李 雪，張 玉，王君虹，朱作藝，李 利，章國(guó)祥，關(guān)榮發(fā)，Ayton Jamie，李 文，王 偉，劉 軍

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，杭州 310021； 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品信息溯源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310021；3.木本油料品質(zhì)營(yíng)養(yǎng)國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，杭州310021； 4.杭州出入境檢驗(yàn)檢疫局，杭州 310012；5.中國(guó)計(jì)量大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，杭州 310018； 6.澳大利亞初級(jí)產(chǎn)業(yè)部 油脂研究實(shí)驗(yàn)室，澳大利亞 沃加沃加 2650)

橄欖油是從油橄欖鮮果中直接壓榨的植物油，其含有豐富的不飽和脂肪酸、甾醇、多酚及多種微量元素，因而具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及保健功能[1]，被稱為“植物油皇后”和“地中海甘露”。橄欖油中含有多種極性酚類化合物，能夠提高橄欖油的氧化穩(wěn)定性，延長(zhǎng)橄欖油的貨架期，影響橄欖油的色澤和風(fēng)味[2]。該類化合物具有抗氧化[1-3]、抗菌[4]、抗炎[4-6]、抗腫瘤[7]、降血脂[8-9]、預(yù)防阿爾茨海默病[10-13]等多種生理活性，其潛在的醫(yī)藥價(jià)值越來(lái)越受到研究者的關(guān)注。

橄欖油中的多酚類化合物種類繁多，但含量較低，因此有效的提取方法是對(duì)其深入研究的前提。橄欖油中酚類化合物的提取方法已有較多報(bào)道，其中應(yīng)用最廣泛的萃取方法分別為液液萃取法[3,14-17]和固相萃取法[18-20]。前者主要以正庚烷作為溶劑，以甲醇-水溶液作為萃取液進(jìn)行目標(biāo)化合物萃取，該方法重現(xiàn)性較好；后者主要應(yīng)用二醇基固相萃取柱，以甲醇作為洗脫液進(jìn)行油中多酚組分分離提取，與液液萃取法相比，其有機(jī)溶劑用量較少。液液微萃取法是近年興起的液液萃取新技術(shù)，是將微量萃取溶劑通過(guò)微量注射器針頭尖端，直接浸入樣品分散液中進(jìn)行萃取，該方法操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，有機(jī)溶劑使用量?jī)H在微升級(jí)[21]。目前，已有研究應(yīng)用液液微萃取的方法進(jìn)行橄欖油中多酚類組分的提取[22-23]。以上3種方法各有優(yōu)勢(shì)，但其對(duì)于橄欖油中極性酚類提取效果的比較鮮見(jiàn)報(bào)道。目前，已報(bào)道的橄欖油中多酚組分分析方法主要為液相色譜法[24-26]及液相色譜質(zhì)譜法[14]，前者定量準(zhǔn)確可靠且重現(xiàn)性好，但對(duì)于橄欖油中復(fù)雜酚類化合物的鑒別分析具有一定的局限性，后者在定量同時(shí)可獲得目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)相關(guān)信息，但化合物峰分離度較差。因此，高效、快速的分析方法有待進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。

本研究分別應(yīng)用液液萃取法、固相萃取法及液液微萃取法對(duì)特級(jí)初榨橄欖油中極性酚類化合物進(jìn)行提取，通過(guò)超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法(UPLC-HRMS)及Folin-Ciocalteus比色法對(duì)提取物中酚類化合物組成的研究和總酚含量的測(cè)定，比較3種方法對(duì)酚類化合物的提取效率，篩選最佳的方法，為提取方法的進(jìn)一步優(yōu)化提供依據(jù)，以期為橄欖油酚類化合物的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

原材料為西班牙原裝進(jìn)口托雷多特級(jí)初榨橄欖油。沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99%)，阿拉丁試劑公司；甲醇、乙醇、正庚烷、正己烷、乙酸乙酯、福林酚試劑、碳酸鈉均為分析純；乙腈為色譜純，德國(guó)默克公司；超純水，Millipore純水儀制備。二醇基固相萃取柱(500 mg，3 mL)，濟(jì)南博納生物技術(shù)有限公司。

Waters Acquity UPLC液相色譜串聯(lián)Waters Synapt G2S四級(jí)桿飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜儀，美國(guó)Waters公司；RV10-D-V型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司；722型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同方法提取特級(jí)初榨橄欖油酚類化合物

1.2.1.1 液液萃取法

準(zhǔn)確稱取油樣10.00 g，加入20 mL正庚烷，振搖，使油樣完全溶解，加入20 mL甲醇-水溶液(體積比60∶40)，在50 mL分液漏斗中振搖2 min，靜置分層，收集下層清液；上層液體加入20 mL甲醇-水溶液(體積比60∶40)重復(fù)操作，靜置分層，收集下層清液，合并兩次清液后加入20 mL正庚烷進(jìn)行洗滌，得到澄清下層液體。將下層液體進(jìn)行低溫減壓旋蒸除溶劑后，密封，于-20℃避光保存，備用。

