李金璐 張慧 焦?jié)捎?劉劍宇 韓光煜 卓曉軒 羅瓊

水稻子預(yù)44和江南香糯基因組比較鑒定稻瘟病抗性相關(guān)基因

李金璐#張慧#焦?jié)捎?劉劍宇 韓光煜 卓曉軒 羅瓊*

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)生物多樣性與病蟲害控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/省部共建云南生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 昆明 650201;#共同第一作者;*通信聯(lián)系人, E-mail: qiongbf@aliyun.com)

【目的】子預(yù)44是一具有廣譜持久稻瘟病抗性的云南地方粳稻品種。為了鑒定子預(yù)44中候選稻瘟病抗性相關(guān)基因，【方法】本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)（High-throughput sequencing）對(duì)子預(yù)44和感病水稻江南香糯進(jìn)行了全基因組測(cè)序。而后使用軟件GATK(3.4-46)對(duì)高質(zhì)量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行SNP和InDel的檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)，進(jìn)一步篩選出子預(yù)44和江南香糯DNA水平存在SNPs/InDels多態(tài)性抗病相關(guān)基因。【結(jié)果】通過Hiseq X10 PE150平臺(tái)分別獲得了4 118 170 045 bp和2 995 054 509 bp子預(yù)44和江南香糯的基因組數(shù)據(jù)，比對(duì)到參考基因組（Ensembl release 31）的比對(duì)率分別為98.56％和98.30％。在抗病水稻子預(yù)44和感病水稻江南香糯之間鑒定了922個(gè)純合突變的差異抗病相關(guān)基因。結(jié)合基因定位結(jié)果，在子預(yù)44中鑒定了一個(gè)新的抗稻瘟病候選基因?！窘Y(jié)論】研究結(jié)果為子預(yù)44中抗稻瘟病新基因的克隆提供了參考，對(duì)子預(yù)44廣譜持久抗瘟分子機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。

水稻；稻瘟病；基因組測(cè)序；抗病相關(guān)基因

水稻是世界上近一半人口的主糧，隨著世界人口的不斷增長(zhǎng)，預(yù)計(jì)到2030年水稻生產(chǎn)至少需要增加40%的產(chǎn)量才能滿足人們的生活所需[1]。由稻瘟病菌引起的稻瘟病是水稻生產(chǎn)上最具毀滅性的病害，全球每年因稻瘟病造成稻谷減產(chǎn)10%~30%，每年減產(chǎn)的糧食足夠養(yǎng)活6千萬人口[2]。目前，稻瘟病防治主要采用的是藥劑防治和種植抗病品種。雖然藥劑防治對(duì)穩(wěn)定水稻產(chǎn)量起到了非常重要的作用，但農(nóng)藥的重復(fù)大量使用帶來了嚴(yán)重的環(huán)境污染[3, 4]。利用抗病基因培育抗病品種是控制稻瘟病最經(jīng)濟(jì)有效和環(huán)保的方法[3-7]。目前已鑒定的主效抗性基因位點(diǎn)已超過100個(gè)，數(shù)量抗性位點(diǎn)已超過350個(gè)[5, 8, 9]，已克隆的抗稻瘟病基因約30個(gè)[5, 6, 9-12]?；蚪閷?dǎo)的小種特異性抗性效果明顯、抗性強(qiáng)，在水稻育種中容易被利用，所以目前生產(chǎn)上使用的抗病品種多屬于這種抗性。然而，基因介導(dǎo)的抗性會(huì)由于病原的快速進(jìn)化而喪失，因而抗性品種推廣種植3~5年后其抗性就逐漸喪失[13, 14]。此外，我國(guó)新育成的一些水稻品種抗瘟效果并不太理想。例如，在2004?2008年間，國(guó)審的174個(gè)品種對(duì)稻瘟病的平均抗病指數(shù)僅為5.5，處于中感水平[7]。因此，優(yōu)異的稻瘟病抗性新基因的發(fā)掘，尤其是廣譜抗性基因的鑒定和利用對(duì)保證水稻產(chǎn)量具有重要意義。

