李克，潘麗紅，羅小虎，王莉，王韌，杜志紅，李才明，陳正行*

1(江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)2(江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122) 3(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)又稱F2毒素，主要是由鐮孢屬菌種產(chǎn)生的一種次級(jí)代謝產(chǎn)物。產(chǎn)ZEN的霉菌主要為田間霉菌，分布較廣，易污染玉米、小麥、大麥、燕麥和小米等谷類作物，我國(guó)大部分地區(qū)都適宜其生長(zhǎng)[1]。ZEN可引發(fā)人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和動(dòng)物的生殖系統(tǒng)紊亂[2-3]。因此對(duì)于食用這些谷物的人和動(dòng)物而言，危害巨大。

嘔吐毒素(deoxynivalenol，DON)又名脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，為鐮刀菌屬的禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌等的次級(jí)代謝產(chǎn)物，是較為常見(jiàn)的一種真菌毒素，其廣泛存在于谷物中，如玉米、小麥、大麥等。每年全世界谷物類糧食都易受到DON的困擾，造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。人和動(dòng)物如果長(zhǎng)期攝入DON可抑制體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，對(duì)人體有一定的危害作用，會(huì)造成嘔吐、腹瀉、厭食、惡心、神經(jīng)紊亂等毒性效應(yīng)[6-8]，歐盟分類標(biāo)準(zhǔn)為三級(jí)致癌物。

電子束輻照(electron beam irradiation，EBI)作為輻照技術(shù)中的一種，其原理為利用電子加速器產(chǎn)生的低能或者高能電子束射線，直接作用在分子上，使分子改性。EBI在真菌毒素降解領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用前景[9]。EBI作為輻照技術(shù)的一種，相比于γ輻照，更具便捷性、經(jīng)濟(jì)性和安全性。羅小虎等[10]研究表明EBI對(duì)玉米中黃曲霉毒素B1具有良好的降解作用。Supriya等[11]利用10和15 kGy EBI處理刀豆，在室溫下貯存6個(gè)月，發(fā)現(xiàn)2種黃曲霉毒素被完全去除。郭東權(quán)等[12]以310 μg/kg的赭曲霉毒素A標(biāo)品為研究對(duì)象，經(jīng)過(guò)5 kGy EBI處理，降解率可達(dá)93.19%。此外，彭春紅等[13]還對(duì)赭曲霉毒素A經(jīng)EBI處理后的產(chǎn)物進(jìn)行了分析，并對(duì)6種產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和毒性進(jìn)行了分析。ASSUN?O等[14]工接種Aspergillusflavus至堅(jiān)果中，隨后對(duì)堅(jiān)果中的黃曲霉毒素B1進(jìn)行了EBI處理，在5和10 kGy劑量下，毒素降解率分別達(dá)到53.32%和65.66%。張昆等[15-16]研究表明EBI對(duì)DON溶液中毒素的降解效果明顯，降解率隨劑量的增加而升高。高濃度的DON溶液在1～10 kGy輻照劑量時(shí)，降解效果比較好，而低濃度的DON在10～20 kGy輻照劑量時(shí)，降解效果比較好。前人的研究表明，EBI對(duì)于常見(jiàn)真菌毒素污染物均具有良好的降解效果，但尚未見(jiàn)EBI同時(shí)降解混合毒素的研究。

