水稻蠟質(zhì)稀少突變體wax1的鑒定及基因定位

潘孝武 黎用朝 劉文強 熊海波 董錚 薛丹 盛新年 趙文錦 魏秀彩 李小湘

水稻蠟質(zhì)稀少突變體的鑒定及基因定位

潘孝武 黎用朝 劉文強 熊海波 董錚 薛丹 盛新年 趙文錦 魏秀彩 李小湘*

（湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水稻研究所/農(nóng)業(yè)部長江中下游秈稻遺傳育種重點實驗室，長沙 410125；*通信聯(lián)系人，E-mail: xiaoxiang66196@126.com）

【目的】蠟質(zhì)是植物表面的一種重要保護物質(zhì)，篩選和鑒定水稻蠟質(zhì)相關(guān)突變體有助于解析水稻蠟質(zhì)形成的遺傳機制?！痉椒ā坷肊MS誘變秈稻品種湘早秈6號，從突變體庫中篩選出一個蠟質(zhì)稀少的突變體，考查突變體的形態(tài)特征和農(nóng)藝性狀，利用突變體與02428雜交的F2群體定位目標基因，并通過熒光定量PCR分析相關(guān)基因的表達情況。【結(jié)果】與野生型相比，突變體具有葉片短小皺褶、葉表面蠟質(zhì)晶體減少、穗長變短等形態(tài)特征；在農(nóng)藝性狀方面，突變體的株高、每穗總粒數(shù)和千粒重顯著降低，但有效穗數(shù)顯著高于野生型；遺傳分析表明，的突變表型受一對隱性核基因控制，將基因定位在第10染色體上SSR標記RM5806與InDel標記P1之間，物理距離約為49.8 kb；定位區(qū)間內(nèi)的測序結(jié)果表明，突變體中β-酮脂酰-CoA合酶的編碼基因發(fā)生單堿基突變，導(dǎo)致催化活性中心的一個氨基酸發(fā)生改變?；虻耐蛔冿@著提高了同源異型盒基因的表達，同時引起部分IAA基因的差異表達。【結(jié)論】基因突變引起葉表面蠟質(zhì)晶體的減少，同時通過影響莖尖分生組織和生長素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)引起植株生長發(fā)育等多方面的異常。

水稻；蠟質(zhì)；基因定位；生長素

植物表面覆蓋有角質(zhì)層，由表皮細胞分泌而來，是植物與空氣接觸的一層疏水性屏障。它在降低植物非氣孔水分散失，保護植物抵御干旱、紫外輻射以及病蟲害等不良環(huán)境中起到重要作用[1,2]。角質(zhì)層由角質(zhì)和蠟質(zhì)組成，而蠟質(zhì)又可分為內(nèi)外兩層，內(nèi)表皮蠟質(zhì)通常填充在角質(zhì)層致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)，而外表皮蠟質(zhì)堆積在最外層并且自我組裝成各種形態(tài)的蠟質(zhì)晶體[3]。蠟質(zhì)是由一些碳鏈長度在18以上的超長鏈脂肪酸(very long chain fatty acids, VLCFAs)及其衍生物組成的有機混合物[4]。