1.2.1.2 固相萃取法

準(zhǔn)確稱取油樣1.25 g，溶于3 mL正己烷中。分別用3 mL甲醇和3 mL正己烷平衡固相萃取柱，真空抽濾；上樣，用3 mL正己烷淋洗萃取柱，重復(fù)1次，再用3 mL正己烷-乙酸乙酯(體積比90∶10)淋洗萃取柱，棄去全部淋洗液；最后用5 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，于低溫條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，-20℃避光保存，備用。

1.2.1.3 液液微萃取法

參照文獻(xiàn)[23]方法，準(zhǔn)確稱取2.00 g油樣于帶塞試管中，配制1 mL正庚烷與150 μL乙醇-水溶液(體積比60∶40)混合液，用2 mL注射器將混合液快速注入油樣中，渦旋1 min，4 000 r/min離心5 min，用微量注射器吸取下層液體，氮?dú)獯蹈桑?20℃避光保存，備用。

1.2.2 提取物中酚類化合物組成的超高效液相色譜質(zhì)譜分析

不同方法獲得的提取物分別用500 μL甲醇-水溶液(體積比1∶1)復(fù)溶，渦旋振蕩1 min，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，用于液質(zhì)分析。

超高效液相色譜條件：Waters Acquity UPLC RP18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；柱溫35℃；樣品室溫度10℃；流動(dòng)相A為0.1%甲酸-水，B為乙腈；洗脫梯度為0～10 min 95.0%～75.0% A,10～25 min 75.0%～70.0% A,25～50 min 70.0%～0.0% A,50～51 min 0.0%～95.0% A,51～60 min 95.0%～95.0% A；流速0.3 mL/min。

質(zhì)譜條件：ESI電噴霧離子源(美國(guó)Waters)；負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓2.5 kV；錐孔電壓35 V；離子源溫度120℃；脫溶劑氣溫度350℃；錐孔氣流量50 L/h；脫溶劑氣流量600 L/h；質(zhì)譜采集范圍(m/z)100～1 000。校正曲線：甲酸鈉，分辨率模式。實(shí)時(shí)校正：2 ng/mL亮氨酸腦啡肽，15 s校正1次，每次0.5 s，5 μL/min。

1.2.3 總酚含量的測(cè)定

參考LS/T 6119—2017采用Folin-Ciocalteus比色法于750 nm波長(zhǎng)處測(cè)定提取物的吸光度，并根據(jù)沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算樣品中的總酚含量。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

本研究獲得的數(shù)據(jù)采用3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)表示。利用GraphPad Prism5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05被認(rèn)為是顯著，P<0.01被認(rèn)為是極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 特級(jí)初榨橄欖油中酚類化合物組成的液相色譜質(zhì)譜分析

橄欖油中酚類化合物種類繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，因此應(yīng)用色譜技術(shù)對(duì)其分離分析具有一定的挑戰(zhàn)性。UPLC-HRMS針對(duì)含有復(fù)雜組分的樣品具有分離速度快、靈敏度高、可同時(shí)獲得目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)相關(guān)信息等優(yōu)點(diǎn)。因此，UPLC-HRMS可成為橄欖油酚類化合物分離分析的強(qiáng)有力工具。本研究首先對(duì)多酚組分的儀器條件進(jìn)行了優(yōu)化。對(duì)于液相色譜條件，首先對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了考察，分別以純水、0.1%甲酸-水及0.2%甲酸-水作為水相，對(duì)比分離結(jié)果，由于多酚類組分呈弱酸性，在酸性流動(dòng)相中獲得更好的峰形，而兩種酸性水相差別不大，因此選擇0.1%甲酸-水作為水相；本研究還對(duì)比了Waters Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)及Waters Acquity UPLC RP18兩種色譜柱的分離效果，前者所需時(shí)間長(zhǎng)，且分離度較低，因此選擇RP18柱用于色譜分離。對(duì)于質(zhì)譜條件，主要考察了待測(cè)成分在正負(fù)譜中的信號(hào)響應(yīng)，結(jié)果顯示，負(fù)離子模式能提供更多的化合物種類信息，因此采用負(fù)離子模式進(jìn)行分析；其他質(zhì)譜參數(shù)通過(guò)儀器自動(dòng)優(yōu)化獲得。優(yōu)化后的液相色譜質(zhì)譜條件見(jiàn)1.2.2。