食品是國(guó)民基礎(chǔ)行業(yè)，安全生產(chǎn)是食品行業(yè)的關(guān)鍵問(wèn)題，重中之重。然而，我國(guó)大宗糧食如玉米、水稻和小麥中，真菌毒素檢出率和超標(biāo)率居高不下，玉米所受真菌毒素污染尤為嚴(yán)重。隨著真菌毒素污染造成的食品安全問(wèn)題暴露于公眾視野[17-18]，研究人員不斷尋求真菌毒素污染糧食降解再利用的方法，以盡可能減少國(guó)民經(jīng)濟(jì)損失和安全隱患。本文基于前人研究，探究EBI對(duì)ZEN和DON單一以及混合標(biāo)品的降解情況，同時(shí)在玉米漿及玉米粉中進(jìn)行了效果驗(yàn)證，探究毒素降解及相互作用規(guī)律，促進(jìn)EBI在降解玉米中真菌毒素的應(yīng)用，縮短理論研究與工業(yè)實(shí)際生產(chǎn)之間的距離，為提高玉米原料的利用率提供新的解決思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DON和ZEN自然污染玉米，江蘇泰興；DON和ZEN標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.8%)、乙酸(色譜純)，百靈威科技有限公司；甲醇、乙腈(色譜純)，美國(guó)Fisher Scientific公司；實(shí)驗(yàn)用超純水(電阻≥18.2 MΩ/cm)，美國(guó)Millipore公司；N2(純度≥99.8%)，無(wú)錫新南化學(xué)氣體有限公司；除已注明外，其他分析純?cè)噭┚?gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀1260系列帶紫外和熒光檢測(cè)器、ZORBAX SB-aq色譜柱(150 mm×4.6 mm；粒徑5 μm)、BEM固相萃取柱(12165001B)，美國(guó)安捷倫公司；Mycosep 227多功能凈化柱,ROMER國(guó)際貿(mào)易(北京)有限公司，Simplicity UV型超純水儀,美國(guó)Millipore公司；EBI加速器(AB5.0),無(wú)錫愛(ài)邦輻射技術(shù)有限公司；水分分析儀MB 25,奧豪斯儀器(上海)有限公司；SCIENTZ-150高壓均質(zhì)機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 高效液相色譜檢測(cè)DON和ZEN方法

(1)DON和ZEN標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

將DON和ZEN標(biāo)準(zhǔn)品溶于甲醇溶液(色譜純)，制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18 ℃保存。將100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇稀釋成20 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，-4 ℃保藏。

(2)玉米漿中DON和ZEN含量測(cè)定

玉米漿制作工藝參考郭成宇等的方法[19]，m(玉米)∶m(水)=1∶3的比例進(jìn)行混合，2次磨漿，均質(zhì)壓力為30 MPa，均質(zhì)溫度為40 ℃，均質(zhì)2次，4 ℃下于自封袋中儲(chǔ)藏待用。

玉米漿中DON和ZEN提?。悍Q取25.00 g玉米漿樣品到250 mL錐形瓶中，加入100 mL 84%(體積分?jǐn)?shù))乙腈溶液，以200 r/min在恒溫?fù)u床(30 ℃)上振蕩30 min后，過(guò)濾得到提取液。

DON和ZEN凈化方法：分別取6 mL樣品提取液過(guò)Mycosep 227多功能凈化柱和BEM固相萃取柱，各收集4 mL凈化液，50 ℃條件下N2吹干，殘余物用1 mL甲醇復(fù)溶，渦旋振蕩30 s，過(guò)0.22 μm有機(jī)針孔濾膜，收集濾液于進(jìn)樣瓶中，樣品待測(cè)。

③液相色譜條件

DON：ZORBAX SB-aq色譜柱(150 mm×4.6 mm；粒徑5 μm)；流動(dòng)相：V(乙腈)∶V(水)=6∶94；流速0.9 mL/min；柱溫30 ℃；紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)218 nm[20]。

ZEN：ZORBAX SB-aq色譜柱(150 mm×4.6 mm；粒徑5 μm)；流動(dòng)相：V(甲醇)∶V(水)=60∶40；流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃；熒光檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)274 nm，發(fā)射波長(zhǎng)440 nm[1]。

1.3.2 EBI處理毒素標(biāo)準(zhǔn)品

(1)EBI處理單一毒素：取一定量的DON和ZEN標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別用甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為0.1、1.0和10 μg/mL的溶液，取1 mL于10 mL聚乙烯離心管中。分別在0、2、4、6、8和10 kGy下進(jìn)行輻照，加速電子能量5 MeV，束流20 mA，劑量率2 kGy/s。

(2)EBI處理混合毒素：取毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇配制為終質(zhì)量濃度1 μg/mL的ZEN-DON混合溶液，取1 mL置于10 mL聚乙烯離心管。分別在0、2、4、6、8和10 kGy下輻照。

1.3.3 EBI處理加標(biāo)玉米漿

在玉米漿中加入ZEN和DON標(biāo)準(zhǔn)溶液，混合均勻，使其在玉米漿中終質(zhì)量濃度為1 μg/mL，分別得到單一毒素和混合毒素加標(biāo)玉米漿，4 ℃放置過(guò)夜。將加標(biāo)樣品鋪平至厚度≤1 cm后，在20 kGy劑量下進(jìn)行EBI處理。以未加標(biāo)樣品作為空白，檢測(cè)其回收率。