子預(yù)44是一具有廣譜持久抗瘟性的云南地方粳稻品種[16]。我們?cè)谧宇A(yù)44中鑒定了多個(gè)主效和微效抗瘟基因位點(diǎn)[17-22]，發(fā)現(xiàn)子預(yù)44第6染色體短臂上10.008~11.043 Mb區(qū)間攜帶一個(gè)抗多個(gè)稻瘟病菌的主效基因。但由于水稻第6染色體短臂上抗稻瘟病基因成簇分布，且序列高度保守[23]，通過常規(guī)的PCR方法進(jìn)行該區(qū)域DNA片段的擴(kuò)增和分析鑒定候選基因不僅耗時(shí)費(fèi)錢，而且結(jié)果不理想。為了能快速有效地鑒定和克隆已定位的抗病基因，我們嘗試在基因初步定位的基礎(chǔ)上，進(jìn)行抗病親本子預(yù)44和感病親本江南香糯的全基因組重測(cè)序和序列比較分析，篩選鑒定抗病候選基因。

1 材料與方法

1.1 水稻材料

抗病粳稻品種為子預(yù)44和中花11。感病粳稻品種為日本晴、臺(tái)北309、江南香糯和麗江新團(tuán)黑谷。抗病秈稻品種為9311和地谷。感病秈稻品種為Kasalath。以上水稻材料均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 稻瘟病菌菌株

稻瘟菌株LP33、LP174和LP29-3由何月秋教授課題組提供，H53由本實(shí)驗(yàn)室從黑龍江采集的稻瘟病病樣分離保存。

1.3 水稻育苗

選取健康飽滿的成熟水稻種子，75％酒精消毒40 s，無菌水清洗3次，20％次氯酸鈉消毒40 min，期間每10 min輕微晃動(dòng)一次，消毒完成后用無菌水清洗3次。將消毒后的種子浸泡于無菌水中于37℃下吸脹，待種子露白后轉(zhuǎn)移至鋪有滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，加少量無菌水后于37℃下催芽。幼芽長(zhǎng)至0.5 cm左右時(shí)播于特制的96孔PCR育苗板上，放置于營(yíng)養(yǎng)液（參照國(guó)際水稻研究所的配方，并依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室實(shí)際使用情況略作調(diào)整）中，室溫、正常光照條件下培養(yǎng)。

1.4 水稻幼苗基因組DNA提取

采用稍作修改的CTAB法提取水稻幼苗基因組DNA。新鮮水稻幼苗剪碎后置于液氮預(yù)冷的研缽中，加入液氮快速研磨成粉，分裝于2 mL離心管中，每管分裝約0.1 g水稻樣品。加入650 μL已于65℃下預(yù)熱的CTAB提取液，充分震搖混勻。65℃下水浴30 min（每10 min搖晃混勻一次，以免組織結(jié)塊）。加入等體積650 μL氯仿，顛倒混勻，12 000 r/min下離心10 min。上清轉(zhuǎn)入新的1.5 mL離心管中，加入等體積?20℃預(yù)冷的異丙醇，輕輕顛倒混勻，于?20℃下靜置30 min，12 000 r/min下離心5 min。棄上清，沉淀加500 μL 75％酒精洗滌，12 000 r/min下離心2 min，棄上清，洗滌2~3次，用無水乙醇洗一次。離心管開蓋于超凈工作臺(tái)晾干。

晾干的DNA沉淀加入20~50 μL雙蒸水充分溶解后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，并同已知濃度的λ DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)比較估計(jì)其濃度。于?20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 子預(yù)44和江南香糯全基因組重測(cè)序

