孟帥帥 黃欽耿 吳松剛 劉峰

（福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 工業(yè)微生物教育部工程研究中心，福州 350117）

L-色氨酸（L-Trp）作為人和動(dòng)物體所必需的3種芳香族氨基酸之一，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、飼料和化工領(lǐng)域［1-2］。L-Trp 的生產(chǎn)方法主要包括化學(xué)合成法、轉(zhuǎn)化法及微生物發(fā)酵法。由于化學(xué)合成法和轉(zhuǎn)化法存在工藝復(fù)雜、副產(chǎn)物多、得率較低及成本較為昂貴等缺點(diǎn)，如今通常采用微生物直接發(fā)酵法來(lái)實(shí)現(xiàn)L-Trp 的生產(chǎn)。大腸桿菌作為氨基酸發(fā)酵的重要平臺(tái)微生物，在氨基酸發(fā)酵工業(yè)中有著極其重要的地位。大腸桿菌細(xì)胞可直接利用葡萄糖合成L-色氨酸，從葡萄糖出發(fā)，經(jīng)過碳中心代謝過程，包括各種磷酸化系統(tǒng)（Phosphotransferase system，PTS）、糖酵解過程（Embden meyerhof parnas，EMP）以及磷酸戊糖途徑（Hexose monophosphate pathway，HMP），合成L-色氨酸的前體物磷酸烯醇式丙酮酸（Phosphoenolpyruvate，PEP）和4-磷酸-赤蘚糖（4-phosphate-D-erythrose，E4P），之后經(jīng)過芳香族氨基酸共有的7 步莽草酸途徑合成分支酸，最后由分支酸經(jīng)芳香族氨基酸的分支代謝途徑合成L-色氨酸［3-4］。其中，丙酮酸不僅作為色氨酸合成重要的前體物，同時(shí)也是細(xì)胞合成L-丙氨酸的直接供體。在發(fā)酵過程中L-丙氨酸大量合成，丙酮酸的消耗勢(shì)必增加，使得前體物DAHP 的合成較少，L-色氨酸的積累也受到影響。

微生物體內(nèi)L-丙氨酸的生物合成是比較容易實(shí)現(xiàn)的，其含量也較為豐富［5-6］。但是，在氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)中L-丙氨酸的大量合成不僅會(huì)造成碳源的過度消耗，過量的積累還會(huì)對(duì)發(fā)酵液中目標(biāo)產(chǎn)物的純化以及回收帶來(lái)困難［7-8］。大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌都是產(chǎn)L-Trp 的代表性微生物。在谷氨酸棒桿菌中，研究人員通過敲除合成L-丙氨酸的關(guān)鍵酶來(lái)提高L-纈氨酸以及L-絲氨酸等氨基酸的產(chǎn)量［7-9］。Marienhagen 等［7］分析了谷氨酸棒桿菌中與L-丙氨酸合成相關(guān)的兩種轉(zhuǎn)氨酶：AlaT 和AvtA，通過敲除活性最高的轉(zhuǎn)氨酶AlaT 來(lái)減少L-丙氨酸的含量以及增加L-纈氨酸在胞外的積累。但與谷氨酸棒桿菌相比，大腸桿菌在L-丙氨酸的合成過程中具有更復(fù)雜的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶，不僅包括已被鑒定的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶AlaA、AlaC 和纈氨酸-丙酮酸氨基轉(zhuǎn)移酶AvtA 在內(nèi)最主要的3 種丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶，還包括另外8 種潛在的轉(zhuǎn)氨酶可能合成L-丙氨酸［10-12］。目前在大腸桿菌中還鮮見L-丙氨酸合成調(diào)控下的L-色氨酸的相關(guān)研究。

本研究以大腸桿菌E. coliFS-T0 為出發(fā)菌，利用Red 重組技術(shù)分別修飾不同丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因，構(gòu)建系列L-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶突變工程菌株，并探究各基因修飾后各工程菌在細(xì)胞生長(zhǎng)、L-丙氨酸含量以及L-色氨酸產(chǎn)量等方面的差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌E. coliFS-T0 由實(shí)驗(yàn)室前期通過代謝工程手段及多輪化學(xué)誘變獲得的多類芳香族氨酸類似物抗性（5-甲基色氨酸、5-氟色氨酸和對(duì)氟苯丙氨酸抗性）的高產(chǎn)L-色氨酸工程菌株。本研究基因修飾所用質(zhì)粒pKD46、pKD13 和pCP20由工業(yè)微生物教育部工程研究中心保藏，具體菌株見表1。