1.3.4 EBI處理自然污染玉米

以250 g為單位，將不同水分含量(14.2%，19.8%)的玉米粉(自然污染玉米籽粒磨粉過(guò)30目篩)分裝入聚乙烯袋中，鋪平至厚度≤1 cm，于0、10、20、30、40和50 kGy劑量下EBI處理，以人工污染玉米粉為對(duì)照。輻照后的樣品于4 ℃下儲(chǔ)藏待測(cè)。

1.3.5 玉米水分含量測(cè)定

按照國(guó)標(biāo)GB/T 5009.3—2010測(cè)定玉米粉水分含量。用于EBI處理的玉米粉初始水分含量為14.2%，通過(guò)人工加濕獲得水分含量為19.8%的玉米粉樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 EBI降解單一毒素的效果

不同濃度下單一毒素標(biāo)準(zhǔn)品的EBI降解效果如圖1所示。結(jié)果表明，ZEN和DON降解率均隨EBI劑量的增加而增加。

圖1 不同劑量EBI處理對(duì)ZEN(a)和DON(b)標(biāo)品的降解效果Fig.1 The degradation effect of ZEN (a) and DON (b)by EBI at different doses

當(dāng)輻照劑量為0～4 kGy時(shí)，DON降解率緩慢增加，6～8 kGy輻照劑量下，降解率迅速上升，10 kGy劑量下，0.1 μg/mL的DON降解率達(dá)到100%，其他2種濃度下，DON降解率分別為76.04%和71.86%。張昆等[13]發(fā)現(xiàn)EBI處理DON純品，隨著輻照劑量的增加，降解率逐漸升高，與本研究結(jié)果相同。輻照劑量0～10 kGy下，ZEN的降解率一直呈快速增加狀態(tài)，當(dāng)劑量為10 kGy時(shí)，3種不同濃度的ZEN樣品降解率分別達(dá)到了100%、89.31%和77.67%。結(jié)果表明，濃度對(duì)EBI降解毒素的影響存在顯著性差異(P<0.05)。

2.2 EBI降解ZEN-DON混合溶液效果

以單一毒素降解率為對(duì)照，EBI對(duì)ZEN-DON混合溶液的降解效果如圖2所示。結(jié)果表明，1 μg/mL質(zhì)量濃度下，混合溶液中ZEN和DON降解率與EBI呈劑量依賴性；ZEN降解效果明顯減弱，當(dāng)劑量為6 kGy時(shí)降解率差值達(dá)到最大，由單一降解時(shí)的70.27%降為28.57%；0～8 kGy時(shí)，DON降解趨勢(shì)未發(fā)生明顯變化，2種毒素共存體系狀態(tài)下，DON對(duì)ZEN的降解存在較強(qiáng)的抑制作用，ZEN對(duì)DON的降解效果影響不顯著(P>0.05)。

圖2 不同劑量EBI處理對(duì)ZEN-DON混合溶液的降解效果Fig.2 The degradation effect of mixed solution of ZEN-DON by EBI at different doses

2.3 EBI降解玉米漿中毒素的效果

玉米漿中ZEN和DON的加標(biāo)回收率如表1所示，以未加標(biāo)玉米漿為空白，扣除其本底濃度，回收率均高于80%。

表1 玉米漿中ZEN和DON的加標(biāo)回收率Table 1 Recovery of spiked ZEN and DON in corn syrup

由于玉米漿對(duì)電子束穿透性具有一定阻隔作用，加之EBI作用于水溶液后產(chǎn)生的自由基和水合離子也可與玉米成分發(fā)生反應(yīng)，因此選用0～50 kGy的輻照劑量降解玉米漿中的毒素。圖3所示為較大輻照劑量下，EBI對(duì)1000 μg/kg玉米漿中ZEN和DON的降解效果。與2.1中結(jié)果類似，ZEN和DON的降解率均隨EBI劑量的增加而增加，其中ZEN降解率大于DON。劑量為50 kGy時(shí)，ZEN和DON的降解率分別為92.15%和72.08%。

由圖3可知，10 kGy劑量下，ZEN在玉米漿中的降解率為55.21%，顯著低于其標(biāo)準(zhǔn)品溶液的降解率(89.31%)。齊麗君等[1]的研究結(jié)果表明，50 kGy EBI處理可導(dǎo)致玉米籽粒色度增加，脂肪酸值升高，氨基酸含量下降。由此可知，EBI產(chǎn)生的活性物質(zhì)可與玉米組分發(fā)生反應(yīng)，從而導(dǎo)致與毒素分子發(fā)生反應(yīng)的自由基和水合電子濃度下降，毒素降解率降低。此外，該研究中，50 kGy EBI劑量下，玉米樣品僅氨基酸含量和玉米淀粉糊化特性變化顯著(P<0.05)，其它理化性質(zhì)無(wú)明顯變化。

