胡洋洋，張逸寅，王 華，顧康生

( 安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，安徽 合肥 230022)

中性粒細胞促進腫瘤細胞周期進展和轉(zhuǎn)移潛能[1]。中性粒細胞還可以形成一種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，中性粒細胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracelluar traps，NETs)通過多種途徑參與腫瘤生物學行為。作為一種防御機制，不同于中性粒細胞趨化、吞噬的殺菌方式。NETs是細胞外中性粒細胞來源的DNA網(wǎng)，在炎癥信號的作用下釋放、誘捕和殺死入侵的病原體，NETs能直接殺死細菌和真菌病原體的程度仍然是有爭議的[2]，因為并非所有被困在NETs中的細菌病原體都被殺死了，也沒有已知的特定抑制劑可以將NETs的抗菌活性釋放出來。自NETs被發(fā)現(xiàn)以來，其在多種疾病發(fā)展中清除病原體時，直接或間接損傷機體的細胞和組織，已為不爭的事實[3]。NETs與多種自身免疫性疾病關(guān)系密切，也可在癌癥和自身免疫性等無菌炎癥條件下形成，并能促進血栓形成。探索NETs與惡性腫瘤的研究領(lǐng)域，明確NETs與惡性腫瘤的關(guān)系，勢必為腫瘤的預防及治療提供新的思路。

1 NETs簡介

1.1 NETs的結(jié)構(gòu)和形式NETs由組蛋白、染色質(zhì)DNA、顆粒源性及胞質(zhì)蛋白等構(gòu)成，發(fā)現(xiàn)這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)參與的病理生理過程可以消除病原體，因此將其命名為NETs。在高分辨率掃描電鏡下，NETs是一個特殊的超微結(jié)構(gòu)，是由直徑約為15～17 nm的平滑纖維組成。

NETs可分為兩種不同的形式，錨定的網(wǎng)和無細胞網(wǎng)，無細胞網(wǎng)被認為是分裂的或像棉花一樣的結(jié)構(gòu)，而錨定的網(wǎng)則被描述為線性的、網(wǎng)狀的、膜狀的或類似于斑點的結(jié)構(gòu)。

1.2 NETosis的代謝過程NETs是腫瘤生長或其他炎癥條件作用下的結(jié)果，NETosis被特定的刺激物作用而產(chǎn)生，其機理可能更多的是細胞因子環(huán)境的副作用，而不是對宿主有益。大量研究集中在是什么刺激物導致了NETs的形成，以便在消極影響大于積極影響的情況下將其作為治療靶點。研究表明，病原微生物、干擾素、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、佛波酯(phorbol myristate acetate,PMA)、活化的血小板、促炎分子HMGB1、缺氧、全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)等均可刺激中性粒細胞產(chǎn)生NETs。

中性粒細胞活化后形成NETosis是一種全新的細胞免疫應答方式。NETs是通過兩種途徑形成：一是細胞死亡途徑，稱為NETosis，它始于核分裂和核包膜的解體，并繼續(xù)失去細胞極化，染色質(zhì)反分裂和血漿膜破裂。二是非NETosis式，它可以獨立于細胞死亡而發(fā)生。并涉及到核染色質(zhì)的分泌，伴隨著顆粒蛋白通過脫粒的釋放。這些成分在細胞外聚集并留下活躍的無核細胞持續(xù)攝取微生物。

2 NETs與惡性腫瘤的關(guān)系

2.1 NETs與惡性腫瘤關(guān)系的概述中性粒細胞通過多種機制影響惡性腫瘤生物學行為，并且有證據(jù)證明NETs的存在[4]。NETs 在多種惡性腫瘤組織中高表達，且腫瘤具有調(diào)節(jié)NETs的系統(tǒng)效應。已發(fā)現(xiàn)胃、腸、肝、胰腺腫瘤發(fā)生與NETs形成有關(guān)。與腫瘤相關(guān)的有兩種中性粒細胞表型，抗腫瘤N1和致瘤性N2中性粒細胞，N1和N2中性粒細胞都能產(chǎn)生NETs。然而，它們的功能可能有所不同，其在血管生成和組織生長與組織損傷方面的作用仍然是謎。盡管假定中性粒細胞會對N1或N2型顯型進行極化，但具體條件尚不清楚。此外，這些中性粒細胞可以激活CD8+T細胞和樹突狀細胞，甚至可以激活腫瘤抗原。瓜氨酸化組蛋白H3(citrullinated histone H3；H3Cit)是NETs的中心分子[5]。對腫瘤患者中性粒細胞表型的分析顯示，H3Cit陽性的中性粒細胞比例較高。惡性腫瘤中，高表達的循環(huán)H3Cit提示較差的預后，短期死亡風險較低表達患者增加了2倍。H3Cit可以作為一種晚期癌癥患者相關(guān)炎癥標志物[5]。腫瘤細胞中的PAD4介導的瓜氨酸化誘導染色質(zhì)去致密化，對中性粒細胞在生理條件下形成NETs有重要作用[6]。

