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      磷脂酶D的純化及催化制備磷脂酰絲氨酸研究

      2020-01-14 05:16:32禹,張濤,江
      中國油脂 2020年1期
      關(guān)鍵詞:磷脂酶絲氨酸水相

      夏 禹,張 濤,江 波

      (江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無錫 214122)

      磷脂酰絲氨酸作為一種新資源食品,具有改善阿爾茨海默病、治療抑郁癥和緩解精神壓力等作用[1-9],市場前景十分廣闊。隨著人們生活節(jié)奏的加快,生活壓力加大,再加上我國逐漸步入老齡化社會,未來人們對磷脂酰絲氨酸的需求也會越來越大,實(shí)現(xiàn)其大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)也變得更加重要。

      目前市售的磷脂酰絲氨酸產(chǎn)品大多是從豆類或動物肝臟組織中提取的,成本較高,安全性也存在問題[10-11]。利用磷脂酶D酶法制備磷脂酰絲氨酸具有條件溫和、產(chǎn)品得率高和生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)[12],具有重要的研究和生產(chǎn)價(jià)值。酶法合成磷脂酰絲氨酸主要取決于起催化作用的磷脂酶D,但目前市售的磷脂酶D主要是從植物中提取,種類少、轉(zhuǎn)酯活力低、價(jià)格高,限制了磷脂酶D的應(yīng)用。

      本文通過對廣島鏈霉菌所產(chǎn)磷脂酶D進(jìn)行純化,并將其用于制備磷脂酰絲氨酸,以期為磷脂酶D和磷酯酰絲氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。

      1 材料與方法

      1.1 實(shí)驗(yàn)材料

      1.1.1 菌株與試劑

      廣島鏈霉菌SK43.001-11,由本實(shí)驗(yàn)室誘變篩選獲得;L-絲氨酸、蛋黃卵磷脂、乙醚、乙酸乙酯、石油醚、三氯甲烷、二氯甲烷、環(huán)己烷等,購自國藥化學(xué)試劑有限公司;磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰絲氨酸(PS)標(biāo)準(zhǔn)品,購自西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司;甲醇、異丙醇、正己烷、三乙胺均為色譜純。

      1.1.2 儀器與設(shè)備

      HYL-B型恒溫?fù)u床,AKTA avant 25、AKTA purifier 10蛋白純化系統(tǒng),Waters1525型高效液相色譜儀,ELSD3300蒸發(fā)光散射檢測器。

      1.1.3 培養(yǎng)基

      斜面培養(yǎng)基:葡萄糖15 g/L,麥芽糖10 g/L,酵母提取物2 g/L,瓊脂20 g/L,pH 7.0~7.4,115℃滅菌30 min。

      種子培養(yǎng)基:葡萄糖10 g/L,酵母提取物20 g/L,蛋白胨5 g/L,K2HPO4·3H2O 2 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,pH 7.0~7.4,115℃滅菌30 min。

      發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖10 g/L,牛肉浸膏5 g/L,蛋白胨5 g/L,K2HPO4·3H2O 2 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,pH 7.0~7.4,115℃滅菌30 min。

      1.2 實(shí)驗(yàn)方法

      1.2.1 粗酶液制備

      (1)斜面制備:將廣島鏈霉菌SK43.001-11接種于試管斜面,28℃培養(yǎng)7 d。

      (2)種子液制備:從斜面上用接種環(huán)挑取1環(huán)單菌落接入種子培養(yǎng)基中,裝液量50 mL/250 mL,在28℃、200 r/min的搖床中培養(yǎng)1.5 d。

      (3)發(fā)酵培養(yǎng):按4%的接種量將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,裝液量50 mL/250 mL,在28℃、200 r/min的搖床中發(fā)酵培養(yǎng)7 d。

      (4)粗酶液制備:將發(fā)酵液于4℃、6 000 r/min離心20 min,棄去沉淀,取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾,濾液即為粗酶液。

      1.2.2 粗酶液的純化

      向粗酶液中加入硫酸銨至體系飽和度為40%,4℃靜置2 h后,離心除去沉淀,再向上清中加入硫酸銨至體系飽和度達(dá)到60%,4℃靜置2 h后,離心收集沉淀,復(fù)溶于檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(50 mmol/L,pH 5.0)中,4℃透析脫鹽。將透析液上樣于Hitrap SP HP陽離子交換柱,用含1 mol/L NaCl的同種緩沖液進(jìn)行梯度洗脫,測定各洗脫峰的酶活,收集有磷脂酶D活力的洗脫峰,用超濾離心管濃縮。再將濃縮液上樣于Superdex 200 10/300 GL凝膠層析柱,用含0.5 mol/L NaCl的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(50 mmol/L,pH 5.0)洗脫,測定各洗脫峰的酶活,收集有磷脂酶D活力的洗脫峰。

