賈雪冰 李琦

原發(fā)性肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在惡性腫瘤中分別位居第6 位和第3位［1-2］。在分子機制方面，肝癌進展相關基因的作用往往取決于其蛋白產物水平及翻譯后修飾，如泛素化、磷酸化和乙?；取Ｒ虼?，探索這些基因在蛋白水平上的調控機制對于肝癌的分子靶向治療具有重要的理論價值。

泛素蛋白酶體途徑是由調節(jié)蛋白質穩(wěn)定和降解的泛素化和去泛素化組成的高度動態(tài)過程。去泛素化酶參與去泛素化的機制錯綜復雜，不僅能解除泛素化，而且可以通過再循環(huán)泛素分子、校對泛素化進程、分解泛素化抑制因子等方式促進泛素化過程［3］，其異常活動可能與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關。近年來，有關去泛素化酶與肝癌發(fā)生機制有一些新的研究。本文將對在肝癌中發(fā)揮作用的去泛素化酶及去泛素化酶抑制劑的研究新進展進行綜述。

1 去泛素化酶家族及其作用

1.1 去泛素化酶家族的組成

目前，已發(fā)現的去泛素化酶約有99種，根據去泛素化酶活性部位不同可以將其分為7大家族，分別是泛素特異性蛋白酶家族（ubiquitin-specific proteases，USPs）、泛素羧基末端水解酶家族（ubiquitin C-terminal hydrolases，UCHs）、卵巢腫瘤相關蛋白酶家族（ovarian tumor-related proteases，OTUs）、MJD 結構域蛋白酶家族（Machado-Joseph disease protein domain proteases，MJDs/Josephins）、含JAB1/PAB1/MPN 結構域的金屬蛋白酶家族（JAB1/PAB1/MPN domain-containing metallo-enzymes，JAMMs）和單核細胞趨化蛋白誘導的蛋白酶家族（mococyte chemotactic proteininduced protein，MCPIPs）以及最近發(fā)現的鋅指含泛素肽 酶1（zinc finger containing ubiquitin peptidase 1，ZUP1）。7個家族中除了JAMMs（也稱為MPN）家族，其他6 個被歸類為半胱氨酸蛋白酶，而JAMMs 家族由鋅依賴金屬蛋白酶組成。USP 家族是目前已知去泛素化酶家族中成員最多、結構最具多樣性的一類。除了MJDs，每個家族的基因在酵母和人類中都是高度保守的。在去泛素化酶的99 個家族成員中，有11個由于失去了去泛素化活性的關鍵殘基而被認為是假酶，但它們仍然可以通過變構激活具有催化活性的去泛素化酶和其它活性酶而發(fā)揮重要的生物學作用［4］。

1.2 去泛素化酶的功能

泛素化和去泛素化之間的平衡與蛋白質水平和活性的調控密切相關。去泛素化酶是作用于泛素分子之間或泛素與被修飾蛋白質之間的肽或異肽鍵的蛋白酶。去泛素化酶以兩種完全不同的方式處理泛素修飾：1）通過不同催化域的蛋白質相互作用而定向于特定的蛋白質底物［5］；2）識別和選擇特定的泛素鏈結構［6］。去泛素化酶具有以下功能：1）維持游離泛素水平，即將泛素分子從泛素化的蛋白底物上游離出來；2）從任何泛素介導的降解途徑（蛋白酶體、內泌體和自噬體）中解離蛋白質，防止其降解；3）控制泛素介導的后續(xù)生理活動的啟動［5］。去泛素化酶通過逆轉蛋白質泛素化降解過程，進而調節(jié)蛋白質相互作用、定位和酶活性，影響細胞過程，包括轉錄、DNA 損傷信號和DNA 修復、細胞周期進展、內吞作用、細胞凋亡等［7］。隨著研究的深入，研究者們發(fā)現抑制去泛素化酶活性可能成為一種新的腫瘤治療方法，如可以調節(jié)各種癌基因或腫瘤抑制基因蛋白水平或活性的USP7 和USP28 等，以及與促進腫瘤生長的關鍵表觀遺傳變化有關的USP22等［8］。由此可見，DUBs可能成為腫瘤潛在的治療靶點。

