朱霞建，談安群，范佳瑩，李則靈，周琦，易鑫，李貴節(jié)，郭莉，譚祥，黃林華，王華

(西南大學 柑桔研究所，重慶,400712)

橙汁加工過程中會產(chǎn)生大量的果皮渣、果肉渣和種籽等副產(chǎn)物，工業(yè)上一般是將這些副產(chǎn)物作填埋處理或直接丟棄，造成資源浪費和環(huán)境污染[1-2]。目前，這些加工廢渣主要用于提取精油、檸檬苦素、黃酮等功能性成分，存在成本高、提取率低等問題；也可經(jīng)干燥或發(fā)酵后作為動物飼料，但由于味苦、不利于動物消化，利用率較低[3-5]。果肉渣中糖含量約為8%～11%，以小分子糖如葡萄糖、蔗糖、果糖的形式存在，并且含有豐富的膳食纖維，精油含量極低[6]。因此，柑橘果肉渣是優(yōu)質的發(fā)酵原料。

本研究以榨汁后的甜橙果肉渣為原料，結合酶工程技術，通過發(fā)酵制備新型柑橘果酒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜橙果肉渣,西南大學柑桔研究所中試車間；果酒酵母RC212、果酒酵母D254、果酒酵母EC1118(A1、A2、A3)，拉曼德公司；果酒酵母SY、果酒酵母RW、高活性干酵母(A4、A5、A6)，安琪酵母公司；沒食子酸、綠原酸、咖啡酸等標準品，北京索萊寶科技有限公司；果膠酶(50 000 U/g)，諾維信有限公司；福林酚試劑，北京索萊寶科技有限公司；NaNO2，Al(NO3)2，Na2CO3等，成都市科龍化工試劑廠,均為分析純。

1.2 儀器與設備

TU-1901紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；BT224S電子天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；Ultimate3000高效液相色譜儀，美國戴安公司;阿貝折光儀，上海精密科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

操作要點：果肉渣按一定比例加水混勻后打漿，按果漿的總質量加入質量分數(shù)0.05%的果膠酶置于45 ℃酶解90 min；成分調整：添加焦亞硫酸鉀使SO2質量濃度為50 mg/L后，再用檸檬酸調節(jié)pH至4.0。

酵母活化：稱取一定量的活性干酵母,加入20倍質量的5%蔗糖溶液，在35 ℃下活化20 min。發(fā)酵前期通氣攪拌，并觀察發(fā)酵液中無氣泡產(chǎn)生即主發(fā)酵結束。繼續(xù)發(fā)酵10～15 d后至殘?zhí)橇俊?2 g/L停止發(fā)酵。用100目紗布過濾分離酒渣，酒液轉至12～18 ℃下低溫陳釀30 d。采用硅藻土進行下膠澄清處理后即為甜橙果肉渣發(fā)酵酒。

1.3.2 單因素試驗

調整初始糖度為22%、接種量為0.2%、發(fā)酵溫度28 ℃，考察加水比例(1∶0、1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2)對發(fā)酵酒的影響；選取最佳加水比例，調整初始糖度為22%、接種量為0.2%、發(fā)酵溫度28 ℃，考察酵母種類(A1、A2、A3、A4、A5、A6)對發(fā)酵酒的影響；選用最佳菌種及比例，調整初始糖度22%、發(fā)酵溫度28 ℃，考察接種量(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%)對發(fā)酵酒的影響；選用最佳菌種及比例，調整酵母接種量為0.2%、發(fā)酵溫度28 ℃，考察初始糖度(18%、20%、22%、24%、26%)對發(fā)酵酒的影響；選用最佳菌種及比例，調整初始糖度22%、接種量0.2%，考察發(fā)酵溫度(22、24、26、28、30 ℃)對發(fā)酵酒的影響。

1.3.3 響應面優(yōu)化發(fā)酵工藝

在單因素試驗的基礎上，選擇以菌種接種量、初始糖度和發(fā)酵溫度3個因素進行響應面優(yōu)化試驗，以感官評分、黃酮和總酚含量為響應指標，確定果肉渣發(fā)酵酒的最佳工藝條件，因素與水平如表1所示。

表1 響應面試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface infermentation process

1.3.4 指標測定

1.3.4.1 得酒率的計算

得酒率計算如公式(1)所示：

(1)

1.3.4.2 理化指標的測定

酒精度按GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》采用酒精計法[7]；殘?zhí)橇坎捎弥苯拥味ǚy定[16]。黃酮含量參考TIAN等[8]的方法，采用NaNO2-Al(NO3)3方法，稍作改進。以蘆丁為標準品，標準曲線的回歸方程為：y=719.61x-9.223 5，R2=0.998 7?？偡雍繀⒖糄U等[9]的方法，采用Folin-Ciocaltue法，略作修改。以沒食子酸為對照品，繪制標準曲線為：y=61.489x+1.999，R2=0.997 2。

