唐小曼，唐垚，張其圣，汪冬冬，陳功，李恒，明建英，余文華，劉清斌

1(四川理工學(xué)院，四川 自貢,643000) 2(四川東坡中國泡菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，四川 眉山,620000)3(四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院，四川 成都,611130)

四川工業(yè)泡菜是一種高鹽發(fā)酵蔬菜，多采用新鮮豇豆、蘿卜、青菜、榨菜等為原料，通過利用蔬菜自身攜帶的微生物，在相對封閉的鹽漬池中自然發(fā)酵而成的輔餐或調(diào)味食品[1]，其中泡豇豆因酸爽脆嫩、風味獨特而深受廣大消費者的青睞[2-3]，且豇豆中還含有豐富的氨基酸[4]等對人體有益的營養(yǎng)物質(zhì)。近年來由于人們對食品的安全意識逐漸提高，國內(nèi)外研究人員對發(fā)酵蔬菜潛在的風險因素也做了很多研究，如對生物胺的研究。

生物胺是一類含氮、具有生物活性的堿性低分子量有機化合物，主要通過機體細胞的代謝或微生物體內(nèi)的脫羧反應(yīng)形成[5]。生物胺是生物體內(nèi)正常的活性成分，起著重要的生理作用，但當人體外源攝入過量生物胺就會造成一些不良癥狀[6]，而且生物胺還是致癌性亞硝胺的前體物質(zhì)[7-8]。已有研究表明，發(fā)酵蔬菜的生物胺含量可能存在安全隱患，而國內(nèi)外對發(fā)酵蔬菜中生物胺的研究主要集中在含量測定，對其形成和降解研究較少，因此，本研究以發(fā)酵成熟的四川工業(yè)泡豇豆為研究對象，測定其生物胺和游離氨基酸的含量，采用Illumina HiSeq 4000 平臺對其進行宏基因組測序，并在NR和KEGG數(shù)據(jù)庫上進行注釋，探明主要生物胺的形成和降解與微生物及酶的關(guān)系，為研究發(fā)酵蔬菜中生物胺的形成及降解提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

四川工業(yè)泡豇豆2份，四川省眉山市某知名泡菜企業(yè)，發(fā)酵成熟并貯藏1年以上；新鮮豇豆，四川省眉山市某超市；組胺、腐胺、酪胺、尸胺、色胺、苯乙胺、精胺、亞精胺生物胺標準品，美國Sigma-Aldrich公司；乙腈、甲醇等色譜純?nèi)軇?，天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；Magnetic soil and stool DNA kit，北京天根生化科技(北京)有限公司；TruSeqTMDNA Sample Prep Kit、HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit、HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit、HiSeq 3000/4000 SBS Kits，美國Illumina公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-2030高效液相色譜儀，日本島津公司；MJ-54A高壓滅菌鍋，美國STIK公司；Nano Drop 2000分光光度計，美國Thermo公司；Covaris M220超聲波DNA破碎儀，美國Illumina公司；Illumina Hiseq 4000測序平臺，上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 生物胺的測定

1.3.1.1 樣品前處理

準確稱取10 g樣品于50 mL離心管中，加入1.25 mL 1.0 g/L的內(nèi)標使用液(1,7-二氨基庚烷，10 g/L)與10 mL 0.1 mol/L的HCl溶液，振蕩30 min，4 000 r/min離心20 min，取上清液；沉淀部分再加入15 mL 0.1 mol/L的HCl溶液，振蕩30 min，4 000 r/min離心20 min，合并上述2次上清液，并用0.1 mol/L的HCl溶液定容至50 mL。

1.3.1.2 生物胺標準溶液制備與樣品衍生

生物胺標準溶液的配制參照GB/T 5009.208—2016《食品中生物胺含量的測定》。根據(jù)FRIAS等[9]研究方法稍作改動，測定樣品常見的8種生物胺。取1.0 mL標準溶液于50 mL離心管中，依次加入200 μL 2 mol/L NaOH溶液、300 μL飽和NaHCO3溶液緩沖，再加入2.0 mL丹酰氯衍生劑(10 g/L，溶劑為丙酮)，振蕩混勻后40 ℃避光水浴60 min，每15 min振蕩1次。加入200 μL 100 g/L脯氨酸溶液，旋渦1 min后于室溫避光放置15 min終止衍生反應(yīng)，再加入0.4 g NaCl旋渦振蕩1 min后加入1 mL乙醚，旋渦振蕩30 s，靜置分層后，吸出上層有機相，再萃取1次，合并有機相，45 ℃水浴揮干。用1.0 mL乙腈溶解殘留物，0.22 μm有機膜過濾，于4 ℃避光保存，用于高效液相色譜測定。樣品溶液衍生的條件及方法與標準溶液相同。