2 去泛素化酶在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用

目前，有關去泛素化在肝癌中作用的研究不多，僅涉及USPs 家族（包括屬于USPs 亞家族的CYLD）。其中，研究較多的有USP22、USP7 和CYLD 等。USP的結構域高度保守，包括3 個亞結構域：Finger、Thumb 和Palm［9］，大多數USP 蛋白含有1 個催化區(qū)域和與其它蛋白相互作用的結構域。CYLD缺乏Finger亞結構域，它是一個與腫瘤綜合征相關的去泛素化酶。泛素的C-端插入到USP 介于Thumb 和Palm 亞結構域之中，而泛素的球狀部分則與Finger亞結構域相互作用。USP 家族的成員通過調控靶基因的表達而對肝癌細胞的生長、增殖、分化及凋亡起重要作用。

2.1 USP22在肝癌中的作用

泛素特異性蛋白酶22（USP22）主要通過去泛素化修飾調節(jié)細胞內的生化反應，在腫瘤發(fā)生、耐藥和細胞周期等方面發(fā)揮作用。USP22 與腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制主要與BMI-1、MYC、TRF1 等因子有關，這一特點使其可能成為腫瘤干細胞標志物之一。

2.1.1 USP22促進肝癌干細胞生成 在缺氧條件下，USP22 和TP53 作 為HIF1α 的直接靶基因可以被HIF1α 轉錄上調。在TP53 野生型肝細胞癌中，TP53能抑制HIF1α誘導的USP22上調，而HIF1α可以通過轉錄上調TP53 進而促進其抑制作用。在TP53 突變的肝癌細胞中，USP22和HIF1α形成一個正反饋回路并促進肝癌細胞的干性。TP53突變且USP22和（或）HIF1α高表達的肝細胞癌患者往往預后較差。同時，靶向USP22 的脂蛋白復合物能抑制小鼠肝臟腫瘤的發(fā)生并增強索拉非尼的敏感性［10］。綜上，USP22通過TP53失活后的HIF1α/USP22正反饋回路促進缺氧誘導的肝癌干細胞生成。因此，USP22有可能成為肝細胞癌的治療靶標。

2.1.2 USP22增強抗腫瘤免疫 PD-1（CD279）-PDL1（CD274）抑制信號轉導對癌癥免疫逃避至關重要，已成為抗腫瘤免疫治療的主要靶點之一。USP22 可直接與CD274的C端相互作用，誘導其去泛素化和穩(wěn)定。USP22 在肝癌中高表達與患者的不良預后密切相關。USP22基因缺失能抑制小鼠肝癌生長，增加腫瘤免疫原性和腫瘤浸潤淋巴細胞，提高CD274 靶向免疫治療和順鉑化療的療效［11］。因此，靶向USP22是增強CD274抗腫瘤免疫的有希望的策略。

2.1.3 USP22 在肝癌耐藥方面發(fā)揮作用 肝細胞癌的藥物治療常因多藥耐藥（MDR）而失敗，USP22表達水平是BEL7402 和BEL/FU 細胞耐藥表型改變的原因。USP22下調顯著抑制ABCC1（編碼多藥耐藥相關蛋白MRP1）的表達，USP22 可以通過激活SIRT1/AKT/MRP1通路促進肝癌細胞中MDR的表達［12］。因此，USP22 可能是一個逆轉肝癌多藥耐藥的潛在靶點。通過干擾核糖核酸下調耐藥肝癌細胞系中USP22 的表達可導致耐藥基因BMI1 的表達下降，相應地，USP22高表達可通過上調BMI1的表達，在肝癌患者化療藥物耐藥中發(fā)揮重要作用［13］。因此，USP22和BMI1 的共表達可能成為肝癌預后的新指標，有助于指導臨床治療。USP22 基因被敲低后，通過下調PI3K 和激活Smad4 來發(fā)揮其功能，而Smad4 可以抑制Akt 的磷酸化。同樣，沉默Smad4 可阻斷敲除USP22 后誘導的Bel/Fu 細胞中Akt 的抑制，進而抑制細胞的增殖、遷移、侵襲和上皮間質轉化，抑制體內的致瘤和轉移能力和耐藥相關蛋白（MDR1、LRP、MRP1）等［14］。