子預(yù)44是云南地方品種麻早谷與城堡2號(hào)雜交選育而成的廣譜抗稻瘟病的高原粳稻，對(duì)6群16個(gè)中國(guó)稻瘟病菌生理小種(ZA1，ZA49，ZA57，ZA61；ZBl，ZB13，ZB17，ZB25；ZCl，ZC3，ZCl3，ZC15；ZEI，ZE3；ZFl和ZGl)表現(xiàn)廣譜抗性[16]。江南香糯是一低海拔高感稻瘟病的粳糯水稻品種，是抗稻瘟病基因克隆中常用的感病親本[24]。在前期研究中，我們利用子預(yù)44和江南香糯作為雜交親本構(gòu)建的F7重組自交系(RIL F7)群體，進(jìn)行了子預(yù)44中數(shù)量抗性位點(diǎn)分析[20]；利用子預(yù)44和江南香糯雜交構(gòu)建的F2群體，在子預(yù)44中定位了抗稻瘟病菌ZE1、LP33、LP11和LP36的主效抗瘟基因(t)[17]、(t)[18]、(t)[21]和(t)[22]。為了進(jìn)一步克隆這些主效抗病基因，本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)子預(yù)44和江南香糯進(jìn)行了基因組重測(cè)序和序列比較分析。

校園宣傳語的漢譯英不僅要基于原文，更要考慮翻譯要求，現(xiàn)實(shí)翻譯目的，它是檢驗(yàn)翻譯是否充分的標(biāo)準(zhǔn)；因而要對(duì)受眾做分析，譯文難度要適合中學(xué)生的英語水平，同時(shí)譯者心中還應(yīng)有虛擬受眾，譯文對(duì)他們必須有效；作為校園宣傳語，有其獨(dú)特的語體特征，譯文要短小精悍、朗朗上口、便于記憶、利于宣傳；另外，由于中英兩種語言在語言特點(diǎn)、修辭手法上存在差異，基于翻譯目的適時(shí)變通與創(chuàng)新。

參照文獻(xiàn)[17]提取子預(yù)44和江南香糯單株基因組DNA，用酶隨機(jī)打斷成短的DNA片段后，進(jìn)行末端修復(fù)。然后在DNA片段兩端連接dA尾，并連接測(cè)序接頭。加上接頭的DNA片段經(jīng)過AMPure XP磁珠純化，選擇300~400 bp范圍的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。建好的文庫(kù)經(jīng)過純化、庫(kù)檢，Hiseq X10 PE150上機(jī)測(cè)序。

1.6 數(shù)據(jù)過濾與質(zhì)量分析

為了保證數(shù)據(jù)質(zhì)量，在信息分析前對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，通過數(shù)據(jù)過濾減少數(shù)據(jù)噪音。對(duì)下機(jī)的測(cè)序序列片段(clean reads)再進(jìn)行更嚴(yán)格的過濾，得到高質(zhì)量的測(cè)序序列片段(High quality clean reads)，用于后續(xù)的信息分析。過濾的步驟包括去除含接頭的，含N比例大于10%的以及低質(zhì)量的(質(zhì)量值Q≤10的堿基數(shù)占整條測(cè)序序列片段的50％以上)測(cè)序序列片段。

1.7 比對(duì)到參考基因組和覆蓋度統(tǒng)計(jì)

使用比對(duì)軟件0.7.12[25]和Mem算法，將過濾后的測(cè)序序列片段比對(duì)到參考基因組(Ensembl release 31)上，比對(duì)參數(shù)設(shè)置為-k 32 –M。

序列片段比對(duì)之后的結(jié)果用Picard 1.129 (Picard: http:// sourceforge.net/projects/picard/)進(jìn)行標(biāo)記，并統(tǒng)計(jì)插入片段數(shù)量。

