郭兆斌，馬紀(jì)兵，張麗，陳騁，陳立業(yè)，劉勇，韓玲*，余群力

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730070)2(蘭州中檢科測試技術(shù)有限公司，甘肅 蘭州，730070) 3(甘肅農(nóng)業(yè)工程咨詢設(shè)計所有限公司，甘肅 蘭州，730070)

牦牛是世界上生活在海拔最高處的哺乳動物，主要分布在喜馬拉雅山脈和青藏高原等海拔3 000 m以上的高寒地區(qū)[1]。中國牦牛占世界總數(shù)的90%，其中多數(shù)生長在西藏高原[2-3]。風(fēng)干牦牛肉是通過青藏高原地區(qū)冬季低溫低氣壓的天然氣候條件，將牦牛肉分割成條形后進行自然風(fēng)干所制成的一種富有民族特色的儲藏性高的牦牛肉制品[4-5]。

肉制品在加工、貯藏、運輸過程中極易發(fā)生氧化。氧化可分為脂質(zhì)氧化和蛋白氧化，兩者都具有相似的氧化過程。過度的蛋白氧化會影響蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，從而破壞氨基酸，對肉制品的加工特性和營養(yǎng)價值有不利影響；而脂肪氧化最終產(chǎn)生小分子的醛、酮等有機化合物會影響肉制品的風(fēng)味，產(chǎn)生不愉快氣味，抑制脂肪氧化在一定程度上可以抑制蛋白氧化[6]。牦牛肉及肉制品中含有一些氧化劑成分以及較高的不飽和脂肪酸，因而會使肌原纖維蛋白在生產(chǎn)加工過程中極易發(fā)生氧化[7]。李銀等[8]通過研究在—OH氧化模型下，H2O2濃度對于肌原纖維蛋白中的敏感氨基酸的氧化效應(yīng)，這為進一步揭示肌原纖維蛋白氧化對氨基酸的影響提供了有力依據(jù)。有相關(guān)研究表明,牦牛肉在風(fēng)干加工中部分氨基酸含量會降低，高媛等[9]在研究中表明牦牛肉在風(fēng)干和后續(xù)加工過程中部分氨基酸含量會降低，而這些變化都與肌原纖維蛋白的氧化作用密切相關(guān)，但是對于肌原纖維蛋白氧化對氨基酸影響效果的研究目前鮮有報道。

本試驗采用甘肅省甘南州公牦牛半膜肌為研究對象，分別在風(fēng)干加工過程中的0、2、4、6、8、10、20、30、40 d測定其半膜肌中羰基含量、巰基含量、二酪氨酸含量以及過氧化值(peroxide value,POV)和硫代巴比妥酸值(thiobarbituric acid value，TBA)，并分析傳統(tǒng)風(fēng)干牦牛肉在加工過程中蛋白氧化和脂肪氧化對氨基酸的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗樣品：甘肅甘南公牦牛半膜肌約10 kg。

試劑：三羥甲醛氨基甲烷、KCl、K2HPO4、MgCl2、2,4-二硝基苯肼、乙二醇二乙醚二胺四乙酸，5,5′-二硫帶雙(2-硝基苯甲酸)、疊氮鈉、異硫氰酸胍、溴酚藍、尿素、KH2PO4、NaH2PO4、三氯乙酸、HCl、H2SO4、鉬酸銨、FeSO4(分析純)，天津市致遠化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SP-756P紫外可見分光光度計，上海市美譜達儀器有限公司；L-8800型氨基酸自動分析儀，日本日立公司；HH-2型電熱恒溫水浴鍋，西安省科昊生物工程有限責(zé)任公司；FSH-2A可調(diào)高速勻漿機，江蘇金壇友聯(lián)儀器研究所；TGL-16MC臺式高速冷凍離心機，湖南省湘儀集團；970CRT熒光分光光度計，天美科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的提取

根據(jù)PARK等[10]的研究方法稍作修改，稱取1 g肉樣，加10倍體積標(biāo)準(zhǔn)鹽溶液(20 mmol/L磷酸鉀緩沖液，0.1 mol/L KCl，2 mmol/L EGTA，2 mmol/L MgCl2，pH 6.8)均質(zhì)，4 ℃條件下離心10 min(1 000×g)，棄去上清，沉淀用8倍體積標(biāo)準(zhǔn)鹽溶液溶解后，4 ℃離心10 min(1 000×g)棄上清，重復(fù)2次。沉淀用8倍體積100 mmol/L KCl溶液溶解后，4 ℃離心10 min(1 000×g)棄上清，重復(fù)2次。采用雙縮脲法定量蛋白。