表1 本實(shí)驗(yàn)使用的菌株

1.1.2 引物 根據(jù)GenBank 中大腸桿菌E. colistr.K-12 substr. MG1655 的 基 因alaA、alaC和avtA序列信息，利用Red 重組的方法敲除菌株E. coliFS基因組中alaA、alaC和avtA基因，分別設(shè)計(jì)含同源臂序列的敲除引物，設(shè)計(jì)如下（下劃線部分為目的基因序列，其余為同源臂序列）：F1-（5′-AT GTCCCCCATTGAAAAATCCAGCAAATTAGAGAAT GTCGTGTAGGCTG GAGCTGCTTC-3′），R1-（5′-TT ACAGCTGATGATAACCAGAAAGGAAACGCGCG AACT TCTGTCAAACATGAGAATTAA-3′）、F2-（5′-ATGGCTGACACTCGCCCTGAACGTCGCT TTA CGCGCATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′），R2-（5′-AGCGAACATGCGTATCAC CATAGTCGCCAAAG CCAATCCCTGTCAAACATGAGAATTAA-3′）以及F3-（5′-ATGACA TTCTCCCTTTTTGGTGACAAATTTACCCGCCACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′），R3-（5′-TTAGTGACTTTCAGCCCAGGCTCTTTCTATCTC TTCCGCCTGTCAAACATGAGAAT TAA-3′）。同 時(shí) 設(shè)計(jì)鑒定引物如下：F1-F-（5′-ATGTCCCCCATTGAAAAATCCAGC-3′），R1-R-（5′-TTACAGCTGATGATAACCAGAAAGG-3′）、F2-F-（5′-TAAACCGTCGGCACG GAACATCGC-3′），R2-R-（5′-TTAGCTACGGCTGA GCACGC-3′）以及F3-F-（5′-ATGAC ATTCTCCCTTT TTGG-3′），R3-R-（5′-TTAGTGACTTTCAGCCCA GG-3′）。

1.1.3 主要試劑和儀器 PrimeStar DNA 聚合酶和PCR 試劑：TaKaRa 寶生物公司產(chǎn)品；引物合成、質(zhì)粒小量提取試劑盒、sanPreP 柱式膠回收DNA 試劑盒、胰蛋白胨和酵母粉，瓊脂糖，L-阿拉伯糖等：生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純級(jí)別。

電轉(zhuǎn)儀：Eppendorf 2510，艾本德中國(guó)有限公司；PCR 儀：ABI 產(chǎn)品；高效液相色譜儀：LC-2030C，島津中國(guó)；紫外分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 LB 培養(yǎng)基（g/L）：酵母粉 5，胰蛋白胨10，NaCl 10，瓊脂粉 20。

SOC 培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 20，酵母粉 5，葡萄糖 3.9，NaCl 0.58，KCl 0.185，MgCl20.95。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，酵母浸膏11，L-苯丙氨酸0.75，L-酪氨酸0.60，硫酸銨3，檸檬酸鈉0.25，硫酸鎂3，磷酸氫二鉀0.65，磷酸二氫鉀0.35，七水硫酸亞鐵0.02，氯化鎂0.05。

上述培養(yǎng)基pH 值均需調(diào)至7.0，篩選所需的卡那霉素和氨芐青霉素終濃度為50 μg/mL 和100 μg/mL。

1.2 方法

1.2.1 PCR 片段的制備 以質(zhì)粒pKD13 為模板、含同源臂的序列為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性 1 min；94℃變性 40 s，57℃退火 1 min，72℃延伸 1.5 min，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10 min，之后用DpnI 酶對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行處理，膠回收后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.2 含pKD46 電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備 將含有pKD46 質(zhì)粒的菌株接種于終濃度為100 μg/mL 的氨芐青霉素LB 培養(yǎng)基中，30℃過夜培養(yǎng)。取0.5 mL至含50 mL LB 培養(yǎng)基中（含100 μg/mL 的氨芐青霉素），30℃，250 r/min 培養(yǎng)至OD600=0.15-0.2，加入終濃度為10 mmol/L 的L-阿拉伯糖誘導(dǎo)劑。待細(xì)胞OD600在0.7 左右時(shí)，菌液于4℃預(yù)冷30 min，6000 r/min 離心10 min，棄上清。之后用預(yù)冷的10%的甘油重懸離心洗滌2 次。收集后的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)或者-80℃保存。

