超高壓誘導食品中微生物失活的研究進展

馬亞琴，賈蒙，成傳香，王鵬旭

(西南大學柑桔研究所，國家柑桔工程技術(shù)研究中心，重慶，400712)

隨著生活水平的提高，一些最少加工、即食(ready-to- eat，RTE)的新鮮食品越來越受到消費者的青睞。同時，食品安全事故的頻發(fā)以及傳統(tǒng)殺菌工藝的局限性引發(fā)了大眾對新型食品安全的關(guān)心和非熱加工技術(shù)(如超高壓、高壓脈沖、紫外輻照、超聲波、微波技術(shù)等)的期待。在確保食品生產(chǎn)安全的同時滿足營養(yǎng)、無添加的高品質(zhì)食品是當今的消費趨勢，非熱殺菌技術(shù)亦成為食品加工領(lǐng)域的主流研究熱點。其中，超高壓處理(high pressure processing，HPP) 能通過施加壓力(100～1 000 MPa)滅活食品中存在的致病菌及腐敗菌，從而延長食品貨架期[1]。HPP是一種多靶點殺菌技術(shù)，其利用壓力改變分子間距，致使微生物細胞形態(tài)改變，并破壞生物高分子物質(zhì)(蛋白質(zhì)和碳水化合物等)立體結(jié)構(gòu)的非共價鍵，抑制酶活性和遺傳物質(zhì)復制等，從而引起細胞膜、細胞壁、核糖體等細胞器的功能改變或損失，這些損傷累積最終導致細胞死亡[2]。由于HPP不會使分子的共價鍵斷裂，對食品內(nèi)部化學變化影響較小；其非熱特性亦能較好地保留食品的感官品質(zhì)和營養(yǎng)成分[3]?；谶@一優(yōu)勢，全球已有近400套HPP設(shè)備投入到新型食品(有機食品、保健食品)的加工生產(chǎn)，HPP也成為最早商業(yè)化的非熱殺菌技術(shù)[4]。

但在HPP的工業(yè)化實施中，仍然存在一些重要的科學和技術(shù)難題懸而未決，除了生產(chǎn)中存在的殺菌效果不穩(wěn)定、間歇處理缺陷和工藝復雜性等問題外，研究人員對超高壓加工中微生物(耐壓性芽孢以及亞致死菌等)失活機制的有限認知也是制約因素之一[5]。因此，本文綜述了HPP技術(shù)對食品中微生物的影響，通過闡述HPP致死食品中微生物的內(nèi)外因子、發(fā)生機制以及與其他技術(shù)聯(lián)用增強微生物的致死作用或抑制作用，有助于HPP有效降低食品安全隱患和進一步商業(yè)化。

1 HPP技術(shù)對食品中微生物的作用效果

食品中眾多營養(yǎng)成分是微生物生長繁殖的豐富營養(yǎng)源，因此在HPP加工過程中，微生物滅活對提高其安全性和延長貨架期至關(guān)重要。表1列出了HPP處理對食品中部分微生物的殺菌效果，除了HPP對干腌火腿切片的殺菌效果不顯著外，其余結(jié)果表明多數(shù)致病菌和腐敗微生物在HPP后能顯著減少。然而，HPP處理后可誘導部分微生物損傷，使其細胞完整性損失，同時保持一定的生理活性，在特定條件下能自我修復為正常細胞，這種現(xiàn)象被稱為微生物的亞致死效應(sublethal effects)[6]。根據(jù)HPP處理后微生物的損傷程度，可將其分為3種不同的生理狀態(tài)，即死亡細胞、正常細胞和亞致死細胞[7]。由于亞致死細胞特性改變，以至于在常規(guī)檢測中常被低估或忽略，如果在殺菌過程中不對其完全殺滅，將會很大程度上給食品工業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失及安全隱患[6]，因此有必要對HPP引起微生物失活或亞致死效應的作用條件進行研究，進一步改善其殺菌效果。