2.1.4 USP22 在肝癌進展中的作用 肝癌組織中USP22和Survivin的表達與腫瘤的大小、分期、分化等惡性行為密切相關。敲低USP22 基因可下調Survivin、Cyclin B的表達、上調p21的表達，這提示USP22 與Survivin 的協(xié)同作用參與HCC 的進展［15］。USP22高表達提示患者預后較差，總生存率和無復發(fā)生存率較低。USP22 可作為肝癌獨立的預后分子標志物［16］。其中關于USP22的研究相對較多，它在肝癌的耐藥、免疫及癌癥進展中發(fā)揮著重要作用，且USP22的特異性抑制劑LY294002已被證明可以抑制癌癥進展，但目前鮮見相關臨床試驗開展。

2.2 USP7在肝癌中的作用

USP7通過去泛素化穩(wěn)定甲狀腺激素受體相互作用蛋白12（TRIP12），使p14（ARF）失活，促進肝癌的進展。與正常肝組織相比，肝癌組織中USP7的RNA和蛋白表達水平均有上調，USP7 高表達與肝癌患者的惡性表型顯著相關，包括分期較晚、腫瘤體積大、腫瘤多灶性、分化差、甲胎蛋白升高、微血管侵犯等。此外，USP7和（或）TRIP12高表達的肝癌患者總生存期短、腫瘤復發(fā)率高［17］。除了TRIP12，Hippo 通路的關鍵分子YAP是USP7調控肝癌的另一個靶點，USP7通過穩(wěn)定YAP促進肝癌細胞的增殖［18］。脂肪細胞分泌的外泌體環(huán)狀RNA 通過抑制miR-34a，激活USP7/Cyclin A2 信號通路，促進腫瘤生長，減少DNA損傷［19］?？傊?，USP7 可增強HCC 細胞的增殖、遷移和侵襲能力，從而促進腫瘤的進展。因此，USP7可作為肝癌患者預后的標志物，也是肝癌潛在的治療靶點。

2.3 CYLD在肝癌中的作用

臨床上，許多肝癌患者常有罹患肝病的病史，如慢性肝炎、肝纖維化、肝硬化及肝癌等。因此，去泛素化酶與這一動態(tài)過程的關系不可忽視，如去泛素化酶CYLD 在肝臟脂肪變性和炎癥發(fā)生過程中起重要保護作用，可防止其進一步發(fā)展為肝硬化，甚至肝癌。在肝臟損傷后，CYLD有助于肝臟內環(huán)境的穩(wěn)定和恢復，CYLD活性的突變或中斷可加重急性和慢性肝損傷，進而促進肝癌的發(fā)生和發(fā)展［20］。CYLD在肝細胞中的失活會導致細胞凋亡、炎癥、纖維化和腫瘤發(fā)生。肝臟特異性CYLD通過自發(fā)的慢性激活TGF-β活化激酶1（TAK1）和C-Jun N端激酶（JNK）而阻止肝細胞程序性死亡，引起肝星狀細胞和庫普弗細胞活化，從而促進肝細胞的纖維化、炎癥、腫瘤壞死因子的產生，以及肝細胞凋亡向中央靜脈的擴張，后期代償性增殖導致癌灶形成［21］。也就是說，去泛素酶CYLD 在肝細胞中的失活會導致腫瘤發(fā)生。在肝癌細胞系中過表達野生型CYLD可抑制細胞增殖，但不影響細胞凋亡、黏附和遷移。Pannem 等［22］通過對81例人肝癌組織的免疫組織化學和組織芯片分析發(fā)現，CYLD的表達與增殖標志物Ki-67和c-MYC的表達呈負相關，即CYLD 的下調可誘導腫瘤細胞增殖，促進肝癌的侵襲性生長。因此，CYLD可作為肝癌進展的潛在標志物。

