陳啟斌,胡 薇,陳培松,趙啟波,周 斌

(1.昭通市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,云南昭通 657000；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)順德醫(yī)院檢驗(yàn)科,廣東廣州 528000；3.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科,廣東廣州 510030)

珠蛋白生成障礙性貧血(下稱地貧),是人類遺傳性單基因遺傳病,以廣東和廣西發(fā)病率最高,為了防止出生缺陷,廣東省于2006年出臺(tái)了《2006年廣東省衛(wèi)生廳地貧產(chǎn)前診斷技術(shù)規(guī)范》中,常規(guī)產(chǎn)前篩查中健康備孕的夫婦雙方和孕婦血細(xì)胞分析,如平均紅細(xì)胞體積(MCV)<82 fL和/或MCH<27 pg,做血紅蛋白電泳篩查檢測(cè)；血紅蛋白電泳血紅蛋白A2(HbA2)升高,懷疑β地貧,做β地貧或/和α地貧基因檢測(cè)；HbA2正常和降低,排除缺鐵性貧血后,檢測(cè)α地貧基因,以上為地貧的正常篩查程序。實(shí)際工作中,有極少數(shù)α地貧基因攜帶者的血常規(guī)結(jié)果完全正常(表型正常),本研究旨在探討表型正常的α地貧基因攜帶者與健康人群的血常規(guī)參數(shù)的差異,建立鑒別計(jì)算公式并確定截點(diǎn)值,期望降低表型正常的α地貧基因攜帶者漏檢率。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2017年10月至2018年8月在廣州市中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院(下稱本院)經(jīng)基因檢測(cè)為α地貧基因攜帶者62例,年齡22～55歲,男30例,女32例,中位數(shù)31歲,血常規(guī)結(jié)果在正常參考范圍,紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC):(4.3～5.8)×1012/L(男)；(3.8～5.1)×1012/L(女)；血紅蛋白(Hb):130～175 g/L(男)；115～150 g/L(女)；MCV:82～100 fL(男/女)；平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(MCH):27～34 pg(男/女)；平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC):316～354 g/L(男/女)[1],排除β地貧(β地貧常見的17種基因突變結(jié)果為陰性)和營(yíng)養(yǎng)性貧血(鐵蛋白、葉酸、維生素B12結(jié)果正常),以及血液病、慢性疾病和惡病質(zhì)患者。另收集在本院門診檢測(cè)無α、β地貧基因攜帶者健康體檢者98例作為對(duì)照組,血常規(guī)結(jié)果在正常參考范圍,年齡15～48歲,男54例,女44例,中位數(shù)33歲。

1.2方法

1.2.1血常規(guī)檢測(cè)方法 希森美康XN9000血液分析流水線檢測(cè)RBC、Hb、MCV、MCH、MCHC、紅細(xì)胞分布寬度(RDW),儀器定期校準(zhǔn),室內(nèi)質(zhì)控良好。

1.2.2貧血三項(xiàng)檢測(cè) 貝克曼生化免疫流水線檢測(cè)鐵蛋白、葉酸、維生素B12,配套試劑,室內(nèi)質(zhì)控良好。

1.2.3α地貧和β地貧基因檢測(cè)方法 采用達(dá)安基因磁珠法DNA提取試劑,α地貧和β地貧基因檢測(cè)試劑采用深圳亞能生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品,gapPCR檢測(cè)αα/-SEA、αα/-α3.7、αα/-α4.23種缺失,用反向斑點(diǎn)雜交檢測(cè) αCSα/αα、αQSα/αα、αWSα/αα 3種α地貧突變和17種β地貧基因突變,設(shè)置陰陽(yáng)性對(duì)照,嚴(yán)格按試劑說明書操作。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,表型正常的α地貧基因攜帶者和健康人群的血常規(guī)參數(shù)的差異用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,并且計(jì)算各鑒別公式的靈敏度(SEN),特異度(SPE),約登指數(shù)(YI)。繪制受試者工作特征(ROC)曲線并計(jì)算曲線下面積(AUC),根據(jù)最大約登指數(shù)確定截點(diǎn)值(cut off)。

2 結(jié) 果

2.1α地貧基因結(jié)果 表型正常的α地貧以αα/-α3.7缺失多見且占比高,αCSα/αα點(diǎn)突變和αWSα/αα點(diǎn)突變占比高但數(shù)量較少；αα/-SEA缺失和αQSα/αα百分之百的異常表型。見表1。

2.2血常規(guī)參數(shù)比較 與健康對(duì)照組比較,表型正常的α地貧基因攜帶者的RBC、HB和RDW比較差異無統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05),MCH、MCV和MCHC比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05、P<0.01和P<0.01)。見表2。