2 影響HPP殺菌效果的內(nèi)外因子

為了研究HPP作用于微生物的效果，需要針對HPP新技術(shù)開發(fā)出有關(guān)其預測模型、動力學參數(shù)以及規(guī)范化工藝流程的廣泛數(shù)據(jù)庫。但此前有關(guān)HPP加工食品的大多數(shù)動力學信息(kinetics information)比較分散，且研究人員對實驗數(shù)據(jù)的分析通常依賴于線性動力學模型，即假設(shè)在等壓和等溫條件下，微生物數(shù)量變化與其濃度成正比。此外，大多數(shù)關(guān)于HPP誘導微生物失活的研究都集中在壓力效應上，而忽略了食品基質(zhì)、加壓媒介及其與容器壁和食品之間熱交換的影響[15]。因此研究人員報道了一些與線性模型存在顯著偏差的失活曲線，如凸型曲線(失活曲線上存在肩部現(xiàn)象)、凹型曲線(失活曲線上存在拖尾現(xiàn)象)、S型曲線(肩部現(xiàn)象和拖尾現(xiàn)象同時存在)等，并開發(fā)出一些非線性失活曲線模型如Weibull模型、Baranyi模型、修正Gompertz模型以及對數(shù)邏輯函數(shù)，以便更準確地描述HPP在各種食品中的微生物滅活效果[14]。如PELRG等[16]首先將Weibull模型用于模擬微生物的失活曲線，表明微生物的失活曲線上存在肩部現(xiàn)象是由于微生物在失活前存在損傷累積的過程，當其超過了微生物可承受的臨界水平，就會造成微生物的大量失活；而曲線上存在拖尾現(xiàn)象是因為殘留的微生物對壓力(或溫度)存在了抗性。造成微生物非線性失活曲線現(xiàn)象的原因可能與微生物種類以及各種不同處理參數(shù)的差異相關(guān)[17]。其他的非線性模型也解釋了微生物受到多種致死效應的共同作用，其中壓力誘導細胞膜損傷是HPP致死微生物的主導因素，在復雜的加工環(huán)境中，微生物失活還受到工藝參數(shù)、食品基質(zhì)、微生物特征等因素的影響，具體如表2所示。

表1 HPP處理對不同食品樣品中微生物的影響Table 1 Effects of HPP treatment on microorganisms in different media.

表2 影響HPP滅活微生物的因素Table 2 Factors affecting HPP inactivated microorganisms

2.1 工藝參數(shù)

2.1.1 壓力

微生物在HPP下的失活同時受到多種因素影響，其中壓力是致死微生物的主要因素，壓力可能導致細胞膜中脂質(zhì)從凝膠向水合物的晶體結(jié)構(gòu)改變，從而降低膜流動性；當高壓破壞細胞膜結(jié)構(gòu)時，微生物對營養(yǎng)的吸收受到影響，細胞內(nèi)積累的廢物清除受阻，正常代謝途徑被破壞[14]。因此，低壓水平(20～180 MPa)通常導致細胞亞致死性損傷；高壓(200～400 MPa)會使微生物細胞內(nèi)蛋白質(zhì)或酶發(fā)生不可逆變性，胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，最終導致微生物失活[18]；ATES等[19]在35 ℃用400 MPa的壓力處理李斯特菌(L.monocytogenes)5 min后，其數(shù)量從5 lgCFU/mL降低到檢測限以下(<1 lgCFU/mL)，但在4℃貯藏6周后，其數(shù)量上升至2.00～3.2 lg CFU/mL；當壓力升高至685 MPa時，李斯特菌在貯藏期間未被檢出。EVERT-ARRIAGADA等[12]也報道了隨著壓力的降低，李斯特菌數(shù)量能夠在貯藏期間迅速提升，說明低壓引起的應激能夠誘導亞致死細胞修復系統(tǒng)表達，使微生物在逐漸修復為正常狀態(tài)，或者對壓力適應，對食品造成了潛在危害(如圖1所示)[3]。因此應用HPP對食品殺菌時，適當?shù)靥嵘龎毫捎行嵘⑸锏闹滤缆?，但壓力過高則會對食品感官品質(zhì)造成不利影響，同時需要將耗能問題考慮在內(nèi)。

圖1 微生物在壓力下的損傷、修復和抵抗反應[3]Fig.1 Microbial damage, repair and resistance under stress