1.3.4.3 感官評價

由10位課題組同學經(jīng)過專業(yè)培訓后組成感官評定小組，參照葡萄酒、果酒通用分析方法中的感官評定方法，從外觀、香氣、口感、風格4個方面，根據(jù)表2的評分標準進行評分，最終結果取平均值。

1.3.4.4 酚類物質的測定

樣品的制備：取10 mL發(fā)酵酒用2 mol/L NaOH調節(jié)pH為7左右，加入10 mL乙酸乙酯反復萃取3次取上清液，殘液用2 mol/L HCl調節(jié)pH為2左右，重復萃取3次后合并上清液，在40 ℃下旋轉蒸發(fā)至干，用2 mL體積分數(shù)80%甲醇復溶，過0.22 μm有機濾膜，待測[10]。

表2 果肉渣發(fā)酵酒評分標準Table 2 Criteria for sweet orange fermented wine

色譜條件[11]：色譜柱為Venusil MP C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫30 ℃，進樣量為20 μL，流速1 mL/min；流動相A為1%冰乙酸溶液，B為甲醇。對于酚酸，洗脫程序為：0～20 min，20%B；20～50 min，50%B；50～60 min，100%B；60～90 min，20%B；檢測波長為260、320 nm。對于類黃酮，洗脫程序為：0～30 min，25%～45%B；30～50 min，45%B；50～60 min，100%B；60～90 min，25%B；檢測波長283、330 nm。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將3次重復的試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，用Design-Expert 8.0.6進行響應面設計和結果分析，以Origin 8.0.5繪圖軟件繪制試驗結果圖，采用SPSS Statistics 25.0進行差異性顯著分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 加水比例對果肉渣發(fā)酵酒的影響

不同加水比例對果肉渣發(fā)酵酒的影響如表3所示。當加水比例為1∶0.5時，得酒率、黃酮與總酚含量較高，感官評分最高，果酒色澤良好，酒香濃郁協(xié)調。此后，加水比例越大，得酒率越高，但總酚和黃酮含量隨之降低，發(fā)酵所需糖分增大，生產(chǎn)成本增加，果酒中橘香味和酒香味降低，感官評分降低，口味寡淡。由于果肉渣本身水分含量較高，在固態(tài)發(fā)酵條件下(即加水比例為1∶0)仍能產(chǎn)生酒精，但得酒率較低，果肉渣中的多酚及類黃酮等物質并未充分溶出，導致總酚與黃酮含量較低。因此確定加水比例為1∶0.5。

表3 加水比例對果肉渣發(fā)酵酒的影響Table 3 Effects of different material/water ratios on sweet orange fermented wine

注：每列中不同的字母表示顯著性差異。下同。(P<0.05)

2.1.2 菌種種類對果肉渣發(fā)酵酒的影響

不同的酵母菌種在發(fā)酵能力、產(chǎn)香等方面對果酒品質具有重大影響[12]。如表4所示，果肉渣發(fā)酵酒的酒精度之間存在顯著性差異(P<0.05)。A1、A2、A6菌種發(fā)酵酒的總酚與黃酮含量低，口味寡淡，感官評分也較低；A3、A5菌種發(fā)酵酒的黃酮含量與感官評分較高，但酒精度與總酚含量低；而A4菌種發(fā)酵酒的總酚與黃酮含量較高，酒精度較高，為(11.57±0.04)%，感官評分最高為(84.51±0.9)分，酒體醇厚，柑橘香味與酒香味濃郁協(xié)調并且口感較佳，綜合分析，選擇A4菌種作為果肉渣發(fā)酵酒的酵母菌種。

表4 菌種種類對果肉渣發(fā)酵酒的影響Table 4 Effect of different species on sweet orange fermented wine

2.1.3 接種量對果肉渣發(fā)酵酒的影響

由圖1可知，隨著酵母接種量增大，酒精度與感官評分先上升后下降，當酵母接種量為0.2%，酒精度最大值為11.4%。這是因為酵母接種量低于0.2%時，酵母菌生長緩慢，產(chǎn)生酒精速度慢，發(fā)酵周期延長，口感欠佳；當酵母接種量超過0.2%時，酵母生長代謝旺盛,消耗發(fā)酵液中大量的營養(yǎng)物質導致酒精產(chǎn)量較低，同時過多的酵母菌殘留不利于果酒澄清并降低發(fā)酵酒的風味與口感[13-14]?？偡优c黃酮均呈下降趨勢，黃酮含量在接種量超過0.2%后顯著降低(P<0.05)，其原因是酵母量增加，消耗了多酚及黃酮類物質[15]。綜上考慮，選擇酵母接種量為0.1%～0.2%之間進行優(yōu)化試驗。

