馬云龍 宋春雨 綜述 劉曉光 祝 斌 審校

(北京大學(xué)第三醫(yī)院疼痛科，北京 100191)

椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IVDD)是一種由遺傳因素、機(jī)械因素及環(huán)境因素等共同導(dǎo)致椎間盤(intervertebral disc，IVD)細(xì)胞衰老及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)合成與分解代謝失衡的過程，常與下腰痛(low back pain，LBP)及其伴隨出現(xiàn)的精神睡眠障礙密切相關(guān)[1,2]。動物模型的建立為深入理解IVDD的發(fā)生與進(jìn)展，探索延緩IVDD及其相關(guān)的機(jī)體功能障礙等研究提供了可能。雖然已有多種動物模型用于IVDD和LBP的實驗研究，但多數(shù)為侵襲性建模方法，可能對實驗動物產(chǎn)生較大創(chuàng)傷并干擾實驗結(jié)果的評價與解釋，有關(guān)IVDD所致LBP的功能學(xué)研究報道也較少[3，4]。此外，這些模型均無法良好地模擬人類IVD自發(fā)性退變并產(chǎn)生LBP的漸進(jìn)性特征。富含半胱氨酸的分泌型酸性蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC)基因敲除的小鼠(SPARC-null)可緩慢地發(fā)生IVDD和LBP，產(chǎn)生類似于人類IVDD所致LBP的自發(fā)性與漸進(jìn)性過程[5，6]，而且建模過程并不會對實驗動物產(chǎn)生過多傷害，可能是研究IVDD與LBP相互關(guān)系的一種理想動物模型。本文對SPARC基因敲除的小鼠模型在IVDD所致LBP研究中的應(yīng)用進(jìn)行文獻(xiàn)總結(jié)。

1 SPARC在IVDD和LBP中的潛在作用

SPARC又被稱為骨連接蛋白或基底膜蛋白40，主要表達(dá)于骨、腸黏膜、愈合傷口等組織中。人類SPARC由一個坐落于5q31～q33染色體的25.6kb長單基因編碼，包含10個外顯子和9個內(nèi)含子，基因結(jié)構(gòu)包括四部分：氨基末端包含大容量低親和的鈣結(jié)合域，一個富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域，一個親水結(jié)構(gòu)域和羧基末端包含與膠原結(jié)合的細(xì)胞外鈣離子域[7]。SPARC的表達(dá)與基質(zhì)蛋白(如膠原蛋白)關(guān)系密切，后者是ECM的主要結(jié)構(gòu)成分并參與維持ECM的機(jī)械穩(wěn)定性。SPARC通過分子結(jié)構(gòu)中氨基和羧基末端結(jié)構(gòu)域直接與結(jié)構(gòu)基質(zhì)蛋白結(jié)合來影響前膠原加工及膠原纖維的形成、沉積和重塑過程[8～10]，還可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)[11，12]，從而干擾 ECM內(nèi)環(huán)境中的合成與分解代謝平衡，最終影響細(xì)胞與ECM的相互作用和ECM的重塑。鑒于此，已有大量研究報道SPARC在調(diào)節(jié)骨礦物組織與軟骨組織代謝、線粒體功能變化、皮膚彈性改變、眼壓調(diào)節(jié)及細(xì)胞黏附與遷移等多種病生理過程中的重要作用[13～17]。此外，SPARC在多種惡性腫瘤、結(jié)締組織疾病、早期白內(nèi)障形成、青光眼、糖尿病相關(guān)病變、成骨不全癥、心肌與骨骼肌疾病及傷口愈合不良等多種疾病的發(fā)生發(fā)展和治療方面也扮演著重要角色[8,12,14,15,18～21]。