2.1.2 溫度

溫度是影響HPP致死微生物效果的另一重要因素，其對微生物生長代謝和存活與否有著重要的影響。在常溫條件下，隨著溫度升高，HPP能明顯提高微生物的致死率；胡友棟[20]選用不同溫度梯度(20～60℃)在相同壓力下(400 MPa)處理胡柚汁10 min后，發(fā)現(xiàn)溫度上升導致了菌落總數(shù)下降了3.00～4.20 lg CFU/g；酵母菌和霉菌下降了2.60～4.10 lg CFU/g，致死率明顯提升。ATES等[19]發(fā)現(xiàn)提高壓力/溫度(20～50℃)能夠提高亞致死菌比率。這可能是因為較低溫度導致了可逆的細胞滲透，使其耐鹽性喪失而發(fā)生損傷。此外，低溫條件(≤0℃)也有助于提升HPP的殺菌效果，因為低溫聯(lián)合壓力處理能使微生物細胞內(nèi)冰晶析出，細胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，蛋白質(zhì)更容易發(fā)生變性[21]?？傊?，在溫度協(xié)同壓力條件下，增加溫度可使壓力所導致可逆的細胞膜損傷或結(jié)構(gòu)損傷轉(zhuǎn)換為不可逆的蛋白質(zhì)變性或代謝損傷，最終導致微生物死亡[22]。

2.1.3 保壓時間

壓力條件相同時，延長保壓時間對微生物致死率也有一定程度的提高。這是因為微生物細胞體積隨著保壓時間的增加而逐漸減小，水和溶液(如Ca2+和Mg2+)向細胞外擴散，從而對微生物的生理過程產(chǎn)生重要影響，最終導致細胞內(nèi)物質(zhì)發(fā)生不可逆的滲漏，造成微生物死亡[23]。孫兆遠等[24]采用不同保壓時間的HPP條件(400 MPa，30℃)對鮮切蓮藕殺菌，發(fā)現(xiàn)HPP能在5～10 min迅速殺死絕大部分微生物，當保壓時間>15 min，菌落總數(shù)下降速度明顯減緩；同樣，孫新生[25]應用HPP對低溫火腿殺菌時也發(fā)了這一現(xiàn)象。因此，在殺菌過程中具體的保壓時間設(shè)定可能基于各種內(nèi)外因素而異，而微生物只有在最初施加壓力的一段時間內(nèi)才能大幅度減少，過長的施壓時間會導致部分微生物通過應激反應來適應壓力[26]。為此，加壓方式也被考慮作為一種影響殺菌效果的因素。

2.1.4 加壓方式

HPP根據(jù)其加壓方式可分為連續(xù)性加壓和間歇性加壓2種方式。間歇性加壓又稱為循環(huán)壓力或脈沖壓力，即在一個循環(huán)過程中，通過快速、反復地施加壓力并釋放壓力，使微生物在多次循環(huán)壓力下更容易發(fā)生亞致死損傷，且這種損傷在循環(huán)壓力下不斷加大，最終導致微生物死亡[3]。因此相對于延長保壓時間(連續(xù)性加壓)，間歇性加壓對微生物的致死率更大[27]。WANG等[11]發(fā)現(xiàn)同樣HPP條件(300 MPa，0 ℃，5 min)下，連續(xù)壓力對大腸桿菌的破壞作用更大，但產(chǎn)生了大量亞致死細胞，而2次循環(huán)壓力的累積有效增加了大腸桿菌的致死效果。此外，HPP在誘導芽孢萌發(fā)的過程中，芽孢會對壓力敏感。此時應用循環(huán)壓力處理芽孢，相比持續(xù)加壓更有效，因為重復的快速減壓會對其造成更高的傷害，滅活萌發(fā)的芽孢[28]。但有關(guān)循環(huán)壓力的報道較少，可能是因為循環(huán)壓力耗能更高，且會縮短設(shè)備使用壽命。因此還需要將加壓和減壓速率等因素考慮在內(nèi)并對其深入研究，以綜合評估HPP應用于食品工業(yè)化生產(chǎn)的有效性和適應性。

2.2 食品基質(zhì)