1.3.2 羰基含量的測定

參考OLIVE等[11]的研究方法并做修改，在2.0 mL的離心管中，加入0.1 mL的蛋白溶液與0.5 mL 2,4-二硝基苯肼的HCl溶液，25 ℃下反應(yīng)40 min，空白樣品中不加2,4-二硝基苯肼。然后加入0.5 mL 20%的三氯乙酸，振蕩后離心(11 000×g，5 min)棄上清，沉淀用1 mL乙醇-乙酸乙酯溶液(體積比1∶1)洗滌3次，待溶劑揮發(fā)完后將蛋白質(zhì)懸浮于1 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液中， 37 ℃條件下水浴保溫30 min。以空白溶液為對照，370 nm下測其吸光值，蛋白質(zhì)羰基衍生物的含量(nmol/mg蛋白)用摩爾吸光系數(shù)22 000 L/(mol·cm)進行計算。

1.3.3 巰基含量的測定

參考LIU等[12]的試驗方法測定巰基含量，取0.5 mL、2 mg/mL蛋白液(分散在25 mmol/L磷酸鹽緩沖液中，pH 6.25)中，依次加入2 mL尿素-SDS溶液(含8.0 mol/L尿素，30 g/L SDS，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.4)和0.5 mL 10 mmol/L DTNB試劑(溶解在0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液中，pH 7.4)，在室溫下反應(yīng)15 min后于412 nm處讀數(shù)。0.5 mL 25 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.25)代替蛋白液用于空白對照。摩爾消光系數(shù)為13 600 L/(mol·cm)。

1.3.4 二酪氨酸含量的測定

參考MALENCIK等[13]研究的方法測定二酪氨酸含量，將含有10 mg肌原纖維蛋白的懸浮液溶于3 mL高離子強度緩沖液(0.6 mol/L KCl，pH 6.0，20 mmol/L磷酸緩沖液)中，濾紙過濾除去殘留脂肪和不溶性物質(zhì)。雙縮脲法測定濾液蛋白含量。熒光光度法測定濾液中二酪氨酸含量，測定條件為：發(fā)射波長420 nm(狹縫5 nm)，激發(fā)波長325 nm(狹縫5 nm)。測定結(jié)果用熒光強度除以蛋白濃度，表示為相對熒光值。

1.3.5 過氧化值(POV)的測定

參考GB5009.227—2016中過氧化值的測定方法，稱取2～5 g風(fēng)干肉樣品置于250 mL碘量瓶中，加入50 mL乙酸-異辛烷溶液，勻漿混勻試樣。加入0.5 mL飽和KI溶液，蓋上蓋子搖動1 min，然后在暗處放置3 min左右，取出加入30 mL蒸餾水后立即加入0.5 mL淀粉溶液，滴定至藍色消失，即為終點。同時進行空白試驗。用過氧化物的毫克當(dāng)量數(shù)表示時，結(jié)果根據(jù)公式(1)計算:

(1)

式中：X，過氧化值，g/100 g；V，試樣滴定消耗硫代硫酸鈉溶液的體積,mL；V0,空白滴定消耗硫代硫酸鈉溶液的體積,mL；C,硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度,mol/L；m,試樣的質(zhì)量g；1 000,換算系數(shù)。

1.3.6 硫代巴比妥酸值(TBA)的測定

使用JUNCHER等[14]的方法，準(zhǔn)確稱取樣品5.00 g，與25 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%(含質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.1% EDTA)三氯乙酸溶液和20 mL冷凍去離子水混合，均質(zhì)60 s，并在25 ℃的室溫下靜置20 min。然后將混合物離心10 min(6 000×g)，并用去離子水將上清液稀釋至50 mL。最后，取稀釋的上清液5 mL與0.02 mol/L 2-硫代巴比妥酸5 mL混合，并在95 ℃的水浴中保持20 min。通過流動的水將反應(yīng)溶液冷卻至室溫后，在532 nm下測量吸光度并用去離子水作為空白對照。計算TBA如公式(2)：

TBA=A532×7.8

(2)

式中：A532，通過1.0 cm比色皿在532 nm處的吸光度。

1.3.7 氨基酸分析

參考國家標(biāo)準(zhǔn)《食品中氨基酸的測定》(GB5009.124—2016)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)均平行測定3次，用SPSS 22.0軟件進行方差分析，用Origin 2018軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 羰基含量變化

