謝瑩，蔡國林，劉逸凡，陸健

1(吉林化工學院 生物與食品工程學院，吉林 吉林，132022) 2(工業(yè)生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122) 4(糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

雙歧桿菌作為益生菌，其營養(yǎng)性和治療作用已被廣泛認可。主要包括平衡腸道菌群，改善乳糖耐受性，降低血液中的膽固醇水平及促進維生素B族的生物合成等[1-3]。迄今為止，一些細菌胞外多糖(exopolysaccharides, EPS)已經(jīng)進行了商業(yè)化生產(chǎn)，并用于食品、藥品及保健品等領域，如黃原膠、結冷膠、右旋糖苷和透明質酸等[4]，但雙歧桿菌等常用益生菌的胞外多糖還鮮有商業(yè)化應用的報道。研究表明雙歧桿菌具有益生功能的主要分子機制依賴于自身分泌的胞外多糖[5]。益生菌胞外多糖具有調(diào)節(jié)腸道菌群、抗氧化[6-7]、改善和提高免疫力[8]、抗炎癥[9]、抗腫瘤[10-11]以及降低膽固醇等益生功能[12]。本研究主要對雙歧桿菌BB12胞外多糖的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，并通過體外試驗進行了胞外多糖抗氧化活性的研究，為開發(fā)益生菌胞外多糖在醫(yī)藥、食品和保健品中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimalsssp.lactis)BB12，江南大學食品學院提供。

1.2 培養(yǎng)基

改良MRS培養(yǎng)基：胰蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，檸檬酸三銨2 g，乙酸鈉5 g，吐溫-80 1 mL，K2HPO42 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·H2O 0.05 g，L-半胱氨酸鹽酸鹽1 g，加蒸餾水定容至1 L，醋酸調(diào)pH值為7。

1.3 主要試劑

酵母提取物、蛋白胨，上海生工生物工程有限公司；FeCl3、三氯乙酸、FeSO4、K3Fe(CN)6、KH2PO4、K2HPO4均為分析純，北京化工有限公司；鄰苯三酚、蒽酮、H2O2、Tris等試劑，國藥集團化學試劑有限公司。

1.4 雙歧桿菌胞外多糖發(fā)酵單因素試驗

1.4.1 初始pH值對雙歧桿菌胞外多糖發(fā)酵的影響

將雙歧桿菌接種于改良MRS培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH值分別為6、6.5、7、7.5、8和8.5，37 ℃培養(yǎng)96 h，透析除去發(fā)酵液中的單糖和寡糖后測定發(fā)酵液胞外多糖的產(chǎn)量。采用蒽酮-硫酸比色法測定，方法參照《生物化學實驗》執(zhí)行[13]。

1.4.2 培養(yǎng)溫度對雙歧桿菌胞外多糖發(fā)酵的影響

將雙歧桿菌接種于改良的MRS培養(yǎng)基中，分別在25、30、33、37和41 ℃培養(yǎng)96 h，測定發(fā)酵液胞外多糖的產(chǎn)量，方法同上。

1.4.3 培養(yǎng)時間對雙歧桿菌胞外多糖發(fā)酵的影響

將雙歧桿菌接種于改良的MRS培養(yǎng)基中，在37 ℃分別培養(yǎng)48、60、72、84、96和108 h，測定發(fā)酵液胞外多糖的產(chǎn)量，方法同上。

1.5 響應面法優(yōu)化雙歧桿菌胞外多糖發(fā)酵條件

在單因素實驗的基礎上，選擇初始pH(A)、培養(yǎng)溫度(B)、培養(yǎng)時間(C)作為響應變量，以雙歧桿菌胞外多糖含量作為響應值，設計3因素3水平響應面試驗，利用Design Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken Design(BBD)方法設計試驗，并對試驗數(shù)據(jù)進行分析，通過擬合得到二階響應面模型，確定最優(yōu)試驗條件。