圖1 接種量對果肉渣發(fā)酵酒的影響Fig.1 Effect of inoculation amount on sweet orangefermented wine

2.1.4 初始糖度對果肉渣發(fā)酵酒的影響

由圖2可以看出，隨著初始糖度的增大，殘?zhí)橇恐饾u增加，酒精度與黃酮含量先升高后降低，總酚含量呈上升趨勢。當初始糖度為22%時，酒精度與黃酮含量達到最大值，當初始糖度低于22%時，由于糖分含量不足導致生成的酒精度較低，當初始糖度超過22%時，過多的糖分增加發(fā)酵液的滲透壓，抑制了酵母菌的代謝活動，酒精度與黃酮含量降低，發(fā)酵酒中糖含量增加，導致酒香味不突出，降低了發(fā)酵酒的感官品質，與JOSHI等[16]報道的結果相類似。因此選擇初始糖度20%～24%進行后續(xù)試驗。

圖2 初始糖度對果肉渣發(fā)酵酒的影響Fig.2 Effect of initial sugar content on sweet orangefermented wine

2.1.5 溫度對果肉渣發(fā)酵酒的影響

一般果酒酵母發(fā)酵較適溫度范圍為25～30 ℃，溫度越高，酵母起酵越快，發(fā)酵周期越短[17]。由圖3可以看出，當溫度低于28 ℃時，釀酒酵母生長緩慢，殘?zhí)橇枯^高而導致酒精度較低，延長了發(fā)酵時間。當溫度高于28 ℃時，酵母菌繁殖迅速，衰老快，并且高溫下發(fā)酵酒中風味物質易揮發(fā)，生成的酒精度較低，酒體不濃郁，從而降低了發(fā)酵酒的口感與香氣。當發(fā)酵溫度為28 ℃時，果肉渣發(fā)酵酒的酒精度、感官評分、黃酮含量較高，殘?zhí)橇孔畹停l(fā)酵徹底并且酒體豐滿醇厚，而總酚含量變化差異不顯著(P>0.05)。因此選擇26～30 ℃進行優(yōu)化試驗。

圖3 溫度對果肉渣發(fā)酵酒的影響Fig.3 Effect of temperature on sweet orange fermented wine

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面試驗結果與方差分析

在分析上述各單因素試驗結果的基礎上，選擇接種量、初始糖度、發(fā)酵溫度3個因素為果肉渣發(fā)酵酒工藝的響應變量，旨在保留果酒中的活性成分，同時果酒色香味俱全，因此以感官評分、黃酮和總酚含量為響應指標，對果肉渣發(fā)酵酒進行響應面優(yōu)化和分析。試驗方案和結果如表5所示。

表5 響應面試驗方案及結果Table 5 Experimental scheme and results for responsesurface analysis

表6 模型方差分析表Table 6 Analysis of variance of each model

注：“*”表示差異顯著(P<0.05);“**”表示差異極顯著(P<0.01)。

2.2.2 響應面分析

在Y1模型中AB、AC交互作用不顯著，因此只對BC交互作用進行分析，由圖4A可知，當接種量一定時，發(fā)酵溫度與初始糖度的曲面較為陡峭，交互作用顯著。在Y2模型中BC、AB交互作用不顯著，因此只對AC交互作用進行分析。由圖4B可知，當初始糖度一定時，隨著發(fā)酵溫度與接種量的變化，黃酮含量的曲面曲率發(fā)生顯著性改變，二者對黃酮含量影響較大。在Y3模型中，AB、AC交互作用不顯著，故只對BC交互作用進行分析，由圖4C可知，當接種量一定時，發(fā)酵溫度和初始糖度逐漸增大時，總酚呈先升高后降低趨勢，說明交互作用相當。

圖4 各因素對各指標影響的響應面Fig.4 Response surface of temperature and initial sugar content on sensory score(A), temperature and inoculationamount on flavonoids (B), temperature and initial sugar on total phenolic content(C)

