犬尿氨酸酶在乳腺浸潤性導管癌中的作用及其與突變型P53的關系

肖永志，劉英哲，馮雪萍，易文君

（中南大學湘雅二醫(yī)院 1.超聲科 4.乳腺外科，湖南 長沙 410011；中南大學湘雅醫(yī)院 2.國際醫(yī)療部/國家老年疾病臨床醫(yī)學研究中心 3.醫(yī)學實驗中心，湖南 長沙 410008）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。嚴重威脅到了女性的健康和生活。在2012年，全球大約有170萬人患病，其中有521 900人死亡[1]。在中國，乳腺癌是女性第五大致死性癌癥[2]。乳腺浸潤性導管癌（IDC）是乳腺癌中最常見的病理類型[3]。IDC的發(fā)生主要考慮與基因調控異常及性激素水平的紊亂有關，生物學因素的改變，可以影響到腫瘤相關信號通路的激活，導致早期細胞發(fā)生病變[4]?，F(xiàn)階段IDC患者的早期診斷的水平仍然較為局限，影像學篩查雖然能夠提高診斷準確率，但漏診率或者誤診率仍然較高[5]；臨床上通過手術及綜合性的放療方式輔助治療IDC，但其治療后患者的生存時間的改善并不理想，治療后的3年生存率并無明顯的提高[6]。雖然手術、放療、化療是腫瘤治療的傳統(tǒng)手段[7]，但免疫治療目前已經(jīng)成為治療腫瘤的新的方法，如PD-1/PD-L1抑制劑[8]等，備受人們關注。

犬尿氨酸酶（kynureninase，KYNU）或L-犬尿氨酸水解酶屬于犬尿氨酸酶家族，基因組位置在2q22.2[9]。KYNU在肝臟、胎盤、肺、心臟、腦等多種組織器官中均有表達[10]，能水解L-犬尿氨酸和3-羥基L-犬尿氨酸為鄰氨基苯甲酸，通過色氨酸代謝通路參與NAD輔因子的生物合成[11-12]。色氨酸在腫瘤細胞中主要通過吲哚胺-2-3雙加氧酶1（IDO-1）降解，其降解產(chǎn)物之一為犬尿氨酸。

人類許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展都與p53基因的突變有關。P53蛋白也是多種癌癥進展與預后的一項重要指標[13]。因此，本研究應用免疫組織化學方法檢測IDC標本中KYNU和突變型P53的表達情況，分析它們與IDC臨床病理特征的相關性，進而探討它們之間的相互關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源從2012年9月—2015年在湘雅二醫(yī)院接受外科介入和病理檢查的IDC患者石蠟包埋標本。從患者的記錄中回顧性地獲得這些患者的臨床和病理數(shù)據(jù)。

1.1.2 抗體KYNU抗體購自GeneTex公司（兔多克隆抗體，GTX33291），適用的稀釋濃度為1:1 000；使用UltraViewTMUniversal DAB檢測試劑盒（Ventana Medical Systems）常規(guī)染色針對P53的單克隆抗體。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組化腫瘤組織放入10%福爾馬林中固定，并包埋在石蠟塊中，蠟塊作厚度約4 μm的多張切片，其中1張行切片HE常規(guī)染色，另2張切片分別行KYNU、P53免疫組化檢測，且HE常規(guī)染色均由湘雅二醫(yī)院病理科高年資醫(yī)生病理檢查證實。采用SP法檢測KYNU的表達，檢測方法按試劑盒說明書進行。以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。P53使用自動Benchmark平臺（Ventana Medical Systems，Tucson，USA）進行免疫組化實驗（37 ℃孵育60 min）。使用Benchmark平臺對所有標本使用細胞調節(jié)溶液（CC1，Ventana Medical Systems）的抗原修復，并用蘇木精進行復染。

1.2.2 結果判斷根據(jù)美國臨床腫瘤學會（ASCO）和美國病理學家學會（CAP）指南對P53染色進行評分。P53陽性定義為超過10%的腫瘤細胞染色。KYNU蛋白主要在腫瘤細胞的細胞質中表達。細胞質染色分數(shù)（CF）的得分為0（0～5%），1（5%～25%），2（26%～50%），3（51%～75%）或4（＞75%），細胞質染色強度（CI）記為0（陰性）、1（弱）、2（中等）、3（強）。隨后，通過將CF和CI（范圍0～12）相乘來計算組合的細胞質評分（CS）。為了合理進行統(tǒng)計分析，減少異質性，使用對數(shù)秩和檢驗選擇KYNU表達的臨界范圍值。最佳臨界范圍值被確定為低表達（分數(shù)≤4）或高表達（分數(shù)＞4）KYNU表達。

