常基礎(chǔ)飼料。剩下60只用小鼠用高脂飼料連續(xù)飼養(yǎng)4周之后，禁食不禁水約12h，通過腹腔注射的方式注射一定濃度的STZ溶液，誘導(dǎo)建立2型糖尿病模型。3天后，觀察小鼠毛發(fā)色澤、精神狀態(tài)、飲食和尿量，進(jìn)行尾尖剪尾取血，采用羅氏血糖儀進(jìn)行測(cè)量，如隨機(jī)血糖平均值大于11mmolL-1時(shí)，則認(rèn)定為造模成功。隨機(jī)分配造模成功小鼠，設(shè)置空白組、模型組、二甲雙胍組和薯蕷粥組（低、中、高劑量），每組10只，分盒分開進(jìn)行飼養(yǎng)。空白組和模型組小鼠每日灌胃0.5mL蒸餾水，二甲雙胍組小鼠每日灌胃0.5mL鹽酸二甲雙胍溶液，薯蕷粥各組每日灌胃0.5mL配置好的不同劑量的薯蕷粥溶液，約4周后測(cè)量空腹血糖水平并收集糞便樣品。

3.觀測(cè)指標(biāo)及檢測(cè)方法。（1）小鼠血糖水平的測(cè)定。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束取材前的兩周，測(cè)量小鼠空腹血糖及體重，小鼠12h禁食不禁水，剪去尾尖血管取血，通過羅氏活力血糖儀進(jìn)行測(cè)量和記錄。（2）小鼠糞便腸道菌群檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后收取小鼠新鮮糞便，置于無菌離心管并在-80°C低溫保存。提取微生物組總DNA序列，采用Nanodrop對(duì)DNA進(jìn)行定量，通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量。以能夠反映菌群組成和多樣性的目標(biāo)序列為靶點(diǎn)，根據(jù)序列中的保守區(qū)域設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，基于16SrRNA對(duì)V3V4可變區(qū)進(jìn)行檢測(cè)并采取PCR擴(kuò)增，PCR時(shí)所用引物序列如下：

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.薯蕷粥對(duì)T2DM小鼠血糖的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將各組小鼠的空腹血糖值進(jìn)行比較。與空白組相比較，模型組小鼠的空腹血糖顯著升高（P<0.05）；與模型組相比較，鹽酸二甲雙胍組小鼠空腹血糖顯著降低（P<0.05），薯蕷粥低劑量組（P<0.01）及薯蕷粥中劑量組（P<0.05）小鼠空腹血糖顯著降低。（詳見圖1）

2.微生物群落結(jié)構(gòu)分析。將數(shù)據(jù)在細(xì)菌菌門、菌綱、菌屬水平下進(jìn)行匯總，并計(jì)算這三個(gè)分類水平下的細(xì)菌豐度。

（1）菌門水平分析（樣品Phylum分類水平中物種分析）。從圖2可以看出，所有樣品80%以上的腸道菌群都為厚壁菌門Firmicutes和擬桿菌門Bacteroidets；其余被檢測(cè)到的主要菌門還有變形菌門Proteobacteria、放線菌門Actinobacteria等，共約占3.9%-19.7%。與空白組相比較，模型組的厚壁菌門Firmicutes/擬桿菌門Bacteroidetes比值相對(duì)升高，擬桿菌門Bacteroidets相對(duì)豐度降低，厚壁菌門Firmicutes、變形菌門Proteobacteria和放線菌門Actinobacteria豐度增加。與模型組相比較，二甲雙胍組以及薯蕷粥低、中、高劑量組的厚壁菌門Firmicutes/擬桿菌門Bacteroidetes比值下降，厚壁菌門Firmicute相對(duì)豐度均減少，變形菌門Proteobacteria和放線菌門Actinobacteria豐度均增加。

A.空白組；B.模型組；C.陽性對(duì)照組；D.低劑量組；E.中劑量組；F.高劑量組

（2）菌綱水平分析（樣品Class分類水平中物種分析）。從圖3可以看出，所有樣品50%以上腸道菌群都為擬桿菌綱Bacteroidia和梭菌綱Clostridia；其余被檢測(cè)到的主要菌綱還有芽孢桿菌綱Bacilli、γ-變形菌綱Gammaproteobacteria等，共約占11.2%-45.6%。與空白組相比較，模型組的擬桿菌綱Bacteroidia和芽孢桿菌綱Bacilli相對(duì)豐度減少，梭菌綱Clostridia豐度增加。與模型組相比，二甲雙胍組及薯蕷粥各劑量組的γ-變形菌綱Gammaproteobacteria和梭菌綱Clostridia相對(duì)豐度減少。