1.3.1.3 色譜條件

色譜柱為C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，紫外檢測波長254 nm，進樣量20 μL，流速0.8 mL/min，柱溫35 ℃，流動相A為乙腈，流動相B為去離子水，梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫程序表Table 1 Gradient elution program list

1.3.2 游離氨基酸測定

1.3.2.1 樣品前處理

取5 g樣品，加水5 mL振蕩混勻，50 ℃水浴30 min，離心，取上清液待用。

1.3.2.2 衍生試劑的制備和氨基酸衍生方法

根據(jù)HU等[10]研究方法稍作改動,測定樣品中的游離氨基酸，取1 600 μL乙腈，200 μL三乙胺和20 μL異硫氰酸苯酯，混合即得衍生試劑。取100 μL氨基酸標準品或待測樣品置于5 mL試管中；加入200 μL衍生試劑，旋渦混合20 s后放置60 min，加入2 mL水和1 mL正己烷，旋渦混合1 min除去上層溶液，再次加入1 mL正己烷，旋渦混合1 min后靜置10 min，取下層溶液待用。

1.3.2.3 色譜條件

色譜柱AgilentXDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，檢測波長為254 nm，進樣量和流速分別為10 μL和1.0 mL /min；柱溫40 ℃；流動相A：V[0.1 mol/L醋酸鈉溶液(pH 6.50)]∶V(乙腈)=93∶7；流動相B:V(水)∶V(乙腈)=20∶80；梯度洗脫條件見表2。

表2 HPLC的梯度洗脫條件Table 2 Gradient elution condition of HPLC

1.3.3 DNA提取及宏基因組測序

樣品濾液4 000 r/min離心5 min，收集2 g以上的菌泥。

根據(jù)Magnetic soil and stool DNA kit操作方法抽提樣品基因組DNA，用Nano Drop2000分光光度計測定抽提的DNA濃度和純度，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提基因組DNA；用Covaris M220超聲波DNA破碎儀將DNA片段化至平均大小為300 bp左右，片段化后采用TruSeqTMDNA Sample Prep Kit試劑盒構(gòu)建PE文庫，將含有完整序列引物雜交位點的銜接子連接到片段末端；采用HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit進行橋式PCR，最后在上海美吉HiSeq測序平臺，采用HiSeq 3000/4000 SBS Kits進行宏基因組測序。

1.2.4 序列質(zhì)控和基因豐度計算

用Seqprep和Sickle軟件對原始序列進行拆分、質(zhì)量剪切等優(yōu)化處理，在NCBI上檢索樣品微生物的基因組DNA，通過BWA軟件比對已發(fā)表的基因組DNA序列，去除比對相似性高的污染序列；使用MEGAHIT軟件對優(yōu)化后的序列進行拼接[11]，使用MetaGene軟件對拼接結(jié)果進行開放性閱讀框預(yù)測(ORFs)[12]；使用CD-HIT軟件對具有95%序列同源性(90%覆蓋度)的預(yù)測基因進行聚類[13]，選擇每個簇的最長序列作為代表構(gòu)建非冗余基因集，使用SOAPaligner軟件分別將每個樣品的高質(zhì)量序列與非冗余基因集進行比對，統(tǒng)計基因在對應(yīng)樣品中的豐度信息[14]。

1.2.5 物種及功能注釋

用BLASTP軟件[15]將非冗余基因與NR數(shù)據(jù)庫和京都基因百科全書(KEGG)基因數(shù)據(jù)庫進行比對(BLAST比對參數(shù)設(shè)置期望值為10～5)。通過NR庫對應(yīng)的分類學(xué)信息數(shù)據(jù)庫獲得物種注釋，構(gòu)建相應(yīng)分類學(xué)水平上的豐度譜；根據(jù)比對結(jié)果使用KOBAS 2.0進行功能注釋，使用Pathway對應(yīng)的基因豐度總和計算該功能類別的豐度。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸、生物胺檢測結(jié)果