圖3 不同劑量EBI對(duì)玉米漿中ZEN和DON的降解效果Fig.3 The degradation effect of ZEN and DON byEBI at different doses in spiked corn syrup

劑量-降解率曲線，最大程度地反映了混合毒素同時(shí)降解的相互作用，選取20 kGy作為混合毒素的輻照劑量，對(duì)混合毒素加標(biāo)玉米漿進(jìn)行輻照處理，結(jié)果如圖4所示。ZEN和DON混合加標(biāo)的玉米漿經(jīng)EBI處理后，相較于單一毒素加標(biāo)樣品，ZEN的降解率由70.98%降至約60%，呈明顯降低，DON降解率則略微升高，但變化不顯著(P>0.05)，說(shuō)明在EBI處理過(guò)程中，DON對(duì)ZEN的降解具有抑制作用。

圖4 EBI處理(20 kGy)對(duì)混合加標(biāo)玉米漿中ZEN和DON的降解效果Fig.4 The degradation effect of ZEN and DON in spikedcorn syrup by EBI (20 kGy)

2.4 EBI降解自然污染玉米中毒素的效果

EBI對(duì)單一加標(biāo)玉米粉中ZEN(1203.72 μg/kg)和DON(724.55 μg/kg)的降解效果如圖5所示。14.2%水分的玉米粉中ZEN和DON降解率均呈劑量依賴性，50 kGy劑量下，二者降解率分別達(dá)71.10%和49.31%；當(dāng)水分含量提高至19.8%時(shí)，2種毒素降解率均進(jìn)一步增加，且輻照劑量越大，降解率增加越顯著，50 kGy時(shí)，ZEN和DON降解率分別為89.05%和70.04%。以上結(jié)果表明，水分含量對(duì)玉米粉中2種毒素的EBI降解具有顯著影響，導(dǎo)致該現(xiàn)象的原因可能為：相同劑量下，隨水分含量增加，反應(yīng)體系中自由基和水合電子含量增加，因此增大了反應(yīng)活性物質(zhì)與毒素分子的碰撞機(jī)率。

圖5 EBI輻照對(duì)不同水分含量玉米粉中ZEN(a)和DON(b)的降解效果Fig.5 The degradation effect of ZEN(a) and DON(b) incorn powder with different moisture content by EBI

根據(jù)圖5所示結(jié)果，選取30 kGy EBI處理不同水分含量的ZEN(1189.73 μg/kg)和DON(756.10 μg/kg)自然污染玉米粉，結(jié)果如圖6所示。

a-14.2水分含量；b-19.80水分含量圖6 EBI處理(30 kGy)對(duì)不同水分含量玉米粉中ZEN和DON的降解效果Fig.6 The degradation effect of ZEN and DON in cornpowder with different moisture content by EBI (30 kGy)

圖6(a)中，14.2%水分含量下，自然污染樣品中ZEN和DON降解率均顯著低于單一加標(biāo)玉米粉(P<0.05)，而圖6(b)水分含量19.8%的玉米粉中，ZEN降解率仍顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，DON降解率則略微高于單一加標(biāo)樣品。由此可知，毒素共同污染玉米粉中，ZEN和DON的降解規(guī)律顯著不同于單一污染樣品，高水分含量下，DON對(duì)ZEN的EBI降解存在抑制現(xiàn)象，而低水分含量下2種毒素降解效果較差，推測(cè)原因可能為EBI激發(fā)水分子產(chǎn)生的自由基和水合電子較少，由此導(dǎo)致ZEN和DON競(jìng)爭(zhēng)活性物質(zhì)。

3 結(jié)論

本文考察了EBI對(duì)谷物中常見(jiàn)真菌毒素DON和ZEN的降解效果，并分析兩者同時(shí)降解的相互作用，為EBI在糧食真菌毒素降解中的應(yīng)用提供了理論參考。研究結(jié)果表明，高水分含量下，DON對(duì)ZEN的EBI降解有一定程度的抑制作用，實(shí)際工業(yè)應(yīng)用中對(duì)兩者同時(shí)存在的情況需酌情加大輻照劑量，以達(dá)到預(yù)期降解效果。