1.2.3 電轉(zhuǎn)化 取上述PCR 產(chǎn)物10 μL 加至感受態(tài)細(xì)胞中，混合后加至電轉(zhuǎn)杯，于1800 V，25 μF，200 Ω 條件下進(jìn)行點(diǎn)擊。電擊后迅速加入800 μL 的SOC 培養(yǎng)基，37℃，100 r/min 培養(yǎng)約1.5 h 后取200 μL 涂布于含卡那霉素抗性的平板上，篩選含卡那霉素重組子的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。

1.2.4 抗性基因及pCP20 質(zhì)粒的消除 將pCP20 質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入含卡那霉素抗性的重組子中，30℃復(fù)蘇1.5 h 后，涂布于含氨芐青霉霉素的平板上，30℃培養(yǎng)。使用驗(yàn)證引物篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，之后將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種于LB 培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)3 h 后42℃過夜培養(yǎng)，取少許菌液劃線分離并對(duì)單菌落就行抗性檢測(cè)，從而得到已消除pCP20 的重組菌株。

1.2.5 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 種子培養(yǎng)：在冷凍管中分別取少許出發(fā)菌株和改造后菌株接種于LB 斜面中，培養(yǎng)約15 h 后，用無(wú)菌生理鹽水洗下接種于裝有50 mL 種子培養(yǎng)液的500 mL 三角瓶中，35℃，250 r/min培養(yǎng)12 h。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：將上述培養(yǎng)好的種子液以10%的接種量接種于含30 mL 的發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL 的三角瓶中，37℃，250 r/min 培養(yǎng)約40 h。

1.2.650 L 罐補(bǔ)料分批發(fā)酵 種子罐培養(yǎng)工藝：將1.2.5 中培養(yǎng)好的種子液以0.5%的接種量接種于裝有10 L 發(fā)酵培養(yǎng)基的30 L 的種子罐中，罐溫35℃，初攪拌300 r/min，溶氧（DO）自然下降后通過攪拌控制在20%-50%，OD600≥10（約13 h），移種。

發(fā)酵罐培養(yǎng)工藝：以20%的移種量將上述種子罐中的種子液轉(zhuǎn)入含有25 L 發(fā)酵培養(yǎng)基的50 L 發(fā)酵罐中，初攪拌300 r/min，通氣比為1∶0.8，生物量（OD600）在10 之前罐溫控制在35℃（大約6 h），之后升溫至37℃培養(yǎng)，全過程通過流加25%的氨水控制pH 在7.0 左右，調(diào)節(jié)攪拌控制溶氧在15%-35%，并在發(fā)酵過程中流加70%的葡萄糖維持發(fā)酵液中葡萄糖濃度在5.0-10.0 g/L。發(fā)酵過程中每隔2 h 取樣檢測(cè)殘?zhí)羌熬w生物量。發(fā)酵結(jié)束前2 h 停止流加葡萄糖，整個(gè)發(fā)酵周期約50 h。

1.2.7 發(fā)酵產(chǎn)物檢測(cè)分析 利用分光光度計(jì)在600 nm 下測(cè)定菌體濃度；SBA-40D 生物傳感分析儀測(cè)定葡萄糖的含量；氨基酸的含量采用HPLC 法測(cè)定［13-14］。

2 結(jié)果

2.1 alaA、alaC和avtA基因缺失株的構(gòu)建

利用Red 重組技術(shù)，以pKD13 質(zhì)粒為模板含同源臂的序列為引物，分別擴(kuò)增出與alaA、alaC和avtA基因同源、中間為卡那霉素抗性且在卡那霉素兩端含F(xiàn)RT 位點(diǎn)的片段。轉(zhuǎn)化后使用驗(yàn)證引物及測(cè)序的方法驗(yàn)證其與目標(biāo)長(zhǎng)度一致，篩選轉(zhuǎn)化后的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。

pCP20 屬溫度敏感型質(zhì)粒，具有氯霉素和氨芐青霉素抗性，同時(shí)在30℃下可產(chǎn)生翻轉(zhuǎn)酶重組酶FLP，F(xiàn)LP 重組酶可與FRT 位點(diǎn)結(jié)合，在FLP 重組酶的作用下FRT 位點(diǎn)自身發(fā)生同源重組，從而消除抗性基因及一個(gè)FRT 位點(diǎn)，在溫度升至42℃時(shí)pCP20 質(zhì)粒自行丟失。pCP20 質(zhì)粒消除抗性基因及其丟失后使用驗(yàn)證引物及測(cè)序結(jié)果篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，結(jié)果經(jīng)DNAMAN 軟件比對(duì)后與實(shí)際序列一致，表明已經(jīng)對(duì)E. coliFS 的alaA、alaC和avtA各基因成功敲除，敲除后菌落PCR 結(jié)果如圖1。