用Bedtools 2.25.0[26]軟件進(jìn)行覆蓋度統(tǒng)計(jì)。

1.8 SNPs和InDels統(tǒng)計(jì)

在基因組水平上由單個(gè)核苷酸或者幾個(gè)核苷酸的插入或缺失所形成的DNA序列多態(tài)性，為變異。使用軟件(3.4-46)[27]的UnifiedGenotyper模塊將處理好的比對(duì)文件進(jìn)行多個(gè)樣本的變異檢測(cè)，檢測(cè)到的變異使用VariantFiltration進(jìn)行過濾，過濾參數(shù)為-Window4, -filter “QD < 4.0 || FS > 60.0 || MQ < 40.0”，-G_filter “GQ < 20”。用ANNOVAR[28]對(duì)檢測(cè)出的變異進(jìn)行功能注釋。

1.9 候選抗病相關(guān)基因鑒定

將子預(yù)44和江南香糯基因組測(cè)序獲得的數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)到日本晴基因組中，根據(jù)日本晴基因組中基因注釋的結(jié)果，鑒定子預(yù)44和江南香糯中的抗病相關(guān)基因。篩選出子預(yù)44和江南香糯之間DNA水平上存在SNP/InDel多態(tài)性的基因，并統(tǒng)計(jì)差異位點(diǎn)。篩選出分布在抗病相關(guān)基因編碼區(qū)的SNP/InDel差異位點(diǎn)，進(jìn)一步篩選出非同義純合突變的差異基因，作為初步候選抗病相關(guān)基因。結(jié)合前期基因定位結(jié)果，進(jìn)一步鑒定候選抗病相關(guān)基因。

1.10 稻瘟病菌孢子懸浮液制備

參照文獻(xiàn)[17]，進(jìn)行菌株活化培養(yǎng)和產(chǎn)孢培養(yǎng)，將孢子濃度調(diào)制為2×105個(gè)/mL，配成終濃度為0.4%的明膠孢子懸浮液，待用。

1.11 水稻幼苗期接種及調(diào)查

水稻幼苗長(zhǎng)到3~4葉期，將其轉(zhuǎn)移至恒溫接種室，配制2×105/mL的孢子懸浮液進(jìn)行噴霧接種。接種后在溫度25℃，濕度95％的條件下，黑暗培育24 h后，12 h光照和12 h黑暗交替培育5~7 d，參照文獻(xiàn)[29]采用6級(jí)分級(jí)法進(jìn)行病斑類型調(diào)查。

1.12 DNA片段的PCR擴(kuò)增、回收和測(cè)序

PCR擴(kuò)增采用50 μL反應(yīng)體系：DNA模板1 μL(10 ng/μL)，正反引物各0.75 μL(10 μmol/L)，10×緩沖液 5 μL，dNTPs 4 μL(2.5 mmol/L)，MgSO42 μL，KOD-PLUS 0.4 μL，DMSO 0.5 μL，ddH2O 35 μL。95℃下變性5 min，然后95℃下15 s，57±2℃下15 s，68℃下30 s/1000 bp，35個(gè)循環(huán)，72℃下延伸5 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠，1×TAE電泳緩沖液中，120 V電壓電泳~30 min，待DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)各個(gè)條帶區(qū)分明顯后于切膠臺(tái)切取目的條帶。采用北京全式金公司的膠回收試劑盒(Easy PureQuick Gel Extraction Kit)，按每0.1g回收膠加300 μL溶膠液(Binding Buffer)，65℃下加熱溶解。溶膠加入分離柱(最多700 μL)，10 000 r/min下離心1 min，將液相加入分離柱重復(fù)此步驟。棄液相，再加300 μL新的溶膠液，10 000 r/min下離心1 min。棄液相，加入700 μL已加入無水乙醇的清洗液(Wash Buffer)，10 000 r/min下離心1 min。棄液相，重復(fù)此步驟1次。棄液相，空管離心，10 000 r/min下離心2 min。棄液相，開蓋于65℃下加熱3 min。換干凈1.5 mL離心管，加入30 μL 65℃下預(yù)熱的ddH2O。65℃下閉蓋保溫3 min，1300 r/min下離心2 min，收集洗脫液。