圖1為風(fēng)干牦牛肉加工過程中羰基含量變化，羰基是蛋白發(fā)生氧化的標(biāo)志性產(chǎn)物。由圖1可知，羰基化合物含量隨風(fēng)干時間的延長呈逐漸上升的趨勢。原料肉中羰基含量為2.63 nmol/mg，風(fēng)干到40 d時達到8.16 nmol/mg，羰基含量增加了5.53 nmol/mg，風(fēng)干30 d時含量顯著低于風(fēng)干40 d時羰基含量(P<0.05)，0～30 d含量顯著低于40 d(P<0.05)。羰基是氨基酸發(fā)生氧化后的產(chǎn)物，它的產(chǎn)物的形成主要來自賴氨酸、脯氨酸、精氨酸等的直接氧化，并且其含量可作為評價蛋白質(zhì)發(fā)生氧化程度的重要指標(biāo)之一[15]。肌肉蛋白的氧化是一種具有非酶促的不可逆的蛋白化學(xué)修飾作用，這種修飾作用涉及到羰基基團的形成，羰基基團是在氧應(yīng)激作用下所形成的一種基團[16]。羰基化合物的生成說明肌原纖維蛋白氧化程度的加劇，即羰基含量越高，肌原纖維蛋白氧化越劇烈[17]。

圖1 風(fēng)干牦牛肉加工過程中羰基含量變化Fig.1 Changes of carbonyl content in air-dried yakmeat processing注：圖中不同小寫表示差異顯著。下同。

2.2 巰基含量變化

肌原纖維蛋白巰基易被氧化而產(chǎn)生損失，巰基含量將會越低，氧化作用的程度越高。牦牛肉在自然冷凍風(fēng)干過程中的巰基含量變化如圖2所示。由圖2可知，隨著風(fēng)干時間的延長，巰基含量呈現(xiàn)出下降的趨勢，牦牛原料肉中巰基含量為71.03 nmol/mg，當(dāng)風(fēng)干到40 d時達到30.15 nmol/mg，含量降低了40.88 nmol/mg，風(fēng)干20 d時巰基含量顯著高于(P<0.05)40 d時巰基含量，0～20 d極顯著高于(P<0.01)40 d 時的巰基含量。肌原纖維蛋白中有大量的自由巰基，尤其在肌球蛋白中，每一個肌球蛋白大約含有40個巰基，由于牦牛肉風(fēng)干加工過程中肌原纖維蛋白的空間結(jié)構(gòu)可能發(fā)生了一定的改變，從而導(dǎo)致分子內(nèi)部的巰基暴露被氧化為二硫鍵，因此巰基含量降低[18]。故巰基含量的降低極有可能是因為肌原纖維蛋白中形成了多肽分子之間或內(nèi)部的二硫鍵，進而導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)表面的巰基含量下降[19]。因此巰基含量的下降表明肌原纖維蛋白氧化加快，巰基含量越低，肌原纖維蛋白氧化程度越高[20]。

圖2 風(fēng)干牦牛肉加工過程中巰基含量變化Fig.2 Changes of sulfhydryl group content inair-dried yak meat processing

2.3 二酪氨酸含量的變化

二酪氨酸含量可用相對熒光值(A.U.)來表示。風(fēng)干牦牛肉加工過程中二酪氨酸含量變化情況如圖3所示。由圖3可知，隨冷凍風(fēng)干加工過程中時間的延長，二酪氨酸含量的A.U.值呈上升趨勢，在風(fēng)干加工0 d時，其A.U.值為28.9，至40 d時達到49.1，增加了20.2。在整個風(fēng)干加工過程0～40 d，二酪氨酸相對熒光值(A.U.)變化顯著(P<0.05)。酪氨酸是容易受活性氧自由基攻擊的敏感性氨基酸之一，而二酪氨酸是在其氧化之后的產(chǎn)物，故二酪氨酸的含量也可作為衡量蛋白質(zhì)發(fā)生氧化程度的重要指標(biāo)之一，即二酪氨酸含量越高，肌原纖維蛋白氧化程度越高[21]。

圖3 風(fēng)干牦牛肉加工過程中二酪氨酸含量變化Fig.3 Changes of dityrosine content in air-driedyak meat processing