IVD由纖維環(huán)(annulus fibrosus，AF)、髓核(nucleus pulposus，NP)和軟骨終板3部分組成，作為脊柱的重要組成結(jié)構(gòu)參與脊柱縱向屈伸、側(cè)向彎曲和旋轉(zhuǎn)等活動；組織學(xué)上，IVD由間盤固有細(xì)胞、膠原蛋白(Ⅰ～Ⅴ和Ⅹ～Ⅻ型膠原)及蛋白多糖等基質(zhì)蛋白為主的ECM組成[22]。IVDD是椎間盤突出癥、椎管狹窄癥、脊柱不穩(wěn)定等脊柱相關(guān)疾病的重要病理基礎(chǔ)，其病理學(xué)改變主要表現(xiàn)為活躍細(xì)胞數(shù)量減少、參與ECM合成與組裝的基質(zhì)蛋白含量減少和分布變化、參與ECM降解的多種基質(zhì)蛋白酶表達(dá)增高、細(xì)胞表型改變以及炎癥反應(yīng)等[23]。目前，腰椎IVDD被認(rèn)為是慢性軸性和(或)根性LBP的主要影響因素[1，24]。IVDD引起LBP可能機(jī)制包括脊柱不穩(wěn)對椎小關(guān)節(jié)、椎旁肌肉和韌帶的刺激，IVD細(xì)胞分泌促炎因子增加及免疫細(xì)胞局部浸潤和激活所致炎癥級聯(lián)反應(yīng)的放大，傷害刺激誘導(dǎo)IVD內(nèi)新生血管及神經(jīng)纖維支配的增加，以及持續(xù)傷害刺激對脊髓或髓上結(jié)構(gòu)和功能的敏化等[25,26]。

Gruber等[27]2004年首次報道SPARC在人類IVD組織中表達(dá)的證據(jù)，他們選取各年齡層(新生兒至老年人群)接受手術(shù)患者的IVD組織進(jìn)行免疫組學(xué)研究，結(jié)果顯示新生兒至0.19歲齡的IVD中，SPARC在所有AF外環(huán)細(xì)胞中均有陽性表達(dá)，在NP和AF內(nèi)環(huán)細(xì)胞中陽性表達(dá)率較低，分別為76.0%和76.4%；與此相比，4.7～76歲齡的AF細(xì)胞中，SPARC的總體陽性表達(dá)率為66.7%(P=0.04)。隨后，該團(tuán)隊進(jìn)一步研究顯示靶向敲除SPARC基因的小鼠在14、19和20個月時表現(xiàn)出間盤退化表型，組織學(xué)觀察顯示，正常對照小鼠的AF組織中膠原纖維直徑均勻、纖維邊緣規(guī)則，SPARC基因敲除小鼠AF組織中膠原纖維的大小和直徑范圍廣泛、邊緣不規(guī)則[5]。此外，Tajerian等[28]研究顯示，IVD所致LBP表型的小鼠和人類均存在SPARC啟動子甲基化增加的情況，為直接確定SPARC啟動子區(qū)甲基化對基因啟動子活性的影響，將啟動子區(qū)域亞克隆至熒光素酶報告質(zhì)粒中，比較甲基化或模擬甲基化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人胚腎HEK293細(xì)胞內(nèi)熒光素酶活性變化，結(jié)果顯示甲基化或模擬甲基化處理的細(xì)胞內(nèi)熒光素酶相對活性較未處理組顯著降低(P<0.01)，提示SPARC啟動子區(qū)甲基化可沉默基因啟動子活性，這些結(jié)果表明SPARC啟動子甲基化所致SPARC蛋白失活在人類和動物IVDD和LBP中具有潛在作用。

2 SPARC-null小鼠模型建模方法及表征特點

20世紀(jì)80年代，Norose等[20]率先確立SPARC-null小鼠模型的傳統(tǒng)建模方法。通過分離129SV小鼠的SPARC基因中含外顯子2～5的BamHI片段構(gòu)建靶向載體，于外顯子4起始端插入2個新霉素耐藥基因表達(dá)盒，將pMC1單純皰疹病毒胸苷激酶構(gòu)建體克隆至基因組片段的3’端生成構(gòu)建體，并轉(zhuǎn)染至CCE胚胎干細(xì)胞；在條件培養(yǎng)基中將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)在G418耐藥STO胚胎成纖維細(xì)胞上，篩選耐藥菌落并分離DNA，并應(yīng)用Southernblot鑒定靶基因敲除的細(xì)胞；應(yīng)用Nsil消化基因組DNA產(chǎn)生野生型和突變型等位基因，將攜帶SPARC基因敲除的胚胎干細(xì)胞注射至C57BL/6J小鼠的胚泡期胚胎以產(chǎn)生嵌合體；將含嵌合體的雄性小鼠與雌性C57BL/6J小鼠回交產(chǎn)生第1代(F1)雜合子小鼠(SPARC+/-)，再將F1小鼠(SPARC +/-)繼續(xù)回交以產(chǎn)生第2代(F2)純合子基因突變型(SPARC-/-)和野生型(SPARC +/+)小鼠；連續(xù)回交10代以上獲得基因高度同源的純合突變型小鼠，該小鼠既不產(chǎn)生SPARC的mRNA，也不產(chǎn)生相應(yīng)蛋白[20]。