表1 子預(yù)44和江南香糯基因組序列數(shù)據(jù)

連接反應(yīng)：回收產(chǎn)物0.5~4 μL，北京全式金公司平末端克隆載體（pEasy-Blunt Simple Cloning Vector ）1 μL，補(bǔ)充ddH2O到總體積5 μL，混勻。25℃下連接5~30 min（連接時(shí)間因連接片段大小而異：0.1~1 kb為5~10 min；1~2 kb為10~15 min；2~3 kb為15~20 min；大于3 kb為20~30 min）。

連接反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物中加入50 μL大腸桿菌感受態(tài)DH5α，輕彈混勻。冰浴30 min， 42℃水浴熱擊1 min,立即放冰上2 min，然后加入1 mL的空白LB培養(yǎng)基，于37℃、200 r/min下?lián)u床培養(yǎng)60 min，涂布于含有卡那霉素的LB平板，吹干，37℃下倒置培養(yǎng)過夜。挑取單菌落于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)4 h后，取菌液1 μL進(jìn)行PCR檢測(cè)，能擴(kuò)增出目的片段的單菌落菌液送昆明碩擎生物有限公司測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 子預(yù)44、江南香糯基因組重測(cè)序

通過Hiseq X10 PE150平臺(tái)獲得的子預(yù)44和江南香糯高質(zhì)量測(cè)序片段（HQ Clean Reads）分別為 41 021 044條(4 118 170 045 bp)和29 931 088條 (2 995 054 509 bp)，覆蓋參考基因組（Ensembl release 31）單末端的測(cè)序片段分別為104 368條和 64 567條，覆蓋參考基因組雙末端的測(cè)序片段分別為20 163 591×2和14 678 401×2，未比對(duì)上的測(cè)序片段分別為589 494條和509 719條，比對(duì)率分別為98.56％和98.30％。數(shù)據(jù)讀長(zhǎng)為101 bp，Q30分別為95.39%和94.82%(Q30是指質(zhì)量值大于30的堿基所占百分比，測(cè)序堿基正確率為99.9%，表1)。

2.2 子預(yù)44和江南香糯基因組比較分析及抗病相關(guān)基因鑒定

將子預(yù)44和江南香糯基因組測(cè)序獲得的數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)到日本晴基因組中，根據(jù)與日本晴基因組中的基因注釋的比對(duì)結(jié)果，在子預(yù)44和江南香糯中共鑒定了4510個(gè)抗病相關(guān)基因?qū)Α＿@些基因廣泛分布于水稻的12條染色體上。不同染色體上的基因數(shù)目存在差異，第1染色體上有640個(gè)基因，數(shù)量最多，占總數(shù)的14％。第9染色體上的基因數(shù)最少，為199個(gè)(5％，圖1)。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，4 510個(gè)抗病相關(guān)基因中有1769個(gè)基因在子預(yù)44與江南香糯之間存在DNA水平上的SNP/InDel多態(tài)性，差異位點(diǎn)達(dá)22 537個(gè)，廣泛分布于基因的上游、下游、外顯子以及內(nèi)含子區(qū)域(圖2)。

在這22 537個(gè)SNP/InDel多態(tài)性位點(diǎn)中，有5063個(gè)SNP/InDel差異位點(diǎn)分布在987個(gè)抗病相關(guān)基因的編碼區(qū)，并導(dǎo)致了氨基酸水平的差異。其中，SNP/InDel包括四種類型，最多的為非同義SNP，共有4 732個(gè)（表2）。將包含不同SNP/InDel位點(diǎn)的抗性相關(guān)基因進(jìn)行維恩分析，發(fā)現(xiàn)含有非同義SNP的基因數(shù)目最多，為728個(gè)（圖3）。