2013年，Cools-Lartigue等[7]報道了在靜態(tài)和動態(tài)條件下循環(huán)腫瘤細胞在體外被NETs捕獲。這些效應被脫氧核糖核酸酶Ⅰ(deoxyribonueleaseⅠ，DNaseⅠ)或中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑的NETs抑制所消除。這些發(fā)現(xiàn)表明，在全身感染的背景下，NETs參與了癌癥轉(zhuǎn)移過程，NETs可能作為潛在的治療靶點。

2.2 NETs與腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)NETs與惡性腫瘤的關(guān)系與復雜的腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)。粒細胞集落刺激因子刺激腫瘤細胞轉(zhuǎn)移在許多臨床模型中已被證實，這反過來又增加了系統(tǒng)的NETosis。已證明，NETs能夠捕獲循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)，并對遠處的器官產(chǎn)生二次附著力。腫瘤細胞與NETs的關(guān)系與β1-整合素密切相關(guān)[8]。β1-整合素表達在腫瘤微環(huán)境炎癥的背景下產(chǎn)生是增加的。給小鼠注射DNAse 1時，這種效應則消失。對NETs的整合抑制可以降低體內(nèi)的肝癌細胞粘附性。需要指出的是，通過抗體或siRNA抑制β1整合素并不能完全抑制癌細胞對NETs的粘附。因為NETs實際上是由數(shù)百種蛋白質(zhì)修飾的，其中許多蛋白質(zhì)可能也會導致癌細胞粘附和腫瘤發(fā)生，而β1整合蛋白可能只是被認可的參與者之一。對中性粒細胞彈性蛋白酶的藥理學抑制作用降低了癌細胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移潛能，這是對中性粒細胞彈性蛋白酶敲除動物實驗結(jié)果的總結(jié)[7]。然而，轉(zhuǎn)移的明顯減少，可能是由于NETs形成減少。事實上，有研究表明，NETs與轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)生有關(guān)。NETs和中性粒細胞彈力酶的作用難以區(qū)分。此外，通過其他方式靶向NETs，如DNaseⅠ或肽?；彼崦撛野泵?抑制劑，同樣可以減少肺和肝的轉(zhuǎn)移，尤其是在炎癥應激增強的情況下。總之，這些研究結(jié)果證實，在復雜的腫瘤微環(huán)境中，惡性腫瘤與NETs的關(guān)系可能存在復雜交錯的相互作用。

2.3 NETs在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用NETs參與腫瘤誘導的全身效應。原發(fā)性腫瘤細胞可表達G-CSF等因子，誘導全身性血管內(nèi)NETs形成；網(wǎng)作為血小板粘附、活化和聚集的支架，可促進血栓形成[9]；NETs通過隔離循環(huán)腫瘤細胞[7]，增強腫瘤細胞對內(nèi)皮的粘附， 也可能通過增加腫瘤細胞的滲出，促進轉(zhuǎn)移；腫瘤誘導的網(wǎng)狀血管閉塞導致遠端器官灌注不足和炎癥，損害遠處器官的血管功能，可能是器官衰竭的原因之一。

NETs會以多種方式促進原發(fā)腫瘤的生長。粘附分子與中性粒細胞介導的炎癥反應之間有密切關(guān)系。中性粒細胞形成的因子可以支持腫瘤在轉(zhuǎn)移級聯(lián)的每一步發(fā)展，包括早期粘連、增殖、侵襲和血管生成。其中許多因素已在內(nèi)部得到證實。像NE這樣的介質(zhì)釋放可以促進腫瘤的生長和進展以及腫瘤細胞的遷移。血管生成可以通過白細胞介素-8直接刺激，也可以通過MMP9觸發(fā)的細胞外基質(zhì)釋放血管內(nèi)皮生長因子。此外，NETs本身可以導致額外的中性粒細胞的增加，從而引發(fā)炎癥反應。NETs可能代表了各種嗜中性粒細胞衍生因子在腫瘤生物學上發(fā)揮作用[10]，通過這種方式支持腫瘤細胞增殖。NETs可能為困在豐富蛋白質(zhì)中的腫瘤細胞創(chuàng)造一個有利的腫瘤微環(huán)境。