靶向敲除SPARC基因能夠加速年齡依賴性IVDD的發(fā)生，同時伴隨出現(xiàn)年齡依賴性的慢性LBP行為特征，主要表現(xiàn)為軸性腰痛、放射性下肢痛和運(yùn)動障礙[5,6,29]。針對SPARC-null小鼠對疼痛刺激的反應(yīng)特點進(jìn)行分類評估，該模型小鼠表現(xiàn)出對冷刺激和脊柱軸向拉伸引起的疼痛高度敏感，而對機(jī)械性或熱刺激不敏感[28]。該模型對刺激的敏感性存在位點特異性，小鼠的后爪和背部對冷刺激敏感性顯著高于尾部[6,30]。Millecamps等[30]進(jìn)行的一項橫斷面、多隊列、行為學(xué)和組織學(xué)研究探討LBP與腰椎IVD退變程度之間的關(guān)系，研究選取6～78周齡SPARC-null和野生型對照小鼠，評估IVD退變程度、軸性疼痛及放射疼痛等行為體征。SPARC-null小鼠在18、24、36周相比于同周齡對照小鼠，對軸向拉伸刺激以及后爪對冷刺激耐受性均呈顯著降低趨勢(軸向拉伸耐受性對比：3個周齡組P均<0.001；后爪對冷刺激耐受性對比：3個周齡組P均<0.01)；雖然對照組和SPARC-null組小鼠間盤退變評分隨年齡增長均逐漸增高，但直到78周齡，SPARC-null組間盤退變評分顯著高于對照組(P<0.001)，提示SPARC-null組小鼠間盤退變程度更加嚴(yán)重。這些結(jié)果表明，SPARC-null小鼠IVD退變程度呈現(xiàn)年齡依賴性增加。與此同時，2組小鼠對軸向拉伸的耐受性與IVD退變程度相關(guān)，但后爪對冷刺激的耐受性與IVD退變程度并不相關(guān)。36周齡以內(nèi)的SPARC-null小鼠相比年齡匹配的對照組小鼠，對軸向拉伸的耐受性較差，但54周齡2組小鼠對軸向拉伸的敏感性無明顯差別(P>0.05)；后爪對冷刺激敏感性在18周齡的SPARC-null小鼠中出現(xiàn)顯著升高(P<0.01)，而且隨年齡的增長而持續(xù)增加。Miyagi等[31]選取不同年齡層小鼠研究慢性IVD所致LBP的潛在分子機(jī)制；通過檢測后爪皮膚對冷、熱和機(jī)械刺激的敏感性以評價放射性疼痛；應(yīng)用握力實驗和懸尾實驗以評估軸向LBP；免疫組化檢測神經(jīng)纖維標(biāo)記物PGP 9.5和感覺神經(jīng)肽降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)以識別IVD神經(jīng)支配；定量分析背根神經(jīng)節(jié)中CGRP和神經(jīng)肽Y的免疫反應(yīng)活性以及脊髓背角神經(jīng)元中的CGRP和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)和小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物離子鈣接頭蛋白-1的免疫反應(yīng)活性，以評估感覺神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性。結(jié)果顯示SPARC-null小鼠表現(xiàn)出對冷刺激敏感、軸向疼痛不適、IVD內(nèi)和IVD周圍感覺神經(jīng)支配的年齡依賴性增加、背根神經(jīng)節(jié)中CGRP和神經(jīng)肽Y的年齡依賴性上調(diào)、脊髓背角神經(jīng)元中降鈣素基因相關(guān)肽、GFAP和離子鈣接頭蛋白-1的年齡依賴性增加。這些結(jié)果表明，退化IVD中感覺神經(jīng)纖維支配增加、背根神經(jīng)節(jié)和脊髓背角神經(jīng)元的神經(jīng)可塑性可能是慢性椎間盤源性LBP的病理生物學(xué)基礎(chǔ)。