1.6 雙歧桿菌胞外多糖的體外抗氧化活性研究

1.6.1 還原能力測定

參考WANG等[14]的方法并進行了改進。將10 g/L的K3Fe(CN)61 mL、0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液1.5 mL(pH 6.6)和純化后的多糖樣品(0.05、0.25、0.5、0.75、1 mg/mL)1 mL混勻后，50 ℃水浴20 min，向混合物中加入體積分數(shù)20%三氯乙酸1 mL，5 000 r/mim離心10 min，取上清，加入新鮮的1 g/L FeCl30.25 mL，混勻，700 nm波長處測定吸光度。去離子水和Vc分別作空白和陽性對照。

1.6.2 ·OH的清除作用

用H2O2-FeSO4體系研究胞外多糖對·OH的清除作用。將25 mmol/L FeSO41 mL、2 mmol/L水楊酸鈉1 mL、6 mmol/L H2O21 mL和純化后的多糖樣品(0.05、0.25、0.5、0.75、1 mg/mL)1 mL混合均勻，于37 ℃水浴30 min，8 000 r/min離心3 min，510 nm波長處測定吸光度，用相同質量濃度的Vc作陽性對照[15]?！H清除率的計算如公式(1)所示：

(1)

(2)

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0分析，重復3次實驗取平均值，在圖中以平均值±標準偏差表示，并進行單因素方差分析數(shù)據(jù)差異的顯著性(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 初始pH值的影響

將雙歧桿菌BB12接種于不同pH值的改良MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)96 h，發(fā)酵液胞外多糖的產(chǎn)量如圖1所示。初始pH值在6～7.5時，發(fā)酵液胞外多糖產(chǎn)量升高顯著(P<0.05)，在7.5～8時，升高不顯著(P>0.05)。當初始pH值為8時，胞外多糖的產(chǎn)量達到最大值(129.5±5) mg/L，然后略有下降。雖然pH值在7.5～8.5時胞外多糖產(chǎn)量變化不顯著，但產(chǎn)量較高，可以通過后續(xù)的響應面試驗進行優(yōu)化，并對多因素間的顯著性進行分析。

圖1 不同初始pH對EPS產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of different initial pH on EPS yield注：不同的字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

2.1.2 培養(yǎng)溫度的影響

雙歧桿菌BB12在不同溫度下培養(yǎng)96 h，發(fā)酵液胞外多糖的產(chǎn)量如圖2所示。

圖2 不同培養(yǎng)溫度對EPS產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of different incubation temperature on EPS yield

培養(yǎng)溫度對胞外多糖的產(chǎn)量具有雙重影響。溫度從25 ℃升高到37 ℃時，胞外多糖產(chǎn)量增加顯著(P<0.05)，當培養(yǎng)溫度達到37 ℃，胞外多糖的產(chǎn)量最高為(109.8±4.9) mg/L，隨后下降不顯著(P>0.05)。因此，選擇37 ℃為響應面優(yōu)化試驗的中心點。當培養(yǎng)溫度較低時，胞內(nèi)酶促反應速率下降，導致菌體生長和代謝緩慢。培養(yǎng)溫度過高，細胞內(nèi)酶活性又重新受到抑制，使代謝產(chǎn)生的多糖含量降低。

2.1.3 培養(yǎng)時間的影響

雙歧桿菌BB12在37 ℃培養(yǎng)不同時間，發(fā)酵液胞外多糖的含量見圖3。培養(yǎng)時間從48 h增加到96 h，胞外多糖的產(chǎn)量增加顯著(P<0.05)，培養(yǎng)96 h產(chǎn)量最高，為(125.8±6.5) mg/L，此時生長達到穩(wěn)定期，代謝活躍，不斷積累代謝產(chǎn)物。隨著培養(yǎng)時間延長，產(chǎn)量反而下降，但不顯著(P>0.05)，可能由于雙歧桿菌利用了自身產(chǎn)生的胞外多糖。因此，選擇96 h為后續(xù)響應面優(yōu)化試驗的中心點，進一步研究不同因素間的交互作用。