蠟質(zhì)合成主要包括三個步驟：第一步在表皮細胞的細胞質(zhì)內(nèi)從頭合成C16/C18飽和脂肪酸，第二步在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中由脂肪酸延長酶（fatty acid elongase，F(xiàn)AE）復(fù)合體催化C16/C18脂肪酸延長合成不同鏈長的超長鏈脂肪酸，最后超長鏈脂肪酸通過脫碳基途徑和?；€原途徑轉(zhuǎn)換成初級醇、烷烴、初級醛、酮類以及次級醛等蠟質(zhì)組分[3,5]。脂肪酸延伸復(fù)合體（FAE）是由β-酮脂酰-CoA合酶（3-ketoacyl-CoA synthase, KCS）、β-酮脂酰-CoA還原酶（3-ketoacyl-CoA reductase, KCR）、β-羥脂酰-CoA脫水酶（3-hydroxacyl-CoA dehydratase, HCD）和反式烯脂酰-CoA還原酶（trans-2, 3-enoyl-CoA reductase, ECR）組成的多酶體系[6]。其中催化第一步縮合反應(yīng)的被認為是延伸反應(yīng)的限速酶，并且具有嚴格的碳鏈長度特異性[7]。水稻基因組中共有34個同源基因，通過蠟質(zhì)相關(guān)突變體的研究，目前已克隆了[8,9]、[10]、[11]、[12,13]等多個基因，這些基因突變都引起超長鏈脂肪酸含量下降，進而導(dǎo)致葉表面的蠟質(zhì)晶體數(shù)量減少。此外，超長鏈脂肪酸含量的下降還影響莖尖分生組織的功能及生長素等信號途徑[8,14,15]，因此這些突變體還表現(xiàn)出器官融合、形態(tài)結(jié)構(gòu)異常等其他表型[16]，其中和突變體在種子萌發(fā)后不久就停止生長。與基因的突變表型相類似，水稻基因突變體的葉色變淺，表皮蠟質(zhì)減少且分布不均勻[17]。水稻基因編碼擬南芥HOTHEAD的同源蛋白，參與長鏈脂肪酸（long chain fatty acids, LCFAs）的合成，基因突變后也引起超長鏈脂肪酸含量下降，植株極端矮小，不能發(fā)育到生殖階段[18,19]。水稻基因參與超長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)換成蠟質(zhì)組分的過程，基因的突變體或干擾植株同樣表現(xiàn)出蠟質(zhì)含量減少，且對干旱的敏感性增強[5,20]。另外，?；D(zhuǎn)移酶編碼基因受osa-miR1848調(diào)控，也參與超長鏈脂肪酸和蠟質(zhì)的生物合成[21]。綜上，雖然多個蠟質(zhì)合成相關(guān)基因被克隆，但水稻中的蠟質(zhì)合成途徑仍不完全清楚。

本實驗室利用化學(xué)誘變水稻品種湘早秈6號，獲得了一個蠟質(zhì)減少的突變體。本研究對突變體開展了形態(tài)學(xué)觀察、遺傳分析、基因定位和相關(guān)基因的表達分析，為進一步闡明水稻蠟質(zhì)合成的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

秈稻湘早秈6號的種子經(jīng)0.5%的甲基磺酸乙酯（Ethylmethylsulfone，EMS）處理，2014年種植于長沙試驗田。種子成熟后每個M1單株收一單穗；2014–2015年種植M2株系于海南三亞基地，每個株系種植20株，觀察各株系的形態(tài)性狀并收種。其中一個株系表現(xiàn)出矮稈、葉片皺褶等明顯形態(tài)異常，該株系經(jīng)2015–2018年連續(xù)自交已穩(wěn)定遺傳，命名為。利用突變體與野生型湘早秈6號正反交，觀察F1的表型，并統(tǒng)計F2群體的分離比例，通過卡方檢驗進行遺傳分析；利用突變體與廣親和粳稻品種02428雜交構(gòu)建F2群體，用于基因定位。

1.2 農(nóng)藝性狀調(diào)查

于成熟期考查野生型和突變體的產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀，3次重復(fù)，每次重復(fù)取5株考種?？疾樾誀畎ㄖ旮摺⒂行霐?shù)、每穗總粒數(shù)、結(jié)實率和千粒重。利用DPS 14.10分析野生型和突變體之間的差異顯著性。

1.3 葉片表面的超微結(jié)構(gòu)觀察

取分蘗期水稻的倒1葉，使用直徑為0.8 cm的打孔器在葉片中央取圓片，迅速放入2.5%（/）的戊二醛溶液中固定，24 h后使用去離子水潤洗樣品3次，每次10 min；將樣品放入1%（/）的鋨酸溶液中繼續(xù)固定，2 h后使用0.1 mol/L磷酸緩沖液清洗3次，每次20 min；依次用梯度濃度的乙醇溶液對樣品脫水，每次15 min；丙酮置換兩次，每次15 min；在臨界點干燥儀（Quorum K850）中干燥后真空噴鍍；將樣品(葉片正面)放在掃描電鏡（HITACHI Regulus 8100）下觀察、拍照。