如圖1所示,生物胺總含量大于1 000 mg/kg，對人體健康已經(jīng)造成威脅，尸胺、酪胺、腐胺、組胺含量較高，分別占總生物胺含量的27.69%、19.05%、18.03%、17.53%，且樣本中4種生物胺總含量在1 010 mg/kg左右，占8種生物胺總量的82.30%?？梢姌悠分猩锇芬允?、腐胺、組胺、酪胺為主，且與國內(nèi)外研究發(fā)酵蔬菜中生物胺含量的報道一致[16-20]。

圖1 樣品生物胺含量Fig.1 Contents of biogenic amines in samples

氨基酸是生物胺的前體物質(zhì)，因此含有氨基酸脫羧酶基因的微生物可利用氨基酸產(chǎn)生相應(yīng)的生物胺。如圖2所示，豇豆發(fā)酵前后對比發(fā)現(xiàn)，組氨酸、精氨酸、酪氨酸、賴氨酸、鳥氨酸分別減少了153.58、114.02、57.48、85.85、24.46 mg/kg。樣品中主要生物胺的主要前體氨基酸為賴氨酸、鳥氨酸、組氨酸、酪氨酸，但精氨酸酶作用于精氨酸后可產(chǎn)生鳥氨酸，于是可推測，泡豇豆體系中的微生物除利用豇豆的氨基酸供自身生長所需外，還可能利用氨基酸產(chǎn)生生物胺，這可能也是樣品生物胺含量較高的原因之一。

圖2 樣品中5種氨基酸含量Fig.2 Five kinds of amino acids in samples

2.2 主要生物胺形成及降解分析

2.2.1 生物胺關(guān)聯(lián)微生物分析

通過KEGG數(shù)據(jù)庫注釋樣品主要生物胺代謝相關(guān)酶，再篩選宏基因數(shù)據(jù)中這些酶關(guān)聯(lián)到的微生物，并作生物胺關(guān)聯(lián)物種相對豐度圖，如圖3所示。

圖3 關(guān)聯(lián)物種相對豐度Fig.3 Relative abundance of associated species

樣品中微生物主要以乳酸菌、酵母菌和芽孢菌為主，S.lignohabitans、酸魚乳桿菌(Lactobacillusacidipiscis)、白地霉(G.candidum)的相對豐度較高，分別為10.60%、8.15%、6.19%。樣品中生物胺關(guān)聯(lián)微生物主要與腐胺形成與降解、尸胺降解、酪胺降解有關(guān)，且相對豐度>0.5%的物種主要與腐胺形成及降解、尸胺降解有關(guān)，與腐胺形成相關(guān)的微生物相對豐度較腐胺降解關(guān)聯(lián)微生物高，同時具有生物胺形成及降解能力的物種相對豐度為51.05%。研究發(fā)現(xiàn)，L.acidipiscis、費斯莫爾德乳桿菌(Lactobacillusversmoldensis)、凝乳酶乳桿菌(Lactobacillusrennini)、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)5種乳酸菌具有腐胺形成能力[21-22]，Halomonassmyrnensis、HalomonasHG01、Halomonassalina3種鹽單胞菌具有腐胺和尸胺降解能力，Halomonashalodenitrificans具有酪胺降解能力[23]。推測樣品中高含量的生物胺與樣品中高相對豐度的生物胺關(guān)聯(lián)微生物有關(guān)。

2.2.2 主要生物胺代謝通路

圖4～圖7分別表示樣本中4種主要生物胺的代謝與微生物及酶的關(guān)系圖(括號內(nèi)數(shù)字表示該酶關(guān)聯(lián)的物種數(shù)量)。