A.空白組；B.模型組；C.陽性對(duì)照組；D.低劑量組；E.中劑量組組；F.高劑量組

（3）菌屬水平分析（樣品Genus分類水平中物種分析）。從圖4可以看出，樣品中多數(shù)以擬桿菌屬Bacteroides、乳桿菌屬Lactobacillus 、普雷沃菌屬Prevotella和顫螺菌屬Oscillospira為主，其余還有支原體屬Allobaculum、嗜冷桿菌屬Psychrobacter等。與空白組相比，模型組的擬桿菌屬Bacteroides、乳桿菌屬Lactobacillus、普雷沃菌屬Prevotella、顫螺菌屬Oscillospira和瘤胃球菌屬Ruminococcus豐度增加。與模型組相比，二甲雙胍組及薯蕷粥各劑量組的顫螺菌屬Oscillospira、普雷沃菌屬Prevotella和瘤胃球菌屬Ruminococcus相對(duì)豐度降低，薯蕷粥低、高劑量組的乳桿菌屬Lactobacillus豐度均增加。

A.空白組；B.模型組；C.陽性對(duì)照組；D.低劑量組；E.中劑量組組；F.高劑量組

四、討論

山藥的主要化學(xué)成分包括多糖、氨基酸、脂肪酸、淀粉等，具有降血糖、降血脂、調(diào)節(jié)脾胃等藥理作用。本研究從腸道菌群調(diào)節(jié)角度，進(jìn)一步闡述山藥的降糖功效及菌群機(jī)制。

腸道菌群是攜帶人體“第二基因”的“隱形器官”，菌群改變可引起胰島素抵抗、炎癥、血管疾病和代謝紊亂，從而介導(dǎo)代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展。胰島素抵抗的發(fā)生起源于腸道菌群紊亂，因此明晰菌群的分布、組成及其特點(diǎn)，或可為2型糖尿病的飲食干預(yù)提供新的思考角度。研究表明，柔嫩梭菌屬、乳酸菌屬、雙歧桿菌屬和血糖代謝有緊密聯(lián)系。其中，柔嫩梭菌屬具有調(diào)節(jié)代謝、抵抗炎癥的功能；雙歧桿菌屬和乳酸桿菌屬是人體腸道內(nèi)重要的有益菌，為維持腸道微生態(tài)的動(dòng)態(tài)平衡做出貢獻(xiàn)。

2型糖尿病患者的厚壁菌門與擬桿菌門的比值上升等一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了機(jī)體與腸道菌群的關(guān)系，在健康和疾病中的重要作用被不斷發(fā)掘。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)2型糖尿病模型血糖和腸道菌群實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的檢測(cè)，系統(tǒng)分析上述指標(biāo)是否具有顯著差異。通過腸道菌群多樣性分析得出，薯蕷粥低劑量組的菌群豐度及多樣性相比模型組均有所增加。小鼠糞便樣本中主要的菌群為厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidets），兩者之和占80%以上。

與空白組比較，模型組的空腹血糖值明顯高于空白組。從菌門角度上看，模型組的厚壁菌門Firmicutes/擬桿菌門Bacteroidetes比值相對(duì)升高，擬桿菌門Bacteroidets明顯下降，厚壁菌門Firmicutes、變形菌門Proteobacteria和放線菌門Actinobacteria豐度增加；從菌綱角度上看，模型組的擬桿菌綱Bacteroidia和芽孢桿菌綱Bacilli數(shù)量減少，梭菌綱Clostridia豐度增加；從菌屬上看，模型組的擬桿菌屬Bacteroides、乳桿菌屬Lactobacillus、普雷沃菌屬（Prevotella）、顫螺菌屬Oscillospira和瘤胃球菌屬Ruminococcus豐度增加。

薯蕷粥各劑量組從菌門角度上看，厚壁菌門Firmicutes/擬桿菌門Bacteroidetes比值相對(duì)下降，厚壁菌門Firmicutes相對(duì)豐度下降，變形菌門Proteobacteria、擬桿菌綱Bacteroidets和放線菌門Actinobacteria豐度均增加；從菌綱角度上看，γ-變形菌綱Gammaproteobacteria和梭菌綱Clostridia數(shù)量均減少；從菌屬角度上看，顫螺菌屬Oscillospira、普雷沃菌屬（Prevotella）和瘤胃球菌屬Ruminococcus數(shù)量均降低。由此可見，薯蕷粥低、中劑量組具有類似二甲雙胍降低空腹血糖值的作用，通過調(diào)節(jié)腸道菌群多樣性及豐度，可以緩解2型糖尿病小鼠的病況。

綜上所述，本文從菌群調(diào)節(jié)角度為薯蕷粥改善模型糖尿病小鼠提供了更深層次的機(jī)制探討，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步研究其對(duì)臨床2型糖尿病患者腸道菌群的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制，為深入開發(fā)薯蕷粥這一中國經(jīng)典藥膳提供充足的基礎(chǔ)研究材料。（基金項(xiàng)目：福建中醫(yī)藥大學(xué)校管課題，課題編號(hào)：“X2019049-學(xué)科”）

作者簡介：謝勇（1976-），博士，教授，研究方向：功能性食品研究。