1.4 基因定位和候選基因預(yù)測

基因定位主要根據(jù)株高和葉片扭曲情況判斷野生型和突變型。以突變體與02428雜交的F2群體為定位群體，采用混合群體分離分析法（Bulked Segregant Analysis，BSA）進行基因的初步定位。采用SDS法提取親本及群體各單株的DNA。從F2群體中各取10株野生型單株和10株突變型單株，各單株取等量DNA混合構(gòu)建兩個混池；利用親本間的多態(tài)性引物擴增兩個基因池，篩選與目標基因連鎖的SSR標記，并利用少量突變型單株在連鎖標記附近進行初定位；根據(jù)初定位結(jié)果，以日本晴和93-11的基因組為參考，比對目標區(qū)間內(nèi)的秈粳基因組序列，找出序列差異后利用DNAMAN 6.0設(shè)計InDel標記引物，在目標區(qū)間繼續(xù)篩選和加密分子標記。利用新的分子標記，對所有突變型單株進行基因型分析，根據(jù)各標記的重組個體數(shù)量進行精細定位。PCR總體積10 μL，含2×PCR預(yù)混試劑5 μL、正反向引物各1 μL（5 μmol/L），DNA模板1 μL，去離子水2 μL。PCR程序如下：94℃下預(yù)變性5 min；94℃下變性30 s、55℃下退火30 s、72℃下延伸30 s，35個循環(huán)；72℃下延伸5 min。根據(jù)基因的功能注釋信息，在精細定位區(qū)間進行候選基因預(yù)測，并比較野生型和突變體的序列差異。

1.5 基因表達檢測

采用Yoshida營養(yǎng)液培養(yǎng)水稻至3葉1心，使用RNA提取試劑盒（Omega，USA）抽提葉片的總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和微量分光光度計（NanoDrop 2000，Thermo）檢測RNA的濃度和完整性。RNA經(jīng)檢測合格后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（HiScript?II Q RT SuperMix，南京諾唯贊）獲得cDNA；基因表達檢測：cDNA模板稀釋5倍后用于熒光定量PCR分析。使用SYBR qPCR Master Mix(Vazyme)作為熒光染料，反應(yīng)體系為20 μL，在熒光定量PCR儀上進行(IQ5，Bio-Rad，USA)。PCR條件如下：95℃下預(yù)變性1 min；95℃下變性10 s，60℃下退火和延伸30 s，40個循環(huán)。引物設(shè)計所用軟件為DNAMAN 6.0，引物序列見表1。以肌動蛋白基因作為內(nèi)參基因，基因表達的相對量采用2–法計算。樣本間的差異顯著性分析采用Student-檢驗。

表1 基因定位及表達分析引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1 wax1突變體的表型分析

形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)突變體除了植株變矮以外，還具有多個異常表型。與野生型相比，突變體的葉片變短變窄、葉表面皺褶、穗長變短且局部扭曲（圖1）。另外，葉片的親水特性在野生型和突變體之間也存在明顯差異，野生型葉片在沾水后形成水珠，而突變體葉片上的水珠則逐漸分散到葉片表面。農(nóng)藝性狀調(diào)查結(jié)果表明（表2），突變體的結(jié)實率與野生型沒有顯著差異，但株高、每穗總粒數(shù)和千粒重都極顯著降低；相反，突變體的有效穗數(shù)極顯著高于野生型。掃描電鏡（SEM）觀察顯示，野生型葉片表明覆蓋有一層致密的蠟質(zhì)晶體，突變體的乳突數(shù)量與野生型相比沒有明顯差異（圖2-A, B），但蠟質(zhì)晶體的數(shù)目明顯減少，特別是乳突上的晶體更加稀疏（圖2-C, D），這可能是葉片發(fā)育異常的主要原因。

2.2 突變體的遺傳分析及基因定位

A，B—野生型和突變體的植株形態(tài)；C—野生型和突變體的穗型；D—野生型和突變體的葉片形態(tài)；E—野生型和突變體葉片沾水后的浸潤特性。

Fig. 1. Morphological traits of the wild type(WT) and its mutant

圖2 野生型和突變體葉片的掃描電鏡圖

Fig. 2. Leaf scanning electron microscopic map of wild type and mutant.