2.4 其他去泛素化酶在肝癌中的作用

USP9 可以被XLNC473 募集來抑制Survivin 的泛素化水平，增加Survivin 的表達，增強肝癌細胞的增殖和侵襲，并誘導上皮-間質轉化（EMT）過程［23］，這與USP22 有著相似的功能。USP39 表達下調將細胞周期阻滯在G2/M 期，從而抑制肝癌細胞的生長［24］。因此，上調USP39 表達能促進肝癌細胞增殖［25］。USP4/CypA復合物通過去泛素化作用抑制CypA在肝癌細胞中的降解，激活MAPK信號通路，阻止CrkII磷酸化，促進肝癌細胞的生長、遷移和侵襲［26］。另外，USP4 通過去泛素化其下游靶分子TAK1，進而抑制TAK1激酶活性及下游NF-κB和JNK等通路活性，從而有效改善肝臟細胞脂肪堆積，防止肝代謝紊亂的進一步發(fā)展［27］。USP11 可以促進HCC 細胞的遷移和侵襲，且與血管侵犯（P=0.033）、分化（P=0.027）、腫瘤數目（P=0.009）、復發(fā)（P=0.036）和較短的總生存時間（P=0.001）有關［28］。其他泛素酶成員如USP5、USP18、USP27、USP30、USP14 等，都是通過作用于其下游靶基因表達而促進腫瘤發(fā)生發(fā)展［29-32］。USP10 在肝癌中發(fā)揮抑癌作用，其通過穩(wěn)定AMPKα 和PTEN 進而抑制mTORC1激活，這為臨床上以mTOR信號通路為導向的靶向治療奠定了理論基礎［33］。在化學誘導的小鼠肝癌模型中，缺乏USP28 的小鼠更容易形成腫瘤，提示USP28 參與肝癌的抑制，并有可能成為肝癌的預后標志物［34］。

3 去泛素化酶抑制劑在肝癌中的研究進展

去泛素化酶抑制因子WP1130 聯合阿霉素治療肝癌，其機制在于通過促進P53的泛素化降解來抑制阿霉素介導的p53 上調［35］，即WP1130 可以提高阿霉素的化療敏感性，這對于指導臨床化療的聯合用藥有重要意義。USP7抑制劑P22077可以抑制Huh7和SK-Hep1 等肝癌細胞的增殖和遷移，并且在肝癌的異種移植模型中有效的抑制了腫瘤的生長［18，36］。BAP15是泛素特異性肽酶14（USP14）的強效選擇性抑制劑，能顯著降低肝癌細胞活力，增加細胞凋亡，并干擾細胞周期，降低細胞周期相關蛋白的表達。此外，這種抑制作用呈劑量依賴性。同時，B-AP15 通過增強內質網應激/UPR和抑制Wnt/Notch1信號通路來誘導肝癌細胞的細胞毒性反應［37］。這一新發(fā)現為B-AP15抗腫瘤治療作用提供了新的機制。USP22通過激活SIRT1/AKT/MRP1 通路促進肝癌細胞中的MDR，而USP22 的特異性抑制劑LY294002 可以通過對AKT通路的抑制導致MRP1的下調，從而抑制癌癥進展［12］。蛋白酶體相關的去泛素化酶抑制劑金諾芬（auranofin）可以聯合乙醛脫氫酶抑制劑雙硫侖（disulfiram）協(xié)同誘導肝癌癌細胞的凋亡［38］，可作為潛在的新型抗癌策略。另外，PR619作為一種非特異性的去泛素化酶抑制劑，可以作用于多種去泛素化酶。這些都為尋找肝癌新的藥物治療靶點提供了理論依據。

4 總結與展望

晚期肝癌的化療，如FOLFOX方案取得了一定療效，可以延長患者生存至6.5個月。靶向藥物索拉非尼、瑞格非尼、侖伐替尼等相繼獲批用于肝癌治療，但總體有效率較低。雖然免疫檢查點PD-1 抑制劑等逐步用于肝癌的治療中，但總體效果不令人滿意。因此，積極探索肝癌發(fā)生的分子機制對于研發(fā)新的肝癌靶向藥物具有重要的臨床意義。泛素化以及去泛素化作為調控細胞內蛋白質水平和活性的重要步驟，在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。目前關于去泛素化酶在肝癌中作用的研究較少，僅有14個USP 家族（包括USP 亞家族的CYLD）的去泛素化分子被報道。其中有關USP22 的研究相對較多，且USP22的特異性抑制劑LY294002已被證明可以抑制癌癥進展，但尚未開展相關臨床試驗，對去泛素化酶及其抑制劑作用有待全面深入的了解，為肝癌的靶向治療提供參考依據。