2.2 搖瓶發(fā)酵過程中各組分變化情況

為了驗(yàn)證各丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶的修飾對(duì)工程菌生產(chǎn)L-色氨酸的影響，對(duì)出發(fā)菌株及各修飾后的工程菌進(jìn)行搖瓶初步實(shí)驗(yàn)。利用高效液相色譜以及分光光度計(jì)等方法對(duì)各工程菌中各組分變化情況進(jìn)行比較分析。

結(jié)果（表2）顯示，從最大生物量來(lái)看，除3種丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶全部缺失的工程菌E. coliFS-T7 的生長(zhǎng)受到較強(qiáng)抑制外，其它各工程菌株與出發(fā)菌株的細(xì)胞濃度基本一致，說(shuō)明單獨(dú)或任意兩種丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶的缺失對(duì)于菌體的正常生長(zhǎng)代謝不會(huì)造成明顯影響；在L-丙氨酸的積累和L-色氨酸的合成方面，各丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶缺失工程菌相比于出發(fā)菌株L-丙氨酸的積累均有所降低、L-色氨酸的合成均有所提高，其中L-丙氨酸的積累中工程菌E. coliFS-T4 和E.coliFS-T7 最為明顯，分別減少了91.0%和97.2%，而對(duì)于L-色氨酸的合成工程菌E. coliFS-T4 產(chǎn)量最高，可達(dá)6.08 g/L，相比于原始菌提高了26.7%，而L-丙氨酸積累最少的E. coliFS-T7 工程菌僅能合成5.36 g/L 的色氨酸。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲除AlaA 和AlaC 兩種L-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶對(duì)工程菌株的生長(zhǎng)和發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸最為有利。

圖1 alaA、alaC 和avtA 各基因敲除后菌落PCR 結(jié)果

表2 各基因敲除菌搖瓶發(fā)酵性能比較

2.3 工程菌E. coli FS-T4 50L罐的補(bǔ)料分批發(fā)酵

從搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果得知，所修飾的各工程菌中，缺失AlaA 和AlaC 的兩種L-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶的工程菌E. coliFS-T4 的產(chǎn)色氨酸能力最高。因此，為了檢驗(yàn)其在高密度發(fā)酵中的產(chǎn)酸能力，以出發(fā)菌株E.coliFS-T0 為對(duì)照，在50 L 罐中對(duì)菌株E. coliFS-T4進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵過程代謝曲線見圖2。工程菌株E. coliFS-T4 最高可積累L-色氨酸41.9 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率可達(dá)20.5%，分別較出發(fā)菌株提高了13.8%和5.1%。在細(xì)胞生長(zhǎng)和耗糖方面，發(fā)酵0-6 h，溫度控制在35℃，出發(fā)菌株與丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶缺失工程菌均處于發(fā)酵環(huán)境適應(yīng)期，細(xì)胞增長(zhǎng)較慢，但耗糖速率有一定差別，工程菌E. coliFS-T4 的耗糖速率明顯更高；發(fā)酵6 h 后，溫度升至37℃，二者工程菌均進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌株E. coliFS-T4 在發(fā)酵12 h 時(shí)開始進(jìn)行補(bǔ)糖，32 h 時(shí)菌濃達(dá)到最大值，最大菌濃OD 可達(dá)90.2，相比于出發(fā)菌株工程菌E.coliFS-T4 補(bǔ)糖時(shí)間和菌株生長(zhǎng)至最大菌濃時(shí)間均提前了4 h，最大菌濃也與出發(fā)菌株基本一致，說(shuō)明AlaA 和AlaC 兩丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶的缺失對(duì)菌株的正常代謝生長(zhǎng)并未有明顯影響。在L-色氨酸生產(chǎn)方面，0-16 h，酸值較低，二者產(chǎn)酸基本一致；發(fā)酵16 h 后，工程菌E. coliFS-T4 L-色氨酸的積累速率明顯加快，在46 h 時(shí)產(chǎn)酸達(dá)到最高值，相比于出發(fā)菌株達(dá)到最大酸值提前了2 h，隨著發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)行，二者工程菌L-色氨酸的積累量分別在48 h 和50 h 時(shí)降低，因此，發(fā)酵在50 h 終止。