Kanamaru等[11]研究發(fā)現(xiàn)，腹腔手術(shù)后，NETs捕獲播散性的腫瘤細胞，在肝臟中大量形成微轉(zhuǎn)移酶，為腫瘤細胞存活提供有利的微環(huán)境。術(shù)后腹膜后灌洗液中含有許多低密度中性粒細胞(LDN)，且具有成熟的顯型，為NETs的形成提供了充足的原材料。反過來腫瘤細胞有選擇性地附著在NETs上并在LDN單層細胞上增殖，NETs可以調(diào)節(jié)腫瘤細胞的附著力并促進腹膜轉(zhuǎn)移。

Tohme等[12]在體外機制研究表明，小鼠中性粒細胞來源的NETs可觸發(fā)高遷移率族蛋白B1的釋放，激活癌細胞tlr9依賴的通路，促進其黏附、增殖、遷移和侵襲。DNAseI和PAD4可以抑制由手術(shù)應激引起的NETs炎癥性風暴以減少轉(zhuǎn)移，提示清除NETs可降低腫瘤復發(fā)的風險。

2013年，Berger-Achituv[13]首次表明尤文氏肉瘤患者TANs可以被激活誘導NETs。課題組這次在對尤文氏肉瘤進行的一項小型研究中，25%的轉(zhuǎn)移病例檢測到NETs,這些患者并較早出現(xiàn)了轉(zhuǎn)移，表明NETs可能促進腫瘤的進展，這是國際上第一次報道的NETs相關(guān)臨床研究。人體肺癌組織和骨肉瘤組織中均存在中性粒細胞壞死和NETs 結(jié)構(gòu)，并且與治療療效及預后密切相關(guān)。肺腫瘤中的NETs增加血管的通透性，幫助腫瘤細胞從脈管系統(tǒng)中滲出，促進腫瘤的播散。

Park等發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞可以誘導中性粒細胞在沒有感染的情況下形成NETs。利用活體成像技術(shù)，Park等還觀察到了轉(zhuǎn)移到小鼠肺部的4T1癌細胞周圍的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并可用DNase I阻斷。Richardson等[14]實驗結(jié)果顯示，與健康對照組相比，結(jié)直腸癌患者的NETs產(chǎn)量顯著增加，研究還表明，不良的患者預后，即術(shù)后并發(fā)癥和死亡率，都與術(shù)前NETs產(chǎn)生增加有關(guān)。彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)患者晚期的NETs水平升高，并與生存率降低相關(guān)[15]。在本模型中，阻斷NETs、阻斷IL-8-CXCR2軸或抑制TLR9可以延緩腫瘤進展。Abdol等[16]研究證實胰腺癌細胞可以獨立于ROS的產(chǎn)生，刺激NETs的快速釋放，胰腺癌誘導的NETs是導致患者靜脈血栓形成的高風險因素。并通過 DNase I降低細胞外DNA和CXCL8表達的水平，抑制了胰腺癌的轉(zhuǎn)移，這項研究又是支持NETs的破壞可以減少癌癥的轉(zhuǎn)移一例子。

2018年，Albrengues等[17]證實持續(xù)的肺部炎癥后，NETs可以促進休眠癌細胞的覺醒。 NETs通過將中性粒細胞蛋白酶集中于細胞外基質(zhì)蛋白，從而喚醒腫瘤細胞，允許層粘連蛋白的順序水解重構(gòu)，并導致整合素介導的癌細胞信號傳導。

2.4 NETs抑制相關(guān)研究2016年，Arelaki等[18]的實驗數(shù)據(jù)顯示NETs通過誘導癌細胞凋亡來抑制結(jié)腸癌細胞的體外生長。發(fā)現(xiàn)中性粒細胞和網(wǎng)狀物隨著距離腫瘤的距離成比例地減少，是腫瘤微環(huán)境中TF的重要來源。

Millrud等[19]體外實驗顯示，頭頸部鱗癌中CD16hCD62Ld中性粒細胞亞型高比例的存在，通過NETs誘導細胞凋亡、抑制增殖從而阻礙癌細胞生長。此外，CD16hCD62Ld中性粒細胞亞型比例的增加與存活率的增加有關(guān)。

3 NETs與腫瘤性相關(guān)血栓形成

無論接受化療與否，都有很高比例的癌癥患者會出現(xiàn)致命的血栓并發(fā)癥。自2010年首次觀察到NETs在DVT中的存在以來，明確網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)是深靜脈血栓的一部分[20]。在乳腺癌、非小細胞肺癌中，中性粒細胞更容易形成 NETs 結(jié)構(gòu)，從而導致腫瘤相關(guān)的血栓形成?？谇击[狀細胞癌(OSCC)患者中性粒細胞NETs的釋放增強口腔鱗狀細胞癌患者的促凝活性，從而使其處于高凝狀態(tài)[21]。