表1 各型α地貧中表型正常的α地中海貧血分布及占比

表2 表型正常的α地貧基因攜帶者與健康人群的血細(xì)胞分析參數(shù)的比較

表3 6個(gè)鑒別診斷公式效能結(jié)果比較

注：-表示無數(shù)據(jù)。

2.3紅細(xì)胞參數(shù)鑒別診斷效能 在6個(gè)鑒別公式中,MCHC×MCV/10 000有高的鑒別作用,AUC達(dá)0.856,截點(diǎn)值在2.90%,62例中42例低于2.90%(42/62) 特異度93.50%,靈敏度73.50%；MCH×MCV/1 000 AUC達(dá)0.838,截點(diǎn)值在2.50%,62例中53例低于2.50%(53/62),特異度83.90%,靈敏度73.50%；MCHC×MCH/10 000 AUC達(dá)0.827,截點(diǎn)值在0.99%,62例中33例低于0.99%(33/62),特異度87.10%,靈敏度69.50%，見表3。按ROC曲線下面積診斷效率依次為MCHC×MCV/10 000>MCH×MCV/1 000>MCHC×MCH/10 000>MCH/MCV；MCHC/MCV、MCHC/MCH、MCV/MCH 3個(gè)鑒別診斷公式ROC曲線下面積<0.5,無鑒別診斷價(jià)值,未計(jì)算YI指數(shù)、特異度、靈敏度等指標(biāo)，見圖1。

圖1 鑒別診斷公式ROC曲線

3 討 論

珠蛋白生成障礙性貧血是我國(guó)一種常見的常染色體單基因遺傳性血液病,是我國(guó)廣東、廣西[2]等南方各省發(fā)病高、影響大的遺傳性疾病。每個(gè)血紅蛋白由四條珠蛋白鏈組成,由兩條α珠蛋白鏈和兩條β珠蛋白鏈構(gòu)成。α地貧的分子基礎(chǔ)是α2和α1珠蛋白基因缺失或發(fā)生點(diǎn)突變,使α珠蛋白生成減少,體內(nèi)過多β珠蛋白鏈形成四聚體(β4),從而引起血紅蛋白含量、紅細(xì)胞體積等發(fā)生改變,導(dǎo)致溶血性貧血[3]。引發(fā)α地貧主要是αα/-SEA、αα/-α3.7、αα/-α4.23種缺失,少量由αCSα/αα、αQSα/αα、αWSα/αα 3種點(diǎn)突變?cè)斐蒣4]；廣東地區(qū)和廣西地區(qū)α地貧基因型比例最高的3種也是--SEA/、-α3.7/和-α4.2/,點(diǎn)突變中αWSα/比αCSα/和αQSα/比例更高[5-6]；海南地區(qū)黎族人群中以-α4.2/和-α3.7/最常見,--SEA/較為少見[7]；云南地區(qū)常見基因--SEA/、-α3.7/和αCSα/[8]。

血細(xì)胞分析診斷貧血具有高效、方便、經(jīng)濟(jì)、高效等優(yōu)點(diǎn),如果血常規(guī)發(fā)現(xiàn)小細(xì)胞低色素性貧血,考慮缺鐵性貧血和地貧,檢測(cè)鐵蛋白等鐵代謝指標(biāo),如無缺鐵證據(jù),考慮地貧,血紅蛋白電泳篩查中HbA2>3.5%是β地貧的特征性指標(biāo)[4]；如HbA2<3.5%,考慮α地貧,分別進(jìn)行α地貧及地貧的基因檢測(cè)[4]。臨床上根據(jù)基因型將α地貧分為靜止型、輕型、中間型和重型,癥狀輕重不一,重型又稱胎兒水腫綜合征,引起流產(chǎn)或死胎的發(fā)生[9]。本研究中αα/-SEA和αQSα/αα這兩種α地貧基因型攜帶者,表型百分之百的異常,αα/-SEA為基因的大片段缺失,αQSα/αα雖然是點(diǎn)突變,可能突變?cè)陉P(guān)鍵位點(diǎn),所以表型也較重。在中國(guó)南方,特別是廣西地區(qū)常見的3種靜止型α地貧(-α3.7/、-α4.2/和αWSα/),由于沒有血液學(xué)表型的改變,血細(xì)胞分析和血紅蛋白電泳不能發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性攜帶者[4]。本研究發(fā)現(xiàn)稍有不同,發(fā)現(xiàn)αCSα/基因攜帶者中也有表型正常的。構(gòu)成比中,αα/-α3.7的例數(shù)較多,αα/-α3.7血液學(xué)表型與正常參考范圍存在的差異范圍較小,αα/-α3.7缺失型α地貧存在一定的漏診率[10],和本研究一致。按照地貧篩查流程,血常規(guī)正常的靜止型α地貧(-α3.7/、-α4.2/和αWSα/)漏檢后,最大的危害是和αα/-SEA的配偶生育血紅蛋白H(HbH)病的后代。α地貧表型的多樣性與基因突變對(duì)α肽鏈合成的影響有關(guān),當(dāng)一個(gè)α基因發(fā)生缺失時(shí),另一個(gè)正常的α基因往往代償性功能增強(qiáng),而一個(gè)α基因發(fā)生突變時(shí),另一個(gè)正常的α基因功能并不受到影響,未發(fā)生代償功能增強(qiáng)；因此,有些非缺失型α地貧的純合子(如αWSα/αWSα)可以表現(xiàn)為HbH病[11]。有研究認(rèn)為,在HbH病中,基因型相同而血紅蛋白電泳結(jié)果及疾病的嚴(yán)重程度可存在顯著差異[12-13]。