978個(gè)差異基因中有922個(gè)為純合突變的差異基因（附表1），它們不均勻地分布在水稻的12條染色體上，其中，第1、11和6染色體較多，分別有168個(gè)(17%)、158個(gè)(16%)和114個(gè)(12%)。第11和6染色體也是到目前為止鑒定和克隆抗稻瘟病基因最多的染色體。第1染色體雖然預(yù)測(cè)的抗病相關(guān)基因數(shù)量較多，但克隆的基因只有4個(gè)位于第1染色體上。該結(jié)果對(duì)子預(yù)44中抗稻瘟病基因的鑒定具有重要參考價(jià)值（圖4）。

圖1 抗病相關(guān)基因在水稻的分布

Fig. 1. Distribution of resistance related genes on rice chromosomes.

Fig. 2. Polymorphisms of disease resistance-related genes between Ziyu 44 and Jiangnanxiangnuo.

2.3 子預(yù)44中一個(gè)新的抗稻瘟病候選基因的鑒定

利用LP33、LP29-3、LP174、H53等多個(gè)稻瘟病菌株進(jìn)行子預(yù)44中抗稻瘟病主效基因定位發(fā)現(xiàn)，子預(yù)44中抗這些菌株的基因均定位于水稻第6染色體短臂上10.008?11.043 Mb之間。進(jìn)一步利用該定位區(qū)間的多態(tài)性標(biāo)記和擴(kuò)大的F2群體進(jìn)行基因精細(xì)定位，縮小定位區(qū)間的工作卻困難重重，進(jìn)展緩慢?；诖?，結(jié)合定位區(qū)間內(nèi)抗病相關(guān)基因的預(yù)測(cè)和子預(yù)44與江南香糯基因組的比較分析發(fā)現(xiàn)，該區(qū)間內(nèi)1個(gè)預(yù)測(cè)的絲/蘇氨酸蛋白激酶編碼基因，在子預(yù)44和江南香糯等位基因間有9個(gè)核苷酸的缺失/插入（GCCGCCGCC）突變（圖5-A），導(dǎo)致了編碼蛋白3個(gè)氨基酸(AAA)的缺失/插入差異（圖5-B）。

表2 非同義突變的SNP/InDel

Frameshift InDel?引起氨基酸編碼移碼突變的插入缺失突變；Nonframeshift InDel?不導(dǎo)致氨基酸編碼移碼的插入缺失突變；Nonsynonymous SNP?引起氨基酸差異的單核苷酸多態(tài)性；Stoploss/gain?SNP/InDel突變引起功能缺失或獲得的氨基酸翻譯終止或延伸。

Fig. 3. Nonsynonymous mutation of SNP/InDel between Ziyu 44 and Jiangnanxiangnuo.

圖4 922個(gè)抗病相關(guān)基因在水稻染色體上的分布

Fig. 4. Distribution of 922 resistance-related genes on rice chromosomes.

進(jìn)一步根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)特異的PCR引物，分別從3個(gè)抗病水稻(9311、中花11、地谷)和4個(gè)感病水稻(日本晴、麗江新團(tuán)黑谷、Kasalath、臺(tái)北309)中擴(kuò)增其基因片段。序列分析顯示，3個(gè)抗病水稻中基因的DNA序列與子預(yù)44一致，而4個(gè)感病水稻中該基因的DNA序列與江南香糯一致（圖5-A）。

為進(jìn)一步確定9個(gè)水稻材料中基因在DNA水平上的差異是否與其抗/感表型一致，利用稻瘟病菌株LP174，對(duì)9個(gè)水稻材料進(jìn)行了苗期噴霧接種鑒定。結(jié)果表明，子預(yù)44、9311、中花11和地谷對(duì)LP174的抗病型類似，江南香糯、日本晴、麗江新團(tuán)黑谷、Kasalath和臺(tái)北309對(duì)LP174表現(xiàn)相似的感病特征（圖6），抗/感表型與基因在分子水平的差異一致。因此，推測(cè)該基因可能是子預(yù)44中抗稻瘟病菌株LP174的候選基因。