根據(jù)株高和葉片扭曲情況作為突變表型的判斷依據(jù)，突變體與野生型正反交的雜種F1均表現(xiàn)正常，湘早秈6號的F2群體中正常株755株，突變型單株235株，分離比例經(jīng)卡方檢驗符合3∶1（χ2=0.84 < χ2 0.05=3.84）；在湘早秈6號/的F2群體中，正常株732株，突變型單株218株，卡方檢驗正常株與突變型株的分離比例同樣符合3∶1（χ2=2.13 < χ2 0.05=3.84），表明該突變表型受一對隱性核基因控制。

將突變體與廣親和粳稻品種02428雜交，利用F2群體進行基因定位。在F2群體中分別選取10株正常株和10株突變型單株構(gòu)建DNA混池，使用親本間的168對多態(tài)性引物擴增兩個DNA混池，發(fā)現(xiàn)第10染色體上的SSR引物RM271在兩個混池之間有明顯多態(tài)。隨后在RM271附近加密分子標記，利用106個突變型F2單株，將目標基因定位在SSR標記RM5806和InDel標記ID09139之間。進一步擴大突變型單株數(shù)量至809個，根據(jù)日本晴和93-11的基因組序列差異開發(fā)新的InDel標記，最終將目標基因定位在RM5806與InDel標記P1之間，物理距離約為49.8 kb（圖3）。參考日本晴的基因組序列，發(fā)現(xiàn)該區(qū)間內(nèi)共有4個開放閱讀框(open reading frame, ORF)。其中, ORF1、ORF2和ORF3（Os10g0416100，Os10g0416500和Os10g0416800）均編碼幾丁質(zhì)酶，ORF4（Os10g0416200）編碼β-酮脂酰-CoA合酶，是VLCFAs合成途徑中的關(guān)鍵限速酶。測序結(jié)果表明，ORF1-ORF3在野生型和突變體之間沒有序列差異，但突變體在ORF4編碼區(qū)的第863位堿基由T突變成A，導(dǎo)致編碼蛋白的第288位氨基酸由纈氨酸（Val）突變?yōu)樘於彼幔ˋsp）。蛋白結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，ORF4共有兩個外顯子，編碼一個由523個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，該蛋白第96–514位氨基酸為β-酮脂酰-CoA合酶的催化活性中心，該區(qū)域非常保守。因此，預(yù)測ORF4為候選基因。

表2 野生型與突變體wax1的主要農(nóng)藝性狀比較

**表示突變體與野生型之間的差異達0.01顯著水平。

**Difference between the mutant and WT was significant at 0.01 level.

圖3 水稻W(wǎng)AX1基因的精細定位及突變位點

Fig. 3. Fine mapping and the mutantion site of the ricegene.

2.3 水稻生長發(fā)育相關(guān)基因的表達分析

前人研究已經(jīng)證明，KCS基因突變會影響莖尖分生組織（SAM）的功能及生長素信號途徑[8,14]。同源異型盒（KNOTTED1-like homeobox, KNOX）基因在SAM中特異表達，受生長素的負調(diào)控[22]，其表達水平在維持SAM功能和植物正常發(fā)育過程中起到關(guān)鍵作用。

**表示突變體與野生型之間的差異達0.01顯著水平。

Fig. 4. Relative expression level ofandgenes.

鑒于突變體表現(xiàn)出多方面的形態(tài)異常，我們進一步分析基因和生長素相關(guān)基因在突變體中的表達情況。如圖4所示，基因的表達水平在突變體中極顯著上升，約為野生型的2.5倍。生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的表達趨勢并不一致，其中在突變體中顯著下調(diào)表達，而在突變體中的表達水平則高于野生型，其他IAA基因包括，，和的表達在野生型和突變體之間差異不顯著。