在實(shí)際工作中,常發(fā)現(xiàn)檢測(cè)出α地貧缺失或突變,但血常規(guī)結(jié)果完全正常,會(huì)漏診這部分表型正常的α地貧基因攜帶者。α地貧表型正常組和健康對(duì)照組相比,MCV、MCH、MCHC 3個(gè)指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這是筆者考慮用這3個(gè)指標(biāo)組成鑒別公式的原因。α地貧表型正常組的MCV和MCHC都比健康對(duì)照組明顯降低,差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),MCV和MCHC相乘的結(jié)果更放大差異,這是MCHC×MCV/10 000公式鑒別效能最高的原因；而α地貧表型正常組的MCH比健康對(duì)照組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),由MCH分別和 MCHC及MCV相乘的結(jié)果組成的鑒別公式MCH×MCV/1 000和MCHC×MCH/10 000鑒別效能低于MCHC×MCV/10 000。由于α地貧表型正常組的MCV、MCH、MCHC都比健康對(duì)照組減小,相互除后的結(jié)果不能放大差異,導(dǎo)致MCH/MCV、MCHC/MCV、MCHC/MCH及MCV/MCH這4個(gè)公式鑒別效能低的原因。通過本文數(shù)據(jù)分析,血常規(guī)表型正常的α地貧基因攜帶者的MCV、MCHC和MCH,同健康者相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,通過這些有意義的指標(biāo)建立鑒別診斷公式,鑒別公式中MCHC×MCV/10 000<2.9、MCH×MCV/1 000<2.5、MCHC×MCH/10 000<0.99對(duì)表型正常的α地貧基因攜帶者篩選有超過0.8的曲線下面積,有一定的參考價(jià)值,并可以通過軟件對(duì)鑒別公式計(jì)算并過濾。鑒別公式MCHC×MCV/10 000(cut off值2.895)、MCHC×MCH/10 000(cut off值0.985)、MCH×MCV/1 000(cut off值2.485)的特異度分別為93.5%、87.1%、83.9%,排除α地貧的效能依次降低。鑒別公式MCHC×MCV/10 000,除了有最高的特異度,AUC為0.856,也最高,是理想的鑒別公式。血細(xì)胞分析是診斷貧血的首要檢測(cè)項(xiàng)目,具有方便、經(jīng)濟(jì)、高效等特點(diǎn),因此在臨床中常用于鑒別患者的貧血類型[14]；基因診斷因費(fèi)用貴,操作復(fù)雜,在大多數(shù)醫(yī)院及地貧低發(fā)地方的醫(yī)院不能實(shí)現(xiàn)普查,因此尋找簡(jiǎn)單、有效、快捷的實(shí)驗(yàn)的鑒別診斷方案為臨床一線,尤其是基層醫(yī)院診療提供依據(jù),減少漏診率。

臨床工作中,檢測(cè)3種常見缺失型基因(-SEA/αα、-α3.7/αα、-α4.2/αα)及3種非缺失型基因(αCSα、αQSα及αWS),就能檢出約98.0% α 地貧基因[15],靳旺杰等[16]通過測(cè)序發(fā)現(xiàn)23例11種罕見的α -地貧突變基因,唐海深等[17]用多重PCR檢測(cè)少見的4種α地貧基因：--THAI、--FIL、--MED、-(α)20.5,以上這些罕見的α 地貧都未描述血液學(xué)表型,其血液學(xué)表型是否正常,將通過更多研究來補(bǔ)充。