2.3 驗證試驗

感官評分與營養(yǎng)價值是影響消費者購買食品的關鍵因素，所以本試驗中主要目的為釀造的甜橙果肉渣發(fā)酵酒色澤口感良好，酒體濃郁協(xié)調，同時在發(fā)酵過程中盡可能地保留了原料中的類黃酮等營養(yǎng)物質，實現(xiàn)變廢為寶的效果。選擇感官評分的重要性為4，黃酮與總酚含量的重要性分別為3，選擇感官評分為目標范圍69.5～85分中的最大響應值，黃酮含量為目標范圍110.75～125 mg/L中的最大響應值，總酚含量為目標范圍348.15～386.70 mg/L中的最大響應值。通過Design-Expert 8.0.6軟件進行數(shù)據(jù)分析，得到果肉渣發(fā)酵酒的工藝條件為接種量0.19%、初始糖度23.79%、溫度29.71 ℃，在此條件下模型預測果肉渣發(fā)酵酒的感官評分為80.45分、黃酮與總酚含量分別為119.26、386.47 mg/L，考慮實際情況，確定最佳發(fā)酵工藝條件為接種量0.19%、初始糖度23.5%、溫度30 ℃，在此條件下，平行試驗3次取平均值，所得果肉渣發(fā)酵酒感官評分為80.12分、黃酮與總酚含量分別為119.10、383.54 mg/L，試驗得到的實際值與預測值接近，因此通過響應面優(yōu)化果肉渣酒發(fā)酵條件是可行的。

2.4 品質的分析比較

2.4.1 感官評價

在最優(yōu)工藝條件下，分別對果汁及果肉渣發(fā)酵酒進行感官評價，結果如圖5所示，果汁發(fā)酵酒澄清透亮，色澤良好，其色澤、澄清度方面高于果肉渣發(fā)酵酒。果肉渣發(fā)酵酒香氣濃郁，柑橘香味與酒香味協(xié)調，口感純正，回味持久，具有柑橘果酒的典型風格，其香氣、口感、風格分值均高于果汁發(fā)酵酒，與陳紅梅等[18]試驗結果相似。

圖5 果酒感官評價結果Fig.5 Sensory evaluation results of fermented wine

2.4.2 酚類物質含量分析

在最優(yōu)工藝條件下，分別測定各樣品中酚酸及類黃酮物質含量，如表7所示，對應色譜圖如圖6所示。由表7可知，6種酚酸中，果汁發(fā)酵酒中沒食子酸、綠原酸、咖啡酸含量均高于果肉渣發(fā)酵酒。對羥基苯甲酸在2種果酒中含量相當，無顯著差異；相比于果汁發(fā)酵酒，果肉渣發(fā)酵酒中對香豆酸與阿魏酸的質量濃度均高出2倍以上；在類黃酮物質含量方面，果肉渣發(fā)酵酒中除香蜂草苷(3.92±0.06 mg/L)低于果汁發(fā)酵酒(4.17±0.04 mg/L)外，其余類黃酮物質含量普遍高于果汁發(fā)酵酒。原因是采取帶渣發(fā)酵時果膠酶能促進果渣細胞壁降解，有助于酚酸及黃酮類物質從木質素中釋放出來，從而增加了果酒中酚酸和類黃酮物質的含量[19]。在發(fā)酵前后來看，果汁和果肉渣液經(jīng)過酒精發(fā)酵酚類物質含量有所降低，與KELEBEK等[20]研究結果相似。果汁發(fā)酵前后除綠原酸含量升高外，其他物質含量均為降低，而果肉渣液整體物質含量下降不明顯，含量分別為(171.36±0.28)、(163.91±0.2) mg/L。

表7 果酒中單體酚類物質含量Table 7 Content of monomer phenols in fermented wine

A-酚酸標準品及樣品HPLC圖；B-類黃酮標準品及樣品HPLC圖;1-沒食子酸；2-綠原酸；3-對羥基苯甲酸；4-咖啡酸；5-對香豆酸；6-阿魏酸；7-蕓香柚皮苷；8-蘆?。?-橙皮苷；10-香蜂草苷；11-橘皮素圖6 11種酚類物質標準品及樣品HPLC圖Fig.6 HPLC diagram of 11 phenolic substance standardsand fruit wine

3 結論

果肉渣發(fā)酵酒的最佳工藝條件為接種量0.19%、初始糖度23.5%、發(fā)酵溫度30 ℃，在此條件下，所得果肉渣發(fā)酵酒感官評分為80.12分、黃酮與總酚含量分別為119.10、383.54 mg/L。果汁發(fā)酵酒與果肉渣發(fā)酵酒的品質分析表明，果肉渣發(fā)酵酒具有良好的柑橘香味，酒香醇厚，其中的酚酸和類黃酮物質高于果汁發(fā)酵酒，含有豐富的營養(yǎng)物質。試驗表明果肉渣發(fā)酵能獲得較高品質的甜橙果酒。

本研究利用甜橙榨汁后的果肉渣，經(jīng)過酵母酒精發(fā)酵，充分消耗原料中的糖類，生產(chǎn)出具有更多功能性成分的果酒，為提高柑橘果酒品質和充分利用柑橘加工副產(chǎn)物提供了新途徑，增加了柑橘加工產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益。