2.4 POV值的變化

POV值反映脂質(zhì)發(fā)生一級氧化的程度，主要是脂肪降解產(chǎn)生的不飽和脂肪酸中的雙鍵與環(huán)境中的氧氣發(fā)生氧化反應(yīng)形成的一種中間氧化產(chǎn)物[22]。風(fēng)干牦牛肉加工過程中POV值變化情況如圖4所示，由圖4可知，隨風(fēng)干加工時間的延長，POV值呈上升趨勢，在風(fēng)干0 d時，其值為1.16 mmol/kg，至40 d時達到1.85 mmol/kg，增加了0.69 mmol/kg。在風(fēng)干0～6 d，POV值變化顯著(P<0.05)且呈上升趨勢；在6～10 d變化不顯著，且6～10 d的POV值顯著低于20～40 d的(P<0.05)POV值。整個風(fēng)干過程POV值呈上升趨勢，過氧化值顯著增加，說明氫過氧化物的生成速率大于脂肪酸的生成速率，脂肪氧化程度進一步加深。但是風(fēng)干的各階段差異顯著，原因可能是牦牛肉風(fēng)干成熟期間積累氫過氧化物，隨著風(fēng)干時間生成醛、酸、酮等物質(zhì)導(dǎo)致過氧化物的增多或者減少。

圖4 風(fēng)干牦牛肉加工過程中POV值的變化Fig.4 Changes of POV content in air-dried yakmeat processing

2.5 TBA值的變化

TBA反映脂肪發(fā)生二級氧化的程度。風(fēng)干牦牛肉加工過程中TBA值變化情況如圖5所示。由圖5可知，隨風(fēng)干時間的延長，TBA值呈上升趨勢，在風(fēng)干0 d時，其值為0.20 mg/kg，至40 d時達到0.69 mg/kg，增加了0.49 mmol/kg。風(fēng)干前期(0～8 d)變化不顯著，第8天值為0.29 mg/kg，僅比0 d時高出0.09 mg/kg；風(fēng)干后期(8～40 d)TBA值呈顯著上升趨勢(P<0.05)，40 d的值比8 d時高出0.40 mg/kg。風(fēng)干肉中脂類物質(zhì)在貯藏期會水解生成游離脂肪酸，在脂肪氧化酶的作用下氧化為氫過氧化物，然后進一步分解為醛、酮等小分子終產(chǎn)物，此過程其主要產(chǎn)物為丙二醛，結(jié)果表明隨著風(fēng)干時間的延長，能促進丙二醛等次級氧化產(chǎn)物的生成，進而導(dǎo)致肌原纖維蛋白的氧化[23]。木卡代斯·木合旦爾等[24]發(fā)現(xiàn)羊火腿風(fēng)干成熟期間丙二醛含量先快速上升后緩慢上升、羰基含量也呈先急劇上升后緩慢上升的趨勢，與本文風(fēng)干牦牛肉得出的結(jié)論相似。風(fēng)干初期差異不顯著的原因可能是不穩(wěn)定的丙二醛被降解成揮發(fā)性化合物或與蛋白質(zhì)的游離氨基酸進行反應(yīng)。

圖5 風(fēng)干牦牛肉加工過程中TBA值的變化Fig.5 Changes of TBA content in air-driedyak meat processing

2.6 氨基酸分析

由表1可知，風(fēng)干牦牛肉共檢測出水解性氨基酸17種，大多數(shù)氨基酸的含量均隨肌原纖維蛋白氧化加劇而呈現(xiàn)輕微下降趨勢，氨基酸總量也隨之下降，風(fēng)干牦牛肉中的氨基酸總量為38.86 g/100 g，原料肉為42.12 g/100 g，即風(fēng)干牦牛肉氨基酸含量比原料肉低3.26 g/100 g，纈氨酸、蘇氨酸、組氨酸、精氨酸、天冬氨酸及絲氨酸對氧化作用不敏感，氧化前后其含量變化不顯著。而半胱氨酸、酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸及苯丙氨酸對氧化作用敏感，隨氧化時間延長，6種敏感氨基酸呈顯著下降趨勢，當(dāng)氧化時間達到40 d時，半胱氨酸、酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸及苯丙氨酸的含量分別下降了51.2%、33.1%、18.9%、16.3%、47.9%和0.05%。異亮氨酸、谷氨酸、脯氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸是風(fēng)干牦牛肉中的主要鮮味氨基酸，它們的總量為18.99 g/100 g，這6種氨基酸是形成肉品香味物質(zhì)所必需的前體氨基酸，它們與形成肉制品的風(fēng)味有密切的關(guān)系，6種氨基酸中谷氨酸的含量是最高的，為6.58 g/100 g，約占鮮味氨基酸總量的34.65%，具有形成肉鮮味的作用和緩沖酸與咸等味道的特殊功能。風(fēng)干牦牛肉中的組氨酸含量為1.30 g/100 g，而原料肉中的含量是1.27 g/100 g，即表示風(fēng)干牦牛肉組氨酸含量比原料肉高出0.03 g/100 g，組氨酸是尿毒癥患者的必需氨基酸，對嬰幼兒來說也是必需氨基酸，同時，組氨酸會在脫羧之后形成組胺，具有很強的舒張血管的效果[25]。