NETs產(chǎn)生的凝血活性可以促進癌癥的生長。從荷瘤小鼠中分離出的中性粒細胞易形成NETosis。腫瘤分泌細胞因子，如粒細胞集落刺激因子，系統(tǒng)地啟動中性粒細胞。NETs升高為癌癥相關(guān)血栓形成提供了一種新的解釋，如血漿H3Cit等NETs生物標志物水平較高的小鼠顯示自發(fā)性血栓形成[20]。

高凝是促進腫瘤惡化和增加血栓風險的常見加重因素。GC中性粒細胞釋放的NETs增加了控制血漿產(chǎn)生凝血素和纖維蛋白的能力。這些促凝劑效果由于DNaseI的應用效果降低。進一步發(fā)現(xiàn)，在GC患者中自發(fā)形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)明顯高于健康對照組，促進了腫瘤-淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，與血栓-抗凝血酶復合水平和D-二聚體呈正相關(guān)。另外，DNase I對纖維蛋白的無細胞血漿生成的影響取決于NETs形成的濃度。

腸道腫瘤會破壞腸道屏障，使LPS滲入血液循環(huán)。通過激活替代補充途徑，LPS將中性粒細胞轉(zhuǎn)變?yōu)镹ETosis，從而促進凝血，這些發(fā)現(xiàn)提供了一種機械聯(lián)系在癌癥與血栓風險之間。在胃腸道系統(tǒng)中，已發(fā)現(xiàn)胃、腸、肝、胰腺腫瘤發(fā)生與NETs血栓形成有關(guān)。

4 NETs作為腫瘤藥理學靶點的研究

NETs抑制惡性腫瘤的報道相對較少。而NETs 與腫瘤細胞錨定粘附、增殖、遠處轉(zhuǎn)移腫瘤，相關(guān)性血栓形成的研究以及作為治療靶點的研究則是聚焦的熱點。其中比較明確的有，降解或抑制 NETs 的藥物，如 DNase 或 NE、 PAD4 抑制劑，在腫瘤相關(guān)性疾病中具有潛在的治療作用。這將成為抗腫瘤的一個新的靶點，此領(lǐng)域研究進展已有相關(guān)報道。此外降低NETs的表達對腫瘤外的疾病也大量相關(guān)報道。肽鏈精氨酸脫亞胺酶4(PADI 4)是NETs過程中最關(guān)鍵的一步。因此，研究人員敲除了胰腺癌小鼠體內(nèi)的Padi4基因，敲除后的胰腺癌小鼠較沒有敲除基因的對照組小鼠中位生存期明顯提高[22]；體外研究證實，NETs促進血栓形成的靜脈剪切應力[12]；在人類和小鼠中，NETs聚集物在胰腺導管內(nèi)形成，阻塞胰腺導管，從而引起胰腺炎癥。故阻止聚集性NETs形成聚集，可限制其自身誘導的炎癥反應[23]；曾在一項隨機對照的試驗中用于自身免疫性系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者。rhDNAse給藥耐受性良好，無明顯不良反應。DNAse在干預圍手術(shù)期的應用可以降低轉(zhuǎn)移性腫瘤切除術(shù)患者的復發(fā)風險。此研究表明利用DNA酶抑制NETs具有臨床應用前景[24]；下調(diào)NETs的表達可能有效延緩動脈粥樣硬化斑塊進展[25]；如在HCC患者中，隨著MELD評分的升高，NETs標志物水平逐漸升高，提示NETs含量與肝臟疾病嚴重程度呈正相關(guān)。抑制NETs的藥物治療手段有望用于管理HCC患者PVT；如體外研究發(fā)現(xiàn)，充足DNAse可加速急性冠狀動脈綜合征時組織型纖溶酶原激活劑(tPA)誘導的溶栓，而DNAse本身則無此作用。

5 結(jié)語與展望

總的來說，這些發(fā)現(xiàn)強烈建議將NETs作為一種潛在的藥物治療靶點。阻止該網(wǎng)絡的形成，可有效減少癌細胞的轉(zhuǎn)移。潛在的抑制劑將成為NETs在免疫學、腫瘤、心血管、炎癥等領(lǐng)域治療過程中重要的發(fā)展方向。預防或清除NETosis的策略已經(jīng)確定，今后的相關(guān)臨床發(fā)展值得關(guān)注。