圖4 腐胺代謝路徑Fig.4 Putrescine metabolic pathway

圖4為結(jié)合KEGG PATHWAY中ko00480、ko00960、ko00330注釋的腐胺代謝通路圖。樣品中腐胺的形成路徑有3條，與微生物利用氨基酸或其他物質(zhì)通過脫羧、轉(zhuǎn)胺、合成有關(guān)，涉及到的酶有鳥氨酸脫羧酶(EC:4.1.1.17)、胍丁胺酶(EC:3.5.3.11)、EC:3.5.1.53等。豐度較高具有EC:4.1.1.17的微生物有L.acidipiscis、L.versmoldensis、假絲酵母(Debaryomyceshansenii)等，具有EC:3.5.3.11的微生物有S.lignohabitans、D.hansenii、Millerozymafarinosa等，具有EC:3.5.1.53的微生物有H.halodenitrificans、H.smyrnensis、Halomonassp. HG01等。樣品中共有89種微生物含有與腐胺形成相關(guān)的酶，其中包括泡菜體系常見的產(chǎn)生物胺乳酸菌[24-26]，如L.brevis含有鳥氨酸脫羧酶和瓊脂脫硫酶，L.lactis含有瓊脂脫硫酶，L.pentosus含有精氨酸酶，且樣本的菌群結(jié)構(gòu)中乳酸菌的相對豐度較高。腐胺可通過氧化、轉(zhuǎn)移、合成等途徑得到降解，其中相對豐度較高具有亞精胺合成酶(EC:2.5.1.16)的微生物有S.lignohabitans、D.hansenii、H.smyrnensis等，具有EC:6.3.1.11的微生物有陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)、unclassifiedfEnterobacteriaceae、桑腸桿菌(Enterobactermori)等，具有EC:1.4.3.10的微生物有Corynebacteriumvariabile、金色棒狀桿菌(Corynebacteriumaurimucosum)、Arthrobactersp. NIO—1057。樣品中有49種微生物含有與腐胺降解相關(guān)的酶，但僅占腐胺形成關(guān)聯(lián)微生物的一半，與腐胺形成和降解相關(guān)的微生物分別有70、45種，但只與腐胺形成、腐胺降解相關(guān)的微生物分別是48、13種，同時含有腐胺降解和形成相關(guān)酶的L.acidipiscis、D.hansenii、M.farinosa等8種微生物相對豐度較高，因此推測樣品中高含量的腐胺不僅與腐胺形成微生物的數(shù)目及表達能力有關(guān)，還可能與微生物實際參與的代謝途徑有關(guān)。

圖5為結(jié)合KEGG PATHWAY中ko00340注釋的組胺代謝通路圖。組胺只由微生物通過組氨酸脫羧酶(EC:4.1.1.22)作用于組氨酸脫羧形成，樣品中具有該能力的微生物有2種(Halomonaselongata、Lactobacillushilgardii)。組胺可以通過酶氧化[27-29]、基團轉(zhuǎn)移、化學(xué)合成3條途徑得到降解，但未在樣品中發(fā)現(xiàn)有與這3條降解路徑相關(guān)的微生物。分析可能由于樣品中的微生物含有產(chǎn)生組胺的酶，而沒有降解組胺的酶，從而導(dǎo)致樣品中檢測出高含量的組胺。

圖5 組胺代謝路徑Fig.5 Histamine metabolic pathway

圖6為結(jié)合KEGG PATHWAY中ko00350、ko00680、ko00950注釋的酪胺代謝通路圖。酪胺可通過酪氨酸脫羧酶(EC:4.1.1.25)作用于酪氨酸脫羧酶形成，樣本中有2種微生物(Natronococcusamylolyticus)、嗜鹽球菌(Halococcusmorrhuae)含有EC:4.1.1.25。酪胺降解的途徑只有1條，涉及到的微生物有6種H.halodenitrificans、Propionibacteriumacidipropionici、鹽堿球菌(Natronococcusoccultus)等，均為通過單胺氧化酶(EC:1.4.3.4)來降解酪胺。但有報道[30]稱，生物胺本身也有抑制生物胺氧化酶活性的作用，如酪胺能抑制單胺氧化酶的活性，色胺抑制二胺氧化酶的活性[31]，從而抑制某些生物胺的降解。LEUSCHNER等[32]認為酪胺氧化酶最適pH值為7～8，并且還受食鹽和葡萄糖添加量的影響[33]，因此在豇豆發(fā)酵過程中酪胺氧化酶、單胺氧化酶活性可能會受到抑制，單胺氧化酶作用于酪胺的強度受到限制，可能導(dǎo)致酪胺難以降解，并逐漸積累。