3 討論

本研究鑒定了一個水稻蠟質(zhì)減少的突變體，葉片沾水后表現(xiàn)出浸潤特性，掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)突變體表皮的蠟質(zhì)晶體明顯減少。我們通過圖位克隆方法定位并預(yù)測了候選基因，該基因編碼β-酮脂酰-CoA合酶，與基因[10]等位，但突變體的表型特點與差別較大。突變體的葉片之間相互融合，表面觀察不到正常的乳突形態(tài)，且種子萌發(fā)后不久就停止生長；突變體葉表面的蠟質(zhì)晶體雖然減少，但乳突形態(tài)清晰可見，植株能發(fā)育到生殖生長階段并正常結(jié)實。這些表型差異可能與基因的突變位置有關(guān)，Ghanevati等[23]發(fā)現(xiàn)，擬南芥FAE1/KCS18的第222位半胱氨酸，第389位組氨酸和第422位的天冬酰胺非常保守，這些特定氨基酸的突變會顯著降低KCS的催化活性；Wang等[12]發(fā)現(xiàn)WSL4蛋白第228位的絲氨酸在與OsCER2的互作過程中起重要作用，基因的不同等位突變體和具有不同的蠟質(zhì)組分，說明不同突變位點的功能有差異。突變體在第2外顯子內(nèi)有一個16 bp的缺失，而本研究中突變體僅有一個核苷酸的突變，推測該突變可能并未使蛋白失活，而只是降低了酶的活性或影響了與其他蛋白的互作。與突變體的表型特點類似，葉片表面的蠟質(zhì)晶體減少，植株能開花結(jié)實，T-DNA插入位點位于基因的5′-UTR區(qū)域，可能影響蛋白的翻譯水平[11]。但是的結(jié)實率顯著降低，而突變體的結(jié)實率與野生型沒有顯著差異，推測這可能與不同KCS蛋白的底物特異性和組織特異性有關(guān)。

VLCFAs主要在表皮細胞中合成，然后分泌到胞外形成角質(zhì)層。植物的表皮細胞除承擔保護功能外，還參與調(diào)控SAM的功能和組織器官發(fā)育[24,25]。本研究中的突變體除蠟質(zhì)減少以外，還表現(xiàn)出株高變矮、葉片窄小皺褶、穗長變短等多種形態(tài)異常，可能是因為突變引起的SAM功能受損引起的。前人研究表明，組織器官的發(fā)生與SAM中基因的下調(diào)和生長素的積累有密切關(guān)系[26]?；蚴且活惥S持分生組織功能的重要基因，主要在未分化的細胞中表達，在分化出的其他組織器官中表達水平較低[27]。基因突變會導(dǎo)致分生組織缺失的表型[28,29]，但過量表達也會引起葉片形態(tài)異常等表型。本研究發(fā)現(xiàn)，基因在突變體中顯著上調(diào)表達，一部分生長素誘導(dǎo)表達基因IAA在野生型和突變體間差異表達，表達趨勢與[8,9]、[10]突變體中相關(guān)基因的基本一致。我們根據(jù)這些研究結(jié)果推測，基因突變可能引起VLCFAs的合成受阻，一方面減少表面蠟質(zhì)晶體的形成，另一方面通過影響SAM和生長素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)引起植株形態(tài)異常。

[1] Lee S B, Suh M C. Advances in the understanding of cuticular waxes inand crop species[J]., 2015, 34(4): 557-572.

[2] Yeats T H, Rose J K C. The formation and function of plant cuticles[J]., 2013, 163(1): 5-20.

[3] 陳偉, 劉德春, 楊莉, 劉山蓓, 劉勇. 植物表皮蠟質(zhì)及相關(guān)基因研究進展[J]. 植物生理學(xué)報, 2016, 52 (8): 1117-1127.

Chen W, Liu D C, Yang L, Liu S B, Liu Y. Advances in studies on plant epidermal wax and related genes[J]., 2016, 52(8): 1117-1127. (in Chinese with English abstract).

[4] 楊賢鵬, 王宙雅, 高翔, 李榮俊, 呂世友. 植物表皮蠟質(zhì)生物合成及調(diào)控[J]. 中國生物工程雜志, 2016, 36(9): 75-80.

Yang X P, Wang Z Y, Gao X, Li R J, Lü S Y. Biosynthesis and regulation of wax in plant epidermis[J]., 2016, 36(9): 75-80. (in Chinese with English abstract).

[5] Zhou L, Ni E, Yang J, Zhou H, Liang H, Li J, Jiang D, Wang Z, Liu Z, Zhuang C. Riceis involved in leaf cuticular wax accumulation and drought resistance[J]., 2013, 8(5): e65139.

[6] 倪郁, 郭彥軍. 植物超長鏈脂肪酸及角質(zhì)層蠟質(zhì)生物合成相關(guān)酶基因研究現(xiàn)狀[J]. 遺傳, 2008, 30(5): 561-567.