在復雜的食品基質(zhì)中，食品的組成成分及其性質(zhì)對HPP作用于微生物的效果密切相關(guān)，因而被認為是提高微生物耐壓性和降低滅活程度的重要因素，并會進一步導致亞致死性受損細胞在貯藏期間恢復[29]。NASIOWSKA等[30]發(fā)現(xiàn)HPP處理的胡蘿卜汁對亞致死性損傷李斯特菌的生長和再生有一定促進作用，而HPP處理的甜菜根汁相對比較安全。此外，由于食品中某些成分對微生物細胞具有保護作用，因此HPP處理緩沖液或培養(yǎng)基中微生物的失活數(shù)據(jù)并不能直接應用于HPP食品加工中。

2.2.1 食品成分

食物中各種成分，如蛋白質(zhì)、糖和鹽含量在一定程度上可能對微生物起到保護作用，增加它們對壓力的抵抗力。高濃度的糖可降低食品水分活度(aw)，從而間接為微生物提供壓力保護(baroprotection)[17]。脂肪含量對HPP處理微生物的影響仍存在爭議。一些研究表明，脂肪含量增加可能導致微生物的耐壓性增加[30]；而SYED等[31]發(fā)現(xiàn)，在0～15 min施加300～800 MPa的壓力條件下，較高的(約17%)脂肪含量才能對火腿中李斯特菌細胞產(chǎn)生壓力保護作用。因此食品中脂肪含量對HPP致死微生物的影響可能取決于壓力強度。在實際HPP殺菌中，食品成分影響可能更為復雜，因此需進一步探明食品成分間的相互作用對HPP下微生物致死效果的影響。

2.2.2 酸堿度

食品酸堿度對微生物耐壓性有顯著影響。在HPP處理時，微生物在中性食品中最具耐壓性，當酸堿度升高或降低時，微生物細胞的耐壓性降低[31]。如大腸桿菌O157:H7在酸櫻桃汁(pH=3.3)中對壓力的敏感性要高于杏汁(pH=3.8)[33]。而李斯特菌在pH為 7.0的食品基質(zhì)中，能夠承受較高的壓力水平(高達600 MPa)[34]。然而VERCAMMEN等[35]研究了HPP(100～800 MPa，25、45、75℃)對緩沖液(pH=4.0、5.0、7.0)和番茄醬(pH=4.2、5.0)中凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)和酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(A.acidocaldarius)的影響，發(fā)現(xiàn)與酸性食品系統(tǒng)相比，微生物在中性食品系統(tǒng)中的耐壓性較低，這可能與芽孢萌發(fā)有關(guān)，因為在酸性條件下壓力誘導的芽孢萌發(fā)受到抑制，因此不容易被殺滅。此外，HPP可能通過誘導弱酸電離而降低食品的pH值[23]。因此，考慮到pH在微生物失活中的作用，應開發(fā)具有pH探針的HPP設(shè)備，以測量壓力下食品樣品的pH變化[31]。

2.2.3 水分活度(aw)

高aw通常有利于微生物的生長，低aw也會增加微生物對HPP的耐壓能力。MARTNEZ-ONANDI等[36]采用HPP(600 MPa，6 min，21℃)處理不同aw的火腿，發(fā)現(xiàn)嗜冷菌(Psychrophile)和微球菌(Micrococcaceae)在低aw下有更多的殘留，而其他微生物則不受aw的顯著影響。同樣地，RUBIO等[26]發(fā)現(xiàn)低aw(0.79)對李斯特菌有保護作用，使其在400 MPa的壓力下不會顯著地減少。這可能是因為低aw可維持蛋白質(zhì)(尤其是酶)的穩(wěn)定性，從而降低了壓力誘導蛋白質(zhì)變性的可能性。

2.2.4 抗菌劑

食品中添加的一些抗菌劑能增加HPP對微生物的作用效果。DAS等[37]利用添加了山梨酸鉀(質(zhì)量分數(shù)0.1%)的印度白蝦在HPP條件(350 MPa)下處理20 min后，發(fā)現(xiàn)其李斯特菌減少約6個對數(shù)周期。ISHIMORI等[38]發(fā)現(xiàn)HPP聯(lián)合輕度熱處理并添加氨基酸協(xié)同促進了生孢梭菌芽孢生長，并且在熱殺菌(80 ℃，10 min)后可以實現(xiàn)5個對數(shù)周期以上的芽孢失活。然而也有研究發(fā)現(xiàn)一些抗菌劑能夠?qū)ξ⑸锾峁毫ΡＷo。BOVER-CID等[39]發(fā)現(xiàn)添加了乳酸鉀和二乙酸鈉(2.0%+0.11%或2.0%+0.45%)的超高壓加工火腿在貯藏期間，其李斯特菌增生率比相同濃度有機酸的非加壓產(chǎn)品快4倍，說明有機酸的存在使這些細胞能夠抵抗壓力，并從亞致死性損傷狀態(tài)恢復為正常細胞，這可能是因為抗菌劑與食品基質(zhì)相互作用并影響了HPP對微生物的致死率，但其機理尚不清楚，有待深入研究。