圖6 酪胺代謝路徑Fig.6 Tyramine metabolism pathway

圖7為結(jié)合KEGG PATHWAY中ko00310、ko00960、ko00480注釋的尸胺代謝通路圖。樣品中尸胺的合成路徑只有1條，且注釋到尸胺合成路徑的微生物有10種，皆是通過自身的賴氨酸脫羧酶(EC:4.1.1.18)作用于賴氨酸產(chǎn)生尸胺，其中豐度較高的微生物有E.cloacae、癌桿菌(Oceanobacillusoncorhynchi)等。尸胺主要通過氧化、轉(zhuǎn)移、合成3種途徑降解，關(guān)聯(lián)的微生物共有47種，豐度較高具有EC:2.5.1.16的微生物有S.lignohabitans、D.hansenii、H.smyrnensis等，具有伯胺氧化酶(EC:1.4.3.21)的微生物有S.lignohabitans、G.candidum、D.hansenii等，具有腐胺氨基轉(zhuǎn)移酶(EC:2.6.1.82)的微生物有E.cloacae、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、Klebsiellacf.PlanticolaB43等。數(shù)據(jù)顯示高豐度的S.lignohabitans不僅含有酶EC:2.5.1.16，還含有酶EC:1.4.3.21。E.cloacae不僅含有尸胺合成酶，還含有尸胺降解酶。

圖7 尸胺代謝路徑Fig.7 Cadaverine metabolic pathway

除綜上所述有8種微生物同時與腐胺的形成及降解相關(guān)外，據(jù)宏基因數(shù)據(jù)顯示，有6種微生物，如腸桿菌(Enterobacterasburiae)、unclassifiedgEnterobacter、E.cloacae[16]、催產(chǎn)克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)、D.hansenii、油桃千酵母菌(Millerozymaarinosa)，同時與腐胺、尸胺的形成與降解相關(guān)，其中包含腸桿菌，這與相關(guān)報道[21-23]腸桿菌產(chǎn)生物胺相一致。unclassifiedfEnterobacteriaceae與尸胺的形成和降解相關(guān)，E.hormaechei與腐胺和尸胺的形成相關(guān)，A.sp. NIO-1057與腐胺和尸胺的降解相關(guān)，N.occμLtus與尸胺和酪胺的降解相關(guān)。不難發(fā)現(xiàn)，一種微生物可能同時與不同生物胺的形成和降解相關(guān)，這與生物胺形成菌的相關(guān)報道[21-22]一致。有研究[34]發(fā)現(xiàn)菌株可以選擇性釋放胞內(nèi)生物胺來保持環(huán)境pH值的平衡，且環(huán)境低pH值能激活細菌的脫羧代謝途徑，在低pH值下增加生物胺產(chǎn)生量以提高對酸性環(huán)境的抵抗能力[35-36]，此時，賴氨酸→尸胺，鳥氨酸→腐胺的產(chǎn)生途徑相對其他生物胺產(chǎn)生途徑更為有效。DAPKVICIUS等[33]研究表明，二胺氧化酶的最適pH為7.00，在5.00～10.00時，此酶都有活性，但當pH在5.00和10.00時酶活都很低。王振等[30]研究發(fā)現(xiàn)，pH 4.0～5.5的酸性環(huán)境有利于提高微生物體內(nèi)的氨基酸脫羧酶活性，從而促進微生物產(chǎn)生生物胺，而微生物產(chǎn)胺氧化酶非常有限[37]?？梢姌悠分猩锇返暮坎粌H與產(chǎn)生物胺微生物種類[24,38-39]、數(shù)量有關(guān)，還與參與途徑時關(guān)聯(lián)酶的表達能力有關(guān)。

3 結(jié)論

利用KEGG數(shù)據(jù)庫分析樣品宏基因數(shù)據(jù)，得到樣品的主要生物胺代謝路徑及關(guān)聯(lián)的物種和酶，發(fā)現(xiàn)樣品中主要生物胺腐胺、尸胺、酪胺、組胺代謝關(guān)聯(lián)的物種相對豐度較高。具有主要生物胺形成及降解能力的物種相對豐度高達51.05%，且同一種微生物可能參與生物胺的多條代謝路徑。樣品中高含量的腐胺、尸胺、酪胺、組胺不僅來源于豇豆本身，而且可能更多地來源于高豐度的產(chǎn)生物胺微生物利用豇豆豐富的氨基酸資源產(chǎn)生生物胺，而微生物的種類、數(shù)量與其參與生物胺代謝時的表達能力也對生物胺含量有一定影響。本研究揭示了四川工業(yè)泡豇豆中生物胺形成及降解與關(guān)聯(lián)微生物及酶的關(guān)系，確定了四川工業(yè)泡豇豆主要生物胺形成及降解的路徑，不僅為企業(yè)實際應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐，還為發(fā)酵蔬菜生物胺的形成及降解奠定理論基礎(chǔ)。