3 討論

到目前，鑒定的抗稻瘟病主效基因已超過100個(gè)，分布在水稻除第3染色體以外的其他所有染色體上。其中以第6、11和12染色體分布較多，占總數(shù)的一半以上[30]。本研究結(jié)果顯示，第3染色體上預(yù)測(cè)的抗病相關(guān)基因有469個(gè)，占總數(shù)的10％，僅次于第1和2染色體，多于定位和克隆抗稻瘟病基因數(shù)量較多的第6(383)、11(404)和12(277)染色體，居第3位（圖1）。這與目前定位和克隆的抗稻瘟病基因在水稻染色體上的分布不完全一致。是什么原因?qū)е聨缀鯖]有能通過圖位克隆的方法在第3染色體上鑒定和克隆到抗稻瘟病基因呢？對(duì)子預(yù)44和江南香糯間非同義突變的差異抗性相關(guān)基因的進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，子預(yù)44和江南香糯間非同義突變的差異抗性相關(guān)基因主要分布在第1、6和11染色體上，也就是說，雖然第3染色體上預(yù)測(cè)的抗病相關(guān)基因數(shù)量較多，但僅有5％預(yù)測(cè)的抗病相關(guān)基因在兩個(gè)抗、感水稻間存在非同義突變差異，差異基因的數(shù)目是12條染色體中最少的（圖4），這與目前鑒定和克隆的抗稻瘟病基因主要分布在水稻第1、6、11和12染色體上，第3染色體上鑒定的抗病基因數(shù)量最少的結(jié)果一致[15]。我們推測(cè)第3染色體上預(yù)測(cè)的抗病相關(guān)基因很可能多為沒有抗性功能的假基因，或微效基因位點(diǎn)，也有可能這些抗病基因與病原菌無毒基因間的相互作用不符合“基因?qū)颉奔僬f。Li等[16]通過66份水稻材料的基因組測(cè)序和分析，在水稻第3染色體上鑒定了一個(gè)編碼C2H2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子的隱性廣譜抗瘟基因，實(shí)現(xiàn)了水稻第3染色體上抗稻瘟基因克隆數(shù)量零的突破，為這一推論提供了一定的證據(jù)，但仍有待相關(guān)研究的進(jìn)一步證實(shí)。

ZY44–子預(yù)44；Digu–地谷；ZH11–中花11；JNXN–江南香糯；Nip–日本晴；LTH–麗江新團(tuán)黑谷；TP309–臺(tái)北309。

Fig. 6. Symptoms of nine rice varieties inoculated withLP174.

ZY44–子預(yù)44；Digu–地谷；ZH11–中花11；JNXN–江南香糯；Nip–日本晴；LTH–麗江新團(tuán)黑谷；TP309–臺(tái)北309。

Fig. 5. Comparison of the nucleotide and amino acid sequences offrom nine rice varieties.

目前，已定位和克隆的抗稻瘟病基因除[31],(t)[32]和(t)[14]為隱性抗病基因外，其余都是顯性抗病基因。圖位克隆方法是定位和克隆水稻各種功能基因普遍采用的經(jīng)典方法，并卓有成效。然而近年來利用這種方法克隆的抗稻瘟病基因大多數(shù)是已克隆基因的等位或是直系同源基因[10]。Shang等[33]在秈稻品種93-11和粳稻品種日本晴基因組中編碼的NBS-LRR基因分析和比較的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)假基因化分子標(biāo)記，從地谷中克隆了抗稻瘟病基因[33]。最近，Li等[16]通過66份水稻材料的基因組測(cè)序和分析，在水稻第3染色體上鑒定的隱性廣譜抗瘟基因。我們?cè)诨蚨ㄎ坏幕A(chǔ)上，結(jié)合兩親本基因組序列的比較分析，在水稻第6染色體短臂上鑒定一個(gè)新的編碼絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（serine threonine kinase）抗多個(gè)稻瘟病菌株的候選抗瘟基因()。這些結(jié)果表明，隨著高通量基因組測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，通過基因組測(cè)序和比較基因組學(xué)的方法鑒定和克隆新的水稻抗病基因，是一種省時(shí)有效的方法。