1.3 統(tǒng)計學處理

使用Windows版的SPSS 19.0版進行統(tǒng)計分析。使用χ2檢驗評估KYNU表達與臨床病理學特征之間的關系。使用單因素方差分析計算KYNU在IDC的腫瘤分級和TNM分期中的表達數(shù)據(jù)。

2 結果

2.1 KYNU在IDC中的表達

在131例IDC組織中進行KYNU的免疫組化分析，63個樣本（48.1%）KYNU高表達（IHC得分＞4），68個樣本（51.9%）為KYNU低表達（IHC得分≤4）。在102例IDC組織中，46個樣本P53表達陽性，陽性率為45.1%，56個樣本P53表達陰性（圖1）。

圖1 免疫組化檢測KYNU與P53蛋白表達（×400） A：乳腺癌組織中KYNU高表達；B：乳腺癌組織中KYNU低表達；C：乳腺癌組織中P53陽性表達；D：乳腺癌組織中P53陰性表

2.2 KYNU在IDC中的表達及與臨床病理指標的關系

單因素分析結果顯示，KYNU的表達T分期（P＜0.001），組織學分級（P=0.01），內在亞型（P=0.032），突變型P53（P=0.02）有關，而與年齡及N分期無關（均P＞0.05）（表1）。

表1 KYNU表達與IDC臨床病理特征的相關性

3 討論

在本研究中，通過免疫組化的方法探討了KYNU在IDC的表達及其對預后評估的價值。KYNU主要在細胞胞漿中表達，它的表達與乳腺癌病理分型相關，在不同分級中表達強弱有差異，組織學分級I級表達最強，組織學分級II級其次，組織學分級III級表達最弱。KYNU的表達在不同分期中表達強弱也有差異，T0表達最強，T3表達最弱。

而在乳腺癌的亞型中表達可見，高KYNU表達多存在于luminal A型，而不是三陰型；而低KYNU表達則多存在于三陰型，而三陰型乳腺癌是一種特殊類型的乳腺癌亞型，具有發(fā)病年齡小、家族史、有淋巴結轉移等特點，其較早發(fā)生局部復發(fā)和遠處轉移[14]，故從腫瘤的分期、分級及不同亞型的分析來看，KYNU的表達與腫瘤的侵襲性負相關。

筆者推測KYNU作為色氨酸代謝途徑中另一關鍵酶在IDC發(fā)生與發(fā)展中起重要的作用。KYNU與色氨酸的利用和疾病的代謝有關，而色氨酸代謝中的重要酶，吲哚胺2，3-雙加氧酶（IDO）與惡性腫瘤的免疫耐受密切相關[15]。一項髓質乳腺癌患者的研究表明，IDO-1的高表達與腫瘤良好的預后相關[16]。犬尿氨酸酶在癌癥發(fā)展中的作用尚不十分清楚，其與癌癥的關聯(lián)僅有少量報道，如肺癌[17]。也有研究表明它與乳腺癌細胞的增殖和分化密切相關[18]。

人體內野生型p53基因作為抑癌基因，主要生物學功能為引起細胞周期阻滯，誘導凋亡和促進分化[19]，但因其含量少，半衰期短而不能用免疫組化法測出。突變型P53蛋白失去抑癌作用，反而有促進細胞惡變的活性，由于其半衰期延長，且在細胞核內聚積，通過免疫組化方法可直接檢測[20]。人類惡性腫瘤中多數(shù)存在p53基因突變[21]，p53基因突變可導致缺陷DNA大量復制，甚至導致惡變[22]。

臨床上乳腺惡性腫瘤的發(fā)生，導致患者生活質量和生存時間顯著下降[23]。在探討IDC的發(fā)病機制的過程中發(fā)現(xiàn)，P53蛋白能夠通過影響到癌細胞的周期調控，導致上皮細胞的持續(xù)性增殖，提高了癌細胞對于導管基底部的浸潤作用[24]。在浸潤性導管癌患者病灶組織中，P53的表達陽性率顯著的上升，高于正常對照乳腺組織，差異較為明顯，提示了P53可能影響到了乳腺癌發(fā)生[25]。

在KYNU與腫瘤相關指標P53的關系分析中可見，KYNU高表達與P53（突變型）呈反向變化關系。還有報道也認為，在乳腺癌患者病灶組織中，P53的表達陽性率可平均上升30%以上，同時在臨床分期較晚或者遠期病死率較高的導管癌患者中，P53的表達陽性率可進一步的上升[26]。

惡性腫瘤是一個多因素、多步驟作用的結果，其發(fā)生要經(jīng)過一系列基因表達變化的共同作用?；诠P者的上述數(shù)據(jù)，KYNU可能對乳腺癌起到了抑制作用，它的高表達可被認為是具有良好預后的IDC的標志物。因此KYNU是很有前途的乳腺癌治療靶點，但需要對KYNU進行更深入的研究。未來將對影響乳腺癌發(fā)展的KYNU分子機制進行更進一步的研究。