Ni Y, Guo Y J. Progress in the study on genes encoding enzymes involved in bio-synthesis of very long chain fatty acids and cuticular wax in plants[J]., 2008, 30(5): 561-567. (in Chinese with English abstract).

[7] Millar A, Kunst L. Very-long-chain fatty acid biosynthesis is controlled through the expression and specificity of the condensing enzyme[J]., 2010, 12(1): 121-131.

[8] Tomoaki T, Yukihiro I. Altered expression of auxin-related genes in the fatty acid elongase mutantof rice[J]., 2011, 6(6): 887-888.

[9] Yukihiro I, Fumiko K, Kazuma H, Katsutoshi T, Tomoaki T, Mitsugu E, Kiyotaka N, Nori K. Fatty acid elongase is required for shoot development in rice[J]., 2011, 66: 680-688.

[10] Tsuda K, Akiba T, Kimura F, Ishibashi M, Moriya C, Nakagawa K, Kurata N, Ito Y. ONION2 fatty acid elongase is required for shoot development in rice[J]., 2013, 54(2): 209-217.

[11] Yu D, Ranathunge K, Huang H, Pei Z, Franke R, Schreiber L, He C.encodes a-ketoacyl CoA synthase involved in biosynthesis of cuticular waxes on rice leaf[J]., 2008, 228(4): 675-685.

[12] Wang X, Guan Y, Zhang D, Dong X, Tian L, Qu L Q. A-ketoacyl-CoA synthase is involved in rice leaf cuticular wax synthesis and requires a CER2-LIKE protein as a cofactor[J]., 2016, 173(2): 944-955.

[13] Gan L, Zhu S, Zhao Z, Liu L, Wang X, Zhang Z, Zhang X, Wang J, Wang J, Guo X., encoding a-ketoacyl-coenzyme A synthase 6, is involved in rice cuticular wax accumulation[J]., 2017, 36(10): 1655-1666.

[14] Tsuda K, Ito Y, Yamaki S, Miyao A, Hirochika H, Kurata N. Isolation and mapping of three rice mutants that showed ectopic expression ofgenes in leaves[J]., 2009, 177(2): 131-135.

[15] Yamauchi T, Shiono K, Nagano M, Fukazawa A, Ando M, Takamure I, Mori H, Nishizawa N K, Kawaiyamada M, Tsutsumi N. Ethylene biosynthesis is promoted by very-long-chain fatty acids during lysigenous aerenchyma formation in rice roots[J]., 2015, 169(1): 180-193.

[16] Nobusawa T, Okushima Y, Nagata N, Kojima M, Sakakibara H, Umeda M. Synthesis of very-long-chain fatty acids in the epidermis controls plant organ growth by restricting cell proliferation[J]., 2013, 11(4): e1001531.

[17] Lu G, Wang X, Cheng Z, Liu L, Wang J, Zhe Z, Ren Y, Lei C, Zhao Z, Zhu S.encoding a-ketoacyl-CoA reductase is involved in cuticular wax biosynthesis in rice[J]., 2016, 35(8): 1687-1698.

[18] Fang Y, Hu J, Xu J, Yu H, Shi Z, Xiong G, Zhu L, Zeng D, Zhang G, Gao Z. Identification and characterization of, a gene regulating rice shoot development[J]., 2015, 57(2): 151-161.

[19] Akiba T, Hibara K, Kimura F, Tsuda K, Shibata K, Ishibashi M, Moriya C, Nakagawa K, Kurata N, Itoh J. Organ fusion and defective shoot development inmutants of rice[J]., 2014, 55(1): 42-51.

[20] Mao B, Cheng Z, Lei C, Xu F, Gao S, Ren Y, Wang J, Zhang X, Wang J, Wu F., a rice homologue of, is involved in synthesis of leaf cuticular wax[J]., 2012, 235(1): 39-52.

[21] Xia K, Ou X, Gao C, Tang H, Jia Y, Deng R, Xu X, Zhang M.involved in cuticular wax biosynthesis is regulated by[J]., 2015, 38(12): 2662-2673.