圖2 E. coli FS-T4 工程菌株在50 L 罐中的補(bǔ)料分批發(fā)酵

3 討論

關(guān)于與L-丙氨酸合成途徑相關(guān)的轉(zhuǎn)氨酶及其敲除后對(duì)其它產(chǎn)物的影響已經(jīng)在谷氨酸棒桿菌中取得一定的研究進(jìn)展［9，15］。在谷氨酸棒桿菌中，合成L-丙氨酸的轉(zhuǎn)氨酶為AlaT 和AvtA。Marienhagen 等［7］分析了谷氨酸棒桿菌中與L-丙氨酸合成相關(guān)的轉(zhuǎn)氨酶在酶學(xué)和細(xì)胞水平及對(duì)產(chǎn)物形成等方面產(chǎn)生的差異，敲除活性最高的轉(zhuǎn)氨酶AlaT 使得胞外L-丙氨酸的積累量減少了80%，同時(shí)增加了L-纈氨酸的產(chǎn)量。Zhu 等［8］對(duì)谷氨酸棒桿菌的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶全部敲除并引入乙酰羥酸合成酶的減毒突變體，獲得了一株高產(chǎn)的L-絲氨酸生產(chǎn)菌株且副產(chǎn)物L(fēng)-丙氨酸和L-纈氨酸的積累分別降低了87%和60%。盡管在谷氨酸棒桿菌中已經(jīng)證實(shí)，減少L-丙氨酸的合成能夠增加諸如L-纈氨酸、L-絲氨酸等氨基酸的合成，但與谷氨酸棒桿菌不同的是大腸桿菌具有更復(fù)雜的L-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶酶系［8，10］。在谷氨酸棒桿菌中，谷氨酸棒桿菌缺失某一種（如AlaT）或缺失全部的L-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶都可以獲得L-丙氨酸含量大幅減少及目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量明顯提高的工程菌株。而與谷氨酸棒桿菌相比，大腸桿菌在缺失任意一種甚至兩種（除缺失ΔAlaAΔAlaC 外）的L-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶所獲得的工程菌在L-丙氨酸含量及目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量方面并沒有顯著變化。盡管L-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶AlaA、AlaC 和AvtA 全部缺失的菌株E. coliFS-T7 發(fā)酵過程中L-丙氨酸含量最低，但其在目標(biāo)產(chǎn)物L(fēng)-色氨酸的產(chǎn)量方面卻表現(xiàn)平平。因此，在大腸桿菌中還鮮見L-丙氨酸合成調(diào)控下的L-色氨酸的相關(guān)研究。

目前已經(jīng)證實(shí)負(fù)責(zé)L-丙氨酸合成的3 種最主要的L-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶分別是AlaA、AlaC 和AvtA，盡管這些酶在任意一種存在的情況下都能實(shí)現(xiàn)最佳生長(zhǎng)，但AvtA 與另外兩種酶的活性卻存在顯著差異，其中AlaA 和AlaC 具有更高的通向L-丙氨酸合成的通量效率且二者活性的總和占據(jù)了大腸桿菌中總的L-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性的90%，缺失其中任何一種的情況下都能夠促進(jìn)另外一種酶的表達(dá)［5，10］。因此，由于AlaA 和AlaC 二者L-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶的互補(bǔ)作用，在單獨(dú)敲除其中任何一種時(shí)，L-丙氨酸含量并不會(huì)大幅降低。Kim 等［10］研究發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌體內(nèi)當(dāng)以丙酮酸作為碳源時(shí)可能還會(huì)存在其它幾種轉(zhuǎn)氨酶可以促進(jìn)L-丙氨酸的合成。本實(shí)驗(yàn)搖瓶結(jié)果也驗(yàn)證了這一點(diǎn)，在3 種酶全部缺失的情況下，盡管菌體生長(zhǎng)明顯受到影響且其最大生物量與親本菌株相比大幅下降，但還會(huì)有少量的L-丙氨酸產(chǎn)生（約占3%）。然而盡管如此，搖瓶結(jié)果也表明在缺乏這3種最主要的轉(zhuǎn)氨酶的情況下，工程菌的生長(zhǎng)明顯受到了抑制，其最大生物量也僅為親本菌株一半。因此，AlaA、AlaC 和AvtA 三種酶的存在一起賦予了大腸桿菌L-丙氨酸合成的靈活性。即使對(duì)于AvtA 來(lái)說(shuō)，在大腸桿菌體內(nèi)表現(xiàn)出很低的L-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性且僅能夠積累少量的L-丙氨酸，但相對(duì)于3 種酶全部缺失而表現(xiàn)出巨大生長(zhǎng)缺陷，單獨(dú)存在的AvtA 也能保證與親本菌株相比相似的生長(zhǎng)速率和生物量。