      1.2.3 酶活測定

      取0.5 g蛋黃卵磷脂溶于1 mL乙醚中,加入10 mL去離子水振蕩形成乳液。依次向離心管中加入100 μL乳液、100 μL檸檬酸緩沖液(0.1 mol/L,pH 6.0)、150 μL 7.5%曲拉通X-100、50 μL 0.1 mol/L CaCl2和100 μL酶液,充分混勻后,37℃水浴10 min。加入200 μL含有50 mol/L EDTA的Tris-HCl緩沖液(0.1 mol/L,pH 8.0),沸水浴5 min終止反應(yīng)[13-14]。室溫冷卻后,加入2 mL由Tris-HCl緩沖液(0.1 mol/L,pH 8.0)配制的顯色劑(含2 mg/mL 4-氨基安替比林、0.5 mg/mL苯酚和10 mg/mL曲拉通X-100),再加入20 μL 100 U/mL膽堿氧化酶和10 μL 200 U/mL過氧化酶,混勻后置于37℃水浴中反應(yīng)20 min,于500 nm處測定吸光度??瞻捉M采用去離子水代替酶液,同樣操作下測定。酶活定義:將37℃、1 min內(nèi)生成1 μmol膽堿所需要的酶量定義為1個(gè)酶活力單位(U)。

      1.2.4 蛋白含量的測定

      按Lorry法對酶液的蛋白含量進(jìn)行檢測。

      1.2.5 PS的初始制備反應(yīng)體系

      20 mg磷脂酰膽堿溶于10 mL乙醚中,0.35 gL-絲氨酸溶于4 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液中(20 mmol/L,pH 5.5),加入1 mL酶液(4 U),混合后置于具塞錐形瓶中,28℃恒溫振蕩反應(yīng)2 h后停止反應(yīng)。

      1.2.6 磷脂酰膽堿和PS的檢測

      取0.5 mL 1.2.5反應(yīng)結(jié)束后有機(jī)相,通風(fēng)櫥室溫?fù)]發(fā),用同等體積甲醇-三氯甲烷(體積比2∶1)復(fù)溶后,經(jīng)0.22 μm有機(jī)系濾膜過濾,用高效液相-蒸發(fā)光散射檢測器檢測磷脂酰膽堿和PS的含量。

      色譜分析條件:Sepax HP-Silica色譜柱(5 μm,250 mm×4.6 mm),流動相A為甲醇-水-醋酸-三乙胺(體積比85∶15∶0.5∶0.05),流動相B為異丙醇-流動相A-正己烷(體積比20∶32∶48)。色譜柱溫40℃,流速1.0 mL/min,檢測器漂移管溫度70℃,氣體流速1.5 mL/min,進(jìn)樣量10 μL,洗脫程序如表1所示。

      表1 HPLC-ELSD梯度洗脫程序

      1.2.7 PS生成率的計(jì)算

      PS生成率=PS產(chǎn)量/磷脂酰膽堿初始添加量×100%

      2 結(jié)果與討論

      2.1 磷脂酶D的純化

      磷脂酶D的分步純化結(jié)果如表2所示。

      由表2可知:粗酶液經(jīng)硫酸銨分級沉淀初步純化后,比酶活提高到2.58 U/mg,被純化了2.84倍;Hitrap SP HP陽離子交換層析除去了溶液中的大量雜蛋白,比酶活達(dá)到40.67 U/mg,將磷脂酶D純化了44.69倍;最后經(jīng)Superdex 200 10/300 GL凝膠層析純化后,得到了純化倍數(shù)為54.37、回收率為32.31%、比酶活為49.48 U/mg的電泳純的磷脂酶D。