[22] Tabata R, Ikezaki M, Fujibe T, Aida M, Tian C, Ueno Y, Yamamoto K T, Machida Y, Nakamura K, Ishiguro S.AUXIN RESPONSE FACTOR6 and 8 regulate jasmonic acid biosynthesis and floral organ development via repression of class 1genes[J]., 2010, 51(1): 164-175.

[23] Mahin G, Jaworski J G. Engineering and mechanistic studies of theFAE1 beta-ketoacyl-CoA synthase, FAE1 KCS[J]., 2010, 269(14): 3531-3539.

[24] Takada S, Iida H. Specification of epidermal cell fate in plant shoots[J]., 2014, 5: 49.

[25] Knauer S, Holt a L, Rubiosomoza I, Tucker E J, Hinze A, Pisch M, Javelle M, Timmermans M C P, Tucker M R, Laux T. A protodermal miR394 signal defines a region of stem cell competence in theshoot meristem[J]., 2013, 24(2): 125-132.

[26] Rast M I, Simon R.acts withto coordinateandexpression in shoot and root meristems[J]., 2012, 24(7): 2917-2933.

[27] Ito Y, Eiguchi M, Kurata N.homeobox genes are sufficient in maintaining cultured cells in an undifferentiated state in rice[J]., 2001, 30(4): 231-238.

[28] Tsuda K, Ito Y, Sato Y, Kurata N. Positive autoregulation of agene is essential for shoot apical meristem maintenance in rice[J]., 2011, 23(12): 4368-4381.

[29] Kerstetter R A, Laudenciachingcuanco D, Smith L G, Hake S. Loss-of-function mutations in the maize homeobox gene,, are defective in shoot meristem maintenance[J]., 1997, 124(16): 3045-3054.

Identification and Genetic Analysis of Waxy Sparse Mutantin Rice

PAN Xiaowu, LI Yongchao, LIU Wenqiang, XIONG Haibo, DONG Zheng, XUE Dan, SHENG Xinnian, ZHAO Wenjin, WEI Xiucai, LI Xiaoxiang*

(Hunan Rice Research Institute, Hunan Academy of Agricultural Sciences; Key Laboratory of indica Rice Genetics and Breeding in the Middle and Lower Reaches of Yangtze River Valley, Ministry of Agriculture, Changsha 410125;*Corresponding author, E-mail: xiaoxiang66196@126.com)

【Objective】Wax is an important protective substance on plant surface.Screening and identification of waxy-related mutants help elucidate the genetic mechanism of waxy synthesis in rice. 【Method】A waxy sparse mutant,, was isolated from an ethylmethylsulfone (EMS) mutagenic population of Xiangzaoxian 6. The morphological characteristics and agronomic traits ofmutant were analyzed. The F2segregating population was constructed from a cross betweenandvariety 02428, and the recessive individuals were selected for fine mapping ofgene. In addition, the expressions of related genes were analyzed by quantitative PCR. 【Results】Compared with the wild type,mutant showed many morphological abnormalities, including small wrinkled leaves, shorter panicle and reduced waxy crystals on leaf surface. Themutant was also featured by increased effective panicle number, and obviously decreased plant height, 1000-grain weight and number of grains per panicle. Genetic analysis implied that the mutant phenotype was controlled by a pair of recessive nuclear gene. Thegene was fine-mapped to a 49.8 kb interval between markers RM5806 and P1 on the chromosome 10. A total of 4 ORFs (open reading frames) were found in this region. Sequencing analysis indicated that a single base transition was present in the coding region of 3-ketoacyl-CoA synthase, which resulted in an amino acid substitution. In addition, mutation ofincreased the expression ofgene, and caused differential expressions of some IAA genes. 【Conclusion】Thegene mutation resulted in the decrease of waxy crystals on leaf surface and abnormalities in plant growth and development through affecting shoot apex meristem and auxin signal transduction.

rice; waxy; gene mapping; auxin

Q755; S511.01 獻標識碼：A

1001-7216(2020)01-0001-07

10.16819/j.1001-7216.2019. 9101

2019-09-16；

2019-10-27。

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-01-14)；國家自然科學(xué)基金資助項目(31801335)；湖南省重點研發(fā)計劃資助項目(2017NK2020)；湖南創(chuàng)新型省份建設(shè)專項(2019RS2047)。