牦牛肉在風(fēng)干加工過程中，隨著風(fēng)干時間的延長，羰基含量的上升，巰基含量的下降以及二酪氨酸含量的升高均表明肌原纖維蛋白發(fā)生了一定程度上的氧化，而蛋白發(fā)生氧化通常引起的變化是氨基酸的破壞，肽鏈的伸展斷裂以及蛋白交聯(lián)，從而導(dǎo)致肌原纖維蛋白功能性及理化性質(zhì)的改變[26]。雖然氨基酸側(cè)鏈容易遭受自由基與非自由基攻擊，并且氨基酸側(cè)鏈氧化會形成羰基化合物，但是不同的氨基酸對自由基有不同的靈敏性，比如蘇氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、亮氨酸及谷氨酸等氨基酸殘基通常會成為經(jīng)脂氧化產(chǎn)生的自由基攻擊的目標(biāo)[27]。這正好說明了這幾種氨基酸對氧化作用的敏感性更強。所以蛋白氧化會降低總氨基酸及必需氨基酸含量，同時，幾乎絕大多數(shù)氨基酸的含量都有不同程度的下降[28]。本試驗研究表明，半胱氨酸、酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸及苯丙氨酸對氧化作用非常敏感，纈氨酸、蘇氨酸、組氨酸、精氨酸、天冬氨酸及絲氨酸對氧化作用不敏感，氧化前后其含量變化不顯著。

表1 風(fēng)干牦牛肉加工過程中氨基酸含量變化Table 1 Changes of amino acid content in air-dried yak meat processing

注：表中不同小寫字母表示差異顯著。

2.7 各氧化指標(biāo)與氨基酸相關(guān)性分析

由表2可知，酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸含量與羰基、二酪氨酸、POV值、TBA值均呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與巰基含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)；異亮氨酸含量與POV值及TBA值呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與羰基及二酪氨酸含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與巰基含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)；蛋氨酸與羰基及二酪氨酸含量均呈正相關(guān)，與巰基含量、POV值、TBA值呈負(fù)相關(guān)，不具有顯著性差異；半胱氨酸含量與POV值及TBA值呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與羰基、二酪氨酸、巰基含量不具有顯著性差異；POV值、TBA值與羰基及二酪氨酸含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與巰基含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。綜上所述，風(fēng)干肉加工過程中肌原纖維蛋白氧化主要是由于脂肪氧化所引起的，亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸對2種氧化作用最為敏感。

表2 各氧化指標(biāo)與氨基酸相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of oxidation indexes and amino acids

注：“*”表示相關(guān)性顯著(P<0.05);“**”表示相關(guān)性極顯著(P<0.01)。

3 結(jié)論

風(fēng)干牦牛肉在加工過程中，肌原纖維蛋白中羰基和二酪氨酸的含量顯著增加，巰基含量顯著降低；POV值和TBA值均呈現(xiàn)不斷上升的趨勢，表明風(fēng)干牦牛肉肌原纖維蛋白在風(fēng)干過程中蛋白氧化加劇。隨著肌原纖維蛋白氧化和脂肪氧化加劇，風(fēng)干牦牛肉中必需氨基酸含量均低于原料肉，風(fēng)干牦牛肉非必需氨基酸中組氨酸、精氨酸、脯氨酸、谷氨酸及甘氨酸含量均高于原料肉。酪氨酸、亮氨酸及苯丙氨酸對氧化作用非常敏感；纈氨酸、蘇氨酸、組氨酸、精氨酸、天冬氨酸及絲氨酸對氧化作用不敏感，氧化前后其含量變化不顯著。