      表2 廣島鏈霉菌產(chǎn)磷脂酶D的純化結(jié)果

      2.2 PS的酶法合成工藝

      2.2.1 有機(jī)溶劑的影響

      由于磷脂酶D是親水性的,而其作用的磷脂底物卻是親油性的,因此這類反應(yīng)大多在由水相和有機(jī)相組成的雙液相體系中進(jìn)行。在這樣的反應(yīng)體系中,有機(jī)溶劑不可避免會對磷脂酶D的催化反應(yīng)有所影響。有機(jī)溶劑對酶的催化反應(yīng)的影響體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:①由于極性的差異,有機(jī)溶劑會影響兩相中底物和產(chǎn)物的分配和擴(kuò)散,使反應(yīng)的平衡常數(shù)和速率常數(shù)發(fā)生變化;②有機(jī)溶劑直接與酶必需的水化層發(fā)生作用,間接影響酶的活力;③有機(jī)溶劑直接作用于酶分子,改變維持蛋白質(zhì)構(gòu)型的氫鍵和疏水作用等,導(dǎo)致酶活性的降低甚至失活[15]。

      為了找出有利于轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的有機(jī)相,僅改變有機(jī)溶劑的種類,其他條件見1.2.5,考察有機(jī)溶劑對PS生成率的影響,結(jié)果如圖1所示,各有機(jī)溶劑的極性如表3所示。

      圖1 不同有機(jī)溶劑對PS生成率的影響

      表3 不同有機(jī)溶劑的極性

      由圖1可看出,有機(jī)相為石油醚時(shí),基本無PS生成,正己烷和環(huán)己烷為有機(jī)相時(shí),PS生成率在6%左右,二氯甲烷、三氯甲烷和乙酸乙酯為有機(jī)相時(shí),PS生成率在30%左右,乙醚為有機(jī)相時(shí),PS生成率最高,達(dá)57.2%。結(jié)合表3可以看出,PS的生成率隨著有機(jī)相溶劑的極性增大呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢,因此選擇乙醚作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的有機(jī)相,這與張憶雪[16]的選擇一致。

      2.2.2 pH的影響

      酶的催化反應(yīng)需要一定的pH條件,否則導(dǎo)致反應(yīng)不發(fā)生或有副反應(yīng)發(fā)生,不利于目的反應(yīng)進(jìn)行。每種酶都有其最適pH,偏離最適pH時(shí),酶分子的極性基團(tuán)發(fā)生不同程度的解離,酶活性降低。當(dāng)pH偏離較大時(shí),酶的三級結(jié)構(gòu)也會發(fā)生變化,引起酶的變性。為探究pH對PS生成率的影響,調(diào)節(jié)緩沖液pH分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0,其他條件見1.2.5,結(jié)果如圖2所示。

      圖2 pH對PS生成率的影響

      從圖2可以看出,隨著pH的增大,PS生成率先升高后降低,反應(yīng)適宜在偏酸性條件下進(jìn)行。pH低于5.5時(shí),PS生成率隨pH變化明顯,pH高于7.5時(shí),PS生成率隨pH升高而出現(xiàn)下降趨勢,在pH 5.5~7.5范圍內(nèi),pH對PS生成率的影響不大,PS生成率在55%左右,pH 6.5時(shí)PS生成率最高,達(dá)58.1%。因此,選擇pH 6.5進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)優(yōu)化。

      2.2.3 反應(yīng)溫度的影響

      反應(yīng)溫度對酶催化反應(yīng)的影響比較復(fù)雜,反應(yīng)溫度既可以影響酶的催化反應(yīng)速率,也對酶蛋白的穩(wěn)定性有所影響。隨著反應(yīng)溫度的升高,反應(yīng)物的能量被提高,底物與酶的碰撞加劇,反應(yīng)速度加快。當(dāng)反應(yīng)溫度高于酶催化反應(yīng)最適溫度后,部分酶蛋白會發(fā)生變性,降低了酶催化反應(yīng)效率。不僅如此,隨著反應(yīng)溫度的升高,酶的活性中心結(jié)構(gòu)會發(fā)生一定變化,影響底物和酶的結(jié)合,從而影響酶催化反應(yīng)速度及選擇性。

      由于選用乙醚作為有機(jī)相,考慮到乙醚的沸點(diǎn)(35℃)較低,實(shí)驗(yàn)選擇了5個(gè)不同的反應(yīng)溫度進(jìn)行PS生成率考察。調(diào)節(jié)緩沖液pH為6.5,其他條件見1.2.5,結(jié)果如圖3所示。

      圖3 反應(yīng)溫度對PS生成率的影響

      從圖3可以看出,隨著反應(yīng)溫度的升高,PS生成率增大,當(dāng)反應(yīng)溫度為30℃時(shí),PS生成率最高,當(dāng)反應(yīng)溫度繼續(xù)升高后,PS生成率則出現(xiàn)下降趨勢。由此可以判定,30℃為此體系催化合成PS的最適反應(yīng)溫度。