圖3 不同培養(yǎng)時間對EPS產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of different incubation time on EPS yield

2.2 雙歧桿菌BB12胞外多糖發(fā)酵條件的優(yōu)化

在單因素試驗的基礎上，以初始pH值、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間為自變量，胞外多糖產(chǎn)量為響應值，進行響應面優(yōu)化，采用Design Expert 8.0.6軟件設計試驗方案，其結果見表1。

表1 響應面設計方案及結果Table 1 Design and results of response surface experiments

對表1數(shù)據(jù)進行分析，得到胞外多糖的產(chǎn)量與初始pH值(A)、培養(yǎng)溫度(B)及培養(yǎng)時間(C)的二次多項回歸方程：Y=127.56+4.48A+7.14B+7.69C-2.13AB-3.38AC-2.00BC-4.08A2-11.96B2-7.91C2。對回歸模型進行方差分析和可信度分析，結果如表2所示。

表2 回歸模型的方差分析Table 2 Variance analysis of regression model

注：*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)。

由表2可知，模型F=31.74，P<0.000 1，說明該回歸方程是極顯著的。失擬項不顯著，說明該模型模擬性較好，且R2分別為0.976 1和0.945 3，說明該模型具有較好的回歸性。模型數(shù)據(jù)顯示，一次項A、B、C及二次項B2、C2影響極顯著(P<0.01)，A2交互項AC影響顯著(P<0.05)，各因素的影響主次順序：C>B>A，即培養(yǎng)時間>培養(yǎng)溫度>初始pH值。利用Design Expert 8.0.6軟件獲得了各因素的最佳培養(yǎng)條件為：初始pH值為8.11、培養(yǎng)溫度37.38 ℃、培養(yǎng)時間101.39 h，在此條件下獲得的胞外多糖產(chǎn)量預測值為130.308 mg/L。為了驗證響應面模型的有效性，考慮到實際操作的方便性，將各因素修正為初始pH值為8.0、培養(yǎng)溫度37 ℃、培養(yǎng)時間101 h，在此修正的最佳培養(yǎng)條件下進行3次平行試驗，得出雙歧桿菌BB12胞外多糖的產(chǎn)量為(131.6±0.82) mg/L，經(jīng)顯著性分析，與響應面中心點的5組平行試驗得到的胞外多糖產(chǎn)量(127.56±2.03) mg/L相比具有顯著性(P<0.05)，雖然只改變了培養(yǎng)時間，但培養(yǎng)時間為主要影響因素，而且初始pH與培養(yǎng)時間交互項影響顯著，因此該優(yōu)化條件是可行的。

2.3 雙歧桿菌BB12胞外多糖的體外抗氧化活性

2.3.1 還原能力測定

粗胞外多糖分別經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換色譜柱和Sepharose CL-6B凝膠柱純化后，得到1個吸收峰，收集對應的糖液凍干，進行體外抗氧化活性研究(該試驗結果圖沒有在本論文中列出)。胞外多糖的還原力如圖4所示，隨著多糖含量的增加，還原力呈線性增加，當多糖初始質量濃度為0.75 mg/mL時，還原力趨于平穩(wěn)，但低于Vc的還原力。

圖4 EPS和Vc的還原能力Fig.4 Ferric reducing power of EPS and Vc

2.3.2 ·OH的清除作用

如圖5所示，雙歧桿菌BB12胞外多糖對·OH的清除效果較強，隨著多糖濃度的增加清除率升高，多糖初始質量濃度在0～1 mg/mL的范圍內(nèi)，·OH的清除率高于Vc，50%清除濃度(IC50)為 0.47 mg/mL,比Vc低。

圖5 EPS和Vc的·OH清除率Fig.5 ·OH scavenging activity of EPS and Vc

圖6 EPS和Vc的清除率 scavenging activity of EPS and Vc

3 結論