3 SPARC-null小鼠模型在IVDD與LBP行為學(xué)評價中的應(yīng)用

IVDD和慢性LBP常引起多裂肌內(nèi)的炎癥反應(yīng)和(或)結(jié)構(gòu)重塑過程，近期學(xué)者應(yīng)用SPARC-null模型探討IVDD和慢性LBP與腰椎多裂肌內(nèi)炎癥信號和結(jié)構(gòu)蛋白變化的相互作用關(guān)系。James等[32]的一項縱向病例對照研究探討自發(fā)性IVDD對多裂肌內(nèi)炎癥信號活性的影響及后者與IVDD進(jìn)展和嚴(yán)重程度的相關(guān)性，同時評估運(yùn)動或鍛煉在此發(fā)揮的預(yù)防作用。研究選取SPARC-null小鼠和對照小鼠并分為靜止組和運(yùn)動組，在小鼠9個月大時對2組進(jìn)行核磁掃描以確定IVDD，并從L2～6節(jié)段獲取多裂肌肌肉片段并檢測炎癥相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果顯示，SPARC-null小鼠與野生型對照組小鼠相比，多裂肌內(nèi)促炎因子IL-1β(P<0.0001)、IL-6(P=0.012)、TGF-β1(P=0.009)和脂聯(lián)素(P<0.0001)表達(dá)顯著增高，其中IL-1β的表達(dá)水平與IVDD嚴(yán)重程度顯著相關(guān)(P<0.0001)，運(yùn)動后能夠下調(diào)多個促炎因子的表達(dá)水平。這些結(jié)果表明IVDD能夠增強(qiáng)多裂肌內(nèi)炎癥反應(yīng)，與IVDD的嚴(yán)重程度密切相關(guān)；運(yùn)動本身能夠通過降低多裂肌內(nèi)的炎癥因子并延緩IVDD進(jìn)展。該團(tuán)隊后續(xù)進(jìn)一步研究顯示，SPARC-null小鼠的L1～2和L3～4節(jié)段分別呈現(xiàn)重度和輕度IVDD，對這兩節(jié)段多裂肌樣本進(jìn)行檢測顯示，重度IVDD節(jié)段的多裂肌內(nèi)結(jié)締組織厚度增加，膠原蛋白Ⅲ(P=0.02)、纖維連接蛋白(P=0.03)、結(jié)締組織生長因子(P<0.0001)、P物質(zhì)(P<0.05)及金屬蛋白酶組織抑制劑-1(P=0.02)和金屬蛋白酶組織抑制劑-2(P=0.03)表達(dá)水平顯著增高；然而，運(yùn)動組小鼠結(jié)締組織厚度呈現(xiàn)縮小趨勢，且前述參與形成多裂肌纖維網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)蛋白表達(dá)也出現(xiàn)下調(diào)。這些結(jié)果表明，慢性IVDD能夠促進(jìn)多裂肌內(nèi)部纖維化結(jié)構(gòu)改變，運(yùn)動同樣可以改善這些結(jié)構(gòu)重塑過程，改善IVDD的進(jìn)展及與其相關(guān)的LBP[33]。