應(yīng)用優(yōu)化的條件對(duì)提取物進(jìn)行檢測(cè)。得到的總離子流圖見(jiàn)圖1。由圖1可以看出，該分析方法的色譜峰分離度較好。通過(guò)文獻(xiàn)[14,17,27]對(duì)照及高分辨質(zhì)譜信息對(duì)化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行推斷，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，3種方法從特級(jí)初榨橄欖油中共檢測(cè)到40種酚類成分，按照結(jié)構(gòu)的不同可以分為酚酸類、酚醇類、裂環(huán)烯醚萜類、黃酮類及其他等5類化合物，其中酚醇類和裂環(huán)烯醚萜類為主要成分，酚醇類主要為羥基酪醇，裂環(huán)烯醚萜類主要為橄欖苦苷元、女貞苷元。液液萃取法提取的酚類化合物種類明顯多于液液微萃取法和固相萃取法。液液萃取樣品中共檢測(cè)到33種酚類化合物，包括酚酸類、酚醇類、裂環(huán)烯醚萜類、黃酮類等；固相萃取樣品中共檢測(cè)到20種酚類化合物，包括酚醇類、裂環(huán)烯醚萜類、黃酮類等；液液微萃取樣品中共檢測(cè)到15種酚類化合物。以上結(jié)果表明，不同萃取方法導(dǎo)致橄欖油樣品的酚類化合物在其組成上出現(xiàn)較大差別。其中，液液萃取法對(duì)于含量較低的酚酸類(咖啡酸)及多種橄欖苦苷和女貞苷的衍生物具有較好的提取效率；固相萃取法對(duì)女貞苷元和羥基酪醇的提取效率較高；而液液微萃取法僅對(duì)橄欖苦苷元和羥基酪醇具有較好的提取效果，對(duì)其他成分提取效率較低。

表1 特級(jí)初榨橄欖油中酚類化合物組成

注：a.液液萃取法；b.固相萃取法；c.液液微萃取法；“+”檢出，“-”未檢出。

圖1 不同方法提取特級(jí)初榨橄欖油中酚類化合物UPLC-HRMS總離子流圖

2.2 不同方法提取特級(jí)初榨橄欖油總酚含量比較

本研究采用Folin-Ciocalteus比色法對(duì)3種方法提取的樣品進(jìn)行總酚含量測(cè)定。以吸光度(x)為橫坐標(biāo)，沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為：y=96.82x+0.838 7(R2=0.999 8)，結(jié)果表明其線性關(guān)系良好。依據(jù)此回歸方程計(jì)算3組樣品中總酚含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同方法提取特級(jí)初榨橄欖油中總酚的含量(n=3)

由表2可見(jiàn)，不同方法提取的橄欖油總酚含量差異明顯，3種方法提取總酚的含量高低順序?yàn)橐阂狠腿》?固相萃取法>液液微萃取法。液液萃取法提取的總酚含量明顯高于其他兩種方法，液液微萃取法提取的總酚含最最低。統(tǒng)計(jì)分析表明，3種方法提取結(jié)果比較均具有極顯著差異(P<0.01)。

2.3 不同提取方法實(shí)驗(yàn)過(guò)程比較

本研究對(duì)3種提取方法實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所需的材料及時(shí)間等進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同提取方法實(shí)驗(yàn)過(guò)程比較結(jié)果

由表3可見(jiàn)：液液萃取法所需的油量是固相萃取法的8倍，液液微萃取法的5倍；使用有機(jī)溶劑體積分別是固相萃取法和液液微萃取法的3.2倍和58.7倍；所需實(shí)驗(yàn)時(shí)間是固相萃取法的3.7倍，液液微萃取法的11.2倍。結(jié)果表明，液液萃取法相對(duì)于另外兩種方法耗費(fèi)油量最多，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且需有機(jī)溶劑最多，而液液微萃取法操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，所需有機(jī)溶劑量遠(yuǎn)低于液液萃取法及固相萃取法。

3 結(jié) 論

本研究應(yīng)用液液萃取法、固相萃取法和液液微萃取法提取特級(jí)初榨橄欖油中酚類化合物，通過(guò)對(duì)提取樣品中酚類化合物的組成分析和總酚含量測(cè)定對(duì)比研究3種方法的提取效率。結(jié)果表明：液液萃取法提取的酚類化合物種類明顯多于其他兩種方法，同時(shí)總酚含量也最高，與其他兩種方法相比具有極顯著差異。通過(guò)實(shí)驗(yàn)過(guò)程比較，液液萃取法存在耗油量多、步驟煩瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、需消耗大量的有機(jī)試劑等不足。而液液微萃取法具有溶劑用量少、耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，符合綠色環(huán)保樣品前處理的發(fā)展方向，可對(duì)其進(jìn)一步優(yōu)化，以期達(dá)到多種類酚類化合物的高效、快速、無(wú)污染提取。