子預(yù)44是一具有廣譜持久稻瘟病抗性的云南地方粳稻品種，利用高通量測(cè)序技術(shù)Hiseq X10 PE150進(jìn)行了子預(yù)44和感病水稻江南香糯的全基因組重測(cè)序，分別獲得了高質(zhì)量的基因組數(shù)據(jù) 4 118 170 045 bp和2 995 054 509 bp，比對(duì)到參考基因組（Ensembl release 31）的比對(duì)率分別為98.56％和98.30％。在子預(yù)44和江南香糯之間鑒定了922個(gè)純合突變的差異抗病相關(guān)基因，明確了這些基因的染色體分布，為子預(yù)44中抗病新基因的克隆和育種利用研究提供了有價(jià)值的信息，為研究子預(yù)44的廣譜抗瘟分子機(jī)制奠定了重要的基礎(chǔ)。

謝辭:感謝中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所程祝寬研究員和梁承志研究員在水稻基因組測(cè)序中提供的幫助，感謝廣州基迪奧生物科技有限公司在數(shù)據(jù)分析中的幫助。

輔助信息：有一個(gè)輔助性表格S1放在《中國(guó)水稻科學(xué)》網(wǎng)站(http://www.ricesci.cn)上。

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Identification of Blast Disease Resistance-related Genes by Genomic Sequence Comparison of Rice Variety Ziyu 44 and Jiangnanxiangnuo

LI Jinlu#, ZHANG Hui#, JIAO Zeyu, LIU Jianyu, HAN Guangyu, ZHUO Xiaoxuan, LUO Qiong*

(State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Bio-Resources in Yunnan, Ministry of Education Key Laboratory of Agricultural Biodiversity for Plant Disease Management, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China;#These authors contributed equally to this work;*Corresponding author, E-mail: qiongbf@aliyun.com)

【Objective】Ziyu 44 is indigenousrice from Yunnan Province of Chinawith durable broad-spectrum resistance to. In order to identify novel candidate rice blast resistance-related genes from Ziyu44, 【Method】we performed the whole genome sequencing of Ziyu 44 and susceptible variety Jiangnanxiangnuo(JNXN). Then we checked and summarized SNPs/InDels of high-throughput sequencing data by software GATK(3.4-46), and screened out disease resistance-related genes with SNPs/InDels polymorphic loci at DNA level of Ziyu44 and JNXN.【Result】4118170045bp and 2995054509bp genomic data of Ziyu44 and Jiangnanxiangnuo were respectively produced using Hiseq X10 PE150 platform. The alignment rates to the reference genomes (Ensembl release 31) were 98.56% and 98.30%, respectively. A total of 922 resistance-related differential genes were identified between Ziyu44 and JNXN. Further, combined with the result of gene mapping, we identified a new blast resistance candidate gene in Ziyu44. 【Conclusion】Our results provide valuable information for cloning of new rice blast resistance new genes, and lay an important foundation for exploring the molecular mechanism of durable broad-spectrum resistance to rice blast in Ziyu44.

rice; rice blast; genome sequencing; resistance-related genes

S435.111.4+1; S511.034

A

1001-7216(2020)01-0008-09

10.16819/j.1001-7216.2020.9066

2019-06-12;

2019-06-28。

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃資助項(xiàng)目（2016YFD0100600）；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31160223）；云南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃資助項(xiàng)目(IRTSTYN)。