此外，多項研究也在SPARC-null動物模型上評價部分鎮(zhèn)痛藥物對IVDD所致軸性疼痛和放射性疼痛的改善作用。Millecamps等[29]對6月齡SPARC-null小鼠和野生型小鼠(對照組)經(jīng)腹腔注射阿片類藥物嗎啡(6mg/kg)，藥物作用至90min時SPARC-null小鼠后爪皮膚對冷刺激的敏感性較對照組顯著降低(P<0.05)。同樣，Tajerian等[34]在此模型上評價嗎啡和α2腎上腺素能受體激動劑可樂定聯(lián)合應(yīng)用對軸性疼痛和放射性疼痛的影響，結(jié)果顯示嗎啡∶可樂定(100∶1)聯(lián)合應(yīng)用不僅在改善軸性疼痛方面表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)，還可改善放射性疼痛的治療窗。Krock等[35]應(yīng)用此模型研究抑制Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)對延緩IVDD及改善LBP行為學(xué)特征的影響，研究選取7～9月齡雄性SPARC-null和野生型對照小鼠，應(yīng)用TLR4抑制劑TAK242連續(xù)治療8周，每周分別應(yīng)用握力試驗和丙酮試驗評估軸向疼痛和放射性疼痛，治療結(jié)束后檢測脊髓內(nèi)和腰椎IVD的組織細(xì)胞學(xué)改變以及相關(guān)蛋白表達(dá)變化。結(jié)果顯示，與野生型對照小鼠相比，SPARC-null小鼠的軸性疼痛(P<0.01)和放射性疼痛(P<0.01)閾值基態(tài)水平較低，；慢性抑制TLR4能夠降低SPARC-null的上述疼痛表征。分子水平分析顯示，SPARC-null小鼠與對照組相比脊髓背角神經(jīng)元中CGRP和GFAP表達(dá)明顯增加(P<0.05)，但TLR4抑制劑處理SPARC-null組小鼠后兩者均出現(xiàn)顯著減少(藥物處理組與藥物未處理組對比：CGRP水平P<0.05；GFAP水平P<0.01)；SPARC-null小鼠IVD組織較對照組小鼠分泌較高水平促炎因子(SPARC-null組與對照組小鼠對比：IL-1α水平P<0.01；IL-1β水平P<0.05)，模型小鼠中的這些因子經(jīng)TLR4抑制劑處理后較藥物未處理組均顯著降低(藥物處理組與藥物未處理組對比：IL-1α水平P<0.01；IL-1β水平P<0.05)。這些結(jié)果表明，慢性抑制TLR4可降低SPARC-null小鼠LBP、疼痛相關(guān)神經(jīng)可塑性和IVD的炎癥反應(yīng)。

4 SPARC-null小鼠模型的其他表型

雖然SPARC-null小鼠在IVDD和LBP的研究應(yīng)用具有一定優(yōu)勢，但由于SPARC也參與調(diào)節(jié)機(jī)體多種病生理過程的調(diào)節(jié)，因此，存在其他表型特征。1月齡SPARC-null小鼠表現(xiàn)出皮膚膠原纖維直徑減少、皮膚抗拉強(qiáng)度降低，這可能影響皮膚對疼痛刺激的敏感性，從而干擾疼痛行為學(xué)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性[15]。SPARC-null小鼠可能還有成骨不全表現(xiàn)，SPARC基因單核苷酸多態(tài)性所致SPARC表達(dá)缺失，可能致使小鼠骨礦化基質(zhì)減少，隨年齡的增長骨小梁體積減少、總骨形成率降低從而出現(xiàn)成骨不全[36]，而且SPARC的誤義突變也可導(dǎo)致隱性成骨不全[19]。此外，SPARC缺乏可致B型淋巴細(xì)胞增殖受損，從而影響機(jī)體正常骨髓基質(zhì)功能[37]。

5 小結(jié)

不可否認(rèn)，既往動物模型在研究IVDD或LBP單一方面有良好的應(yīng)用價值，但大多數(shù)需對間盤和(或)神經(jīng)進(jìn)行物理性或化學(xué)性損傷，無法良好模擬IVD的自然退變與LBP功能障礙之間的相互作用與內(nèi)在聯(lián)系。SPARC-null小鼠模型基于SPARC基因敲除所致貫穿動物整個生命周期的一個緩慢性、年齡依賴性及自發(fā)性IVDD和LBP所建立，其相比以往模型能更準(zhǔn)確地模擬與評估人類中IVDD退變與功能障礙的動態(tài)演變過程，已逐步應(yīng)用于IVDD所致LBP的解剖學(xué)和疼痛行為學(xué)等相關(guān)研究。國內(nèi)學(xué)者應(yīng)用該模型的研究報告尚缺乏，可能與該動物模型建模時間和經(jīng)濟(jì)成本高(回交代數(shù)多、時間至少2年)有關(guān)，導(dǎo)致模型的獲取有一定難度。合理選擇優(yōu)化的基因編輯技術(shù)對該模型進(jìn)行改良可能一定程度上降低建模的時間和經(jīng)濟(jì)成本，便于國內(nèi)外學(xué)者的廣泛應(yīng)用和研究。此外，因SPARC基因的多重功能，對其進(jìn)行靶向敲除產(chǎn)生的其他表型可能干擾研究結(jié)果的判讀，需要對相關(guān)實驗結(jié)果進(jìn)行合理的分析與解釋。