2.3 微生物特征

微生物具有較強的環(huán)境適應性。利用HPP加工食品時，微生物通過利用多種保護機制，如適應環(huán)境、進入休眠狀態(tài)(芽孢)、激活抗應激基因的調(diào)節(jié)或產(chǎn)生自適應變異(adaptive mutation)等。因此，微生物的抗壓能力并不是固定的，其還與自身種類特征有關(guān)，如種類和形態(tài)、生長階段等[31]。

2.3.1 微生物種類和形態(tài)

不同種類微生物對壓力表現(xiàn)出不同的敏感性。一般情況下，芽孢是最具抗性的；原核微生物對壓力的抵抗能力高于真核微生物；革蘭氏陽性菌的抗壓能力高于革蘭氏陰性菌；球菌的抗壓能力強于桿菌[40]。酵母菌和一些霉菌是對HPP處理最敏感的微生物，但是革蘭氏陽性細菌(芽孢桿菌、李斯特菌和金黃色葡萄球菌等)的細胞壁比革蘭氏陰性細菌的細胞壁厚，且可以生成芽孢。芽孢的滅活受到多種內(nèi)外因素的影響(如圖2所示)，若僅考慮壓力因素，一些芽孢甚至能在1 000 MPa的壓力下存活[1]。因此在滅活芽孢時需要根據(jù)實際情況綜合考慮。

圖2 HPP下芽孢失活的非保護性和保護性因素[4]Fig.2 Non protective and protective factors of spore inactivation during high pressure processing

2.3.2 微生物細胞的結(jié)構(gòu)

在HPP條件下，微生物細胞膜被認為是壓力導致微生物失活的主要靶點。如果壓力不能達到使細胞膜遭受不可逆損傷的水平，則微生物可以在施加壓力后使細胞膜恢復完整性；同時，細胞膜的流動性特征也會增加微生物對HPP的抵抗能力[41]?？讜匝┑萚42]發(fā)現(xiàn)500 MPa的超高壓處理引起大腸桿菌O157:H7細胞膜產(chǎn)生顯著損傷，而細胞膜上Ca2+、Mg2+流失以及ATP酶失活是導致大腸桿菌O157:H7死亡的主要原因。HPP導致微生物失活的另一個靶點是核糖體，細胞死亡與否和核糖體完整性是密切相關(guān)的，因為HPP會導致微生物核糖體中的亞單位解離，抑制微生物細胞的活性[43]。此外，核酸具有極強的耐壓性，其結(jié)構(gòu)在高達1 000 MPa的壓力下仍能保持完好[44]。目前關(guān)于核酸在超高壓下處理的文獻較少，但不能忽略其重要性。

2.3.3 微生物濃度

微生物失活率與產(chǎn)品中初始微生物數(shù)量直接相關(guān)。初始微生物數(shù)量越高，處理后的存活率也就越高[31]。EVERT-ARRIAGADA等[12]發(fā)現(xiàn)李斯特菌在較低和較高的接種水平下，經(jīng)500 MPa壓力后分別降低1.5和2 lgCFU/g；在600 MPa下觀察到更好的結(jié)果，低和高接種水平分別達到3.9和4.3 lgCFU/g的滅活。而無害李斯特菌CECT 4031是對壓力敏感的菌株，與接種水平無關(guān)。