      2.2.4 底物質(zhì)量比的影響

      有機(jī)相選用乙醚,緩沖液pH為6.5,反應(yīng)溫度為30℃,固定有機(jī)相中磷脂酰膽堿的濃度,改變水相中L-絲氨酸用量,其他條件見1.2.5,底物質(zhì)量比對PS生成率的影響如圖4所示。

      圖4 底物質(zhì)量比對PS生成率的影響

      從圖4可以看出,當(dāng)L-絲氨酸與磷脂酰膽堿質(zhì)量比較低時(shí),PS生成率較低,隨著質(zhì)量比的增大,PS生成率增大,這是由于L-絲氨酸作為反應(yīng)的底物之一,其用量增大,可促進(jìn)PS的生成。繼續(xù)提高底物質(zhì)量比,PS生成率變化不大。考慮原料成本,控制反應(yīng)體系中L-絲氨酸與磷脂酰膽堿質(zhì)量比為15∶1。

      2.2.5 有機(jī)相與水相體積比的影響

      有機(jī)相選用乙醚,緩沖液pH為6.5,反應(yīng)溫度為30℃,L-絲氨酸添加量為0.3 g,僅改變有機(jī)相的體積,其他條件見1.2.5,有機(jī)相與水相體積比對PS生成率的影響如圖5所示。

      圖5 有機(jī)相與水相體積比對PS生成率的影響

      從圖5可以看出,當(dāng)有機(jī)相與水相體積比小于1∶1時(shí),PS生成率隨兩相體積比的增大而增大,這是因?yàn)殡S著兩相體積比的增大,兩相界面面積增大,水相中的酶與有機(jī)相中底物的接觸概率增大,從而提高了PS生成率。兩相體積比繼續(xù)增大時(shí),雖然底物和磷脂酶D的接觸概率提高,但酶更容易與有機(jī)溶劑接觸,酶的活性降低,因此PS生成率逐漸下降。所以調(diào)整反應(yīng)體系中有機(jī)相與水相體積比為1∶1。

      2.2.6 PS的合成反應(yīng)進(jìn)程

      對雙液相體系酶法制備PS工藝進(jìn)行優(yōu)化后,得到最優(yōu)反應(yīng)條件:有機(jī)相為乙醚,pH 6.5,反應(yīng)溫度30℃,L-絲氨酸與磷脂酰膽堿質(zhì)量比15∶1,有機(jī)相與水相體積比1∶1。在最優(yōu)條件下進(jìn)行PS合成,定時(shí)取樣檢測各磷脂組分含量,結(jié)果如圖6所示。

      圖6 磷脂酰絲氨酸合成反應(yīng)進(jìn)程

      由圖6可以看出:底物在2.5 h后幾乎被完全消耗;在合成PS的過程中,有副產(chǎn)物磷脂酸(PA)產(chǎn)生,這表明轉(zhuǎn)酯反應(yīng)過程中有水解反應(yīng)發(fā)生;產(chǎn)物PS含量在反應(yīng)2.5 h后變化不大,即最佳反應(yīng)時(shí)間為2.5 h,此時(shí)PS生成率為74.8%。本實(shí)驗(yàn)廣島鏈霉菌所產(chǎn)磷脂酶D的PS生成率略低于嚴(yán)明等[17]的固定化磷脂酶D 78.6%的生成率,但與張憶雪[16]、Hosokawa[18]等相比,PS生成率提高了約40%,高于已報(bào)道的大多數(shù)磷脂酶D[19-21],說明可以應(yīng)用于PS的酶法合成。

      3 結(jié) 論

      胞外粗酶液通過硫酸銨沉淀、Hitrap SP HP陽離子交換層析和Superdex 200 10/300 GL凝膠層析純化后,磷脂酶D比酶活由0.91 U/mg提高到49.48 U/mg,是粗酶液的54.37倍,回收率為32.31%。雙液相體系酶法制備磷脂酰絲氨酸工藝研究表明,在以乙醚為有機(jī)相、pH 6.5、反應(yīng)溫度30℃、L-絲氨酸與磷脂酰膽堿質(zhì)量比15∶1、有機(jī)相與水相體積比1∶1條件下反應(yīng)2.5 h,底物基本被消耗完,此時(shí)磷脂酰絲氨酸生成率達(dá)到74.8%。

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