氨基酸穩(wěn)態(tài)維持并調(diào)節(jié)細(xì)菌微生物群中細(xì)胞氨基酸庫(kù)的平衡，丙氨酸通過可逆轉(zhuǎn)氨反應(yīng)的途徑，從而連接關(guān)鍵的代謝網(wǎng)絡(luò)，如發(fā)酵（通過丙酮酸）和氮代謝（通過天冬氨酸和谷氨酸）［5-6，16-17］。在大腸桿菌體內(nèi)合成L-丙氨酸的前體物是丙酮酸，同時(shí)也是細(xì)胞合成L-丙氨酸的直接供體。在發(fā)酵過程中L-丙氨酸的大量合成，丙酮酸的消耗勢(shì)必增加，使得前體物DAHP 的合成較少，L-色氨酸的積累也受到影響。因此，為了保證大腸桿菌工程菌正常生理代謝且最大化降低L-丙氨酸的積累，敲除AlaA 和AlaC 兩種L-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶，僅保留AvtA 一種酶。當(dāng)AlaA 和AlaC 兩種酶被同時(shí)敲除后，與親本菌株相比，被修飾后的工程菌在保持其正常生長(zhǎng)代謝不變的情況下，L-丙氨酸的濃度大幅降低且L-色氨酸含量明顯提高，表明L-丙氨酸的合成碳流被重新定向形成L-色氨酸。

本研究成功構(gòu)建了兩種L-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶AlaA和AlaC 缺失的工程菌株E. coliFS-T4，該工程菌并非L-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶完全缺失型菌株，因此不需要額外添加L-丙氨酸就能保證菌株的正常生長(zhǎng)代謝且一定程度地提高了目標(biāo)產(chǎn)物L(fēng)-色氨酸的產(chǎn)量，既節(jié)約了成本又避免了培養(yǎng)基的復(fù)雜化，也為后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)L-色氨酸提供了理論基礎(chǔ)及應(yīng)用價(jià)值。丙氨酸作為細(xì)胞內(nèi)氨基酸池的重要氨基供體，L-丙氨酸合成的減少也可能對(duì)其它代謝產(chǎn)物產(chǎn)生一定影響。因此，在后續(xù)的研究工作中，我們將通過轉(zhuǎn)錄組及代謝組學(xué)的手段對(duì)胞內(nèi)相關(guān)酶的轉(zhuǎn)錄及主要產(chǎn)物進(jìn)行分析以探究代謝修飾對(duì)其產(chǎn)生的影響，并以此為理論基礎(chǔ)有針對(duì)性的通過系統(tǒng)生物學(xué)的策略進(jìn)一步提高L-色氨酸的產(chǎn)量。

4 結(jié)論

本研究以大腸桿菌工程菌E. coliFS 為出發(fā)菌株，利用Red 重組技術(shù)成功敲除與L-丙氨酸合成相關(guān)的兩個(gè)關(guān)鍵L-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因alaA和alaC，搖瓶結(jié)果顯示L-色氨酸產(chǎn)量可達(dá)6.08 g/L，提高了26.7%；丙氨酸含量0.16 g/L，降低了91.0%；最終菌體生物量與原始菌株基本一致。在50 L 罐中補(bǔ)料分批發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果顯示L-色氨酸產(chǎn)量及糖酸轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)41.9 g/L 和20.5%，分別較出發(fā)菌株提高了13.8%和5.1%。L-丙氨酸的積累大幅下降的同時(shí)，L-色氨酸的含量大幅提高。