2.3.4 生長階段

微生物的生長周期分為延遲期、指數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期4個階段。一般來說，微生物在穩(wěn)定期比指數(shù)期具有更高的抗壓能力。這是因為微生物在指數(shù)期經(jīng)歷了連續(xù)細胞分裂和合成，因此在不利環(huán)境中的耐壓性較低；而處于穩(wěn)定期的微生物具有完整的細胞結(jié)構(gòu)，并受到細胞膜的保護，因此具有更高的抗壓能力[45]。此外，穩(wěn)定生長期的微生物細胞會表達一種替代性σ因子(革蘭氏陽性細胞的σb因子和革蘭氏陰性細胞的σs因子)，這些σ因子控制著與抗應激有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄(如蛋白酶和過氧化氫酶的基因)，這些基因可能在HPP下發(fā)揮作用[40]。因此，處于穩(wěn)定期的微生物對HPP殺菌工藝參數(shù)的建立具有較可靠的參考價值。

3 HPP與其他技術(shù)聯(lián)用對微生物的致死效果

在HPP中，增加壓力通常會增加微生物的致死效果，但需要極高的處理強度，這不僅對食品外觀和質(zhì)地造成了不良影響，還會增加能耗，提高生產(chǎn)成本[41]。此外，芽孢以及高抗性微生物的存在也會影響單獨使用HPP技術(shù)的殺菌效果[46]。根據(jù)跨欄技術(shù)的概念，當使用HPP進行食品滅菌時，應考慮將其與影響微生物生長的不利環(huán)境條件結(jié)合(如低pH值和不適宜微生物生長的溫度)，通過攻擊各種細胞靶點，使細胞修復過程變得更加困難，從而提高其致死率[47]。

HPP聯(lián)合溫度是最常用的處理方法[31]，壓力(400～600 MPa)與輕度熱處理(40 ℃左右)聯(lián)合可使各種致病性和引起腐敗的細菌、酵母菌和霉菌失活；與熱處理(>70℃)聯(lián)合處理能有效滅活芽孢[1]。而HPP結(jié)合其他非熱技術(shù)或添加某些抗菌劑也可以顯著提高殺菌效果：PYATKOVSKY等[10]報道了采用HPP和超聲聯(lián)合處理可觀察到協(xié)同效應；HPP與4%乙酸聯(lián)合對嗜熱鏈球菌(S.thermophilus)生長有很強的抑制作用，在300 MPa處理10 min或500 MPa處理5 min，即可使其在貯藏期間難以恢復生長[48]。此外，將HPP與機械均質(zhì)相結(jié)合的方法，稱為高壓均質(zhì)化(high pressure homogenization,HPH)，通常用于在工業(yè)水平上滅活液態(tài)食品中的各種腐敗微生物。與使用高達600 MPa的HPP相比，HPH在100～350 MPa的壓力范圍內(nèi)工作，可以在極短的時間(<0.5 s)使用高溫(酵母細胞高達50℃，芽孢高達100℃)，以實現(xiàn)微生物的有效滅活[49]。表3列出了近年來HPP與其他技術(shù)聯(lián)合的殺菌效果，從表中可以看出，HPP結(jié)合不同的處理方法可以彌補單獨超高壓處理的缺陷，增強其對微生物的致死或抑制作用。

4 結(jié)論

HPP是一種有前景的非熱處理技術(shù)，其在食品的工業(yè)化生產(chǎn)中具有較大的應用潛力和優(yōu)勢。在實際加工中，HPP的工藝參數(shù)對其殺菌效果至關(guān)重要，而食品基質(zhì)因素和微生物特征在超高壓殺菌過程中的影響亦不可忽視。因為只考慮工藝參數(shù)的HPP處理可能會產(chǎn)生部分亞致死微生物，其在貯藏期間恢復生長；此外，具有較高耐壓性的芽孢會導致所需的壓力負荷升高。這對食品安全和品質(zhì)構(gòu)成了不良的影響。為了使殺菌效果最大化，應進一步研究其特定因素，如優(yōu)化HPP工藝參數(shù)，了解亞致死微生物的保護機制和恢復條件，以確保其充分滅活。最后，HPP與其他殺菌技術(shù)聯(lián)合能在最小處理強度條件下達到最佳殺菌效果，符合“綠色加工理念”，將有助于該領(lǐng)域的進一步發(fā)展。

表3 超高壓柵欄技術(shù)對不同食品樣品中微生物種群的影響Table 3 Combined effects of novel hurdles and high pressure processing on the microbial population in selected media