石 薇 張素敏 王曉聞 賈治勇

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 山西太谷 030801）

單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）在自然界廣泛存在，是一種兼性厭氧細(xì)菌，同時(shí)也是一種常見的食源性致病菌，具有致命性[1-2]。單增李斯特菌能在2～42℃的環(huán)境下生存，最合適的生長環(huán)境溫度為30～37℃。由該種菌引起的疾病被稱為李斯特菌病，致死率高達(dá)30%左右[3-7]。李斯特菌被WHO列為20世紀(jì)90年代四大食用致病菌之一，同時(shí)也是對中國人的衛(wèi)生健康具有嚴(yán)重威脅的12種病原微生物之一[8]。我國對于食源性單增李斯特菌的檢測十分重視。目前，致病菌檢驗(yàn)多采用傳統(tǒng)的檢測方法、PCR方法及實(shí)時(shí)熒光PCR法等。傳統(tǒng)的檢測方法一般需要5～7 d，周期長，過程繁瑣；PCR方法及實(shí)時(shí)熒光PCR方法雖然操作簡單，但需要待檢樣品中菌體達(dá)到較高濃度[9-13]。免疫磁性微球選擇性好、特異性強(qiáng)，能快速富集濃縮細(xì)菌，可以有效避免或減少漏檢，縮短檢測時(shí)間，且可去除食品樣品中抑制PCR擴(kuò)增的成分。本研究先制備免疫磁性糊精微球，通過與其菌體抗原進(jìn)行特異性的結(jié)合而快速且大量的捕獲單増李斯特菌，建立一種快速、靈敏的食源性致病菌檢測方法。

1 試驗(yàn)材料

1.1 材料與試劑

單增李斯特菌（CMCC54001），山西省生物研究所。

抗體Rb a listeria tropina，博奧森生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒50次，天根生化科技有限公司；50×TAE Buffer、核酸染料、BM 2000 DNA Marker，北京博邁德基因技術(shù)有限公司；環(huán)氧氯丙烷、氫氧化鈉、硫代硫酸鈉、瓊脂、氯化鈉、牛肉膏等均為分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

KS50R臺式高性能冷凍離心機(jī)，凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；GS-1860凝膠成像系統(tǒng)，北京麥思高科技有限公司；DYCZ-20A電泳槽、WD-9408E電泳儀，北京市六一儀器廠；UV-2100紫外可見分光光度計(jì)，上海尤尼柯儀器有限責(zé)任公司；HZQF160全溫振蕩培養(yǎng)箱，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；PYX-Ⅱ隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

2 試驗(yàn)方法

2.1 磁性糊精微球的制備

稱取一定量的糊精、NaOH，加入一定量的蒸餾水，置于85℃水浴鍋中糊化30min，直至深紅色為止即為水相。以正己烷為油相，加入一定量的表面活性劑司班60和吐溫60，再加入一定量的助表面活性劑正戊醇。將一定量的水相滴加到油相中并不停地?cái)嚢瑁尤肴姿徕c、磁粉，超聲波振蕩直至磁粉溶解。在60℃溫度下的水浴鍋中反應(yīng)3 h，隨后在85℃的溫度下破乳0.5 h后倒去油相。水相用無水乙醇、乙酸乙酯反復(fù)洗滌直至殘留油相消失，烘箱內(nèi)烘干后待用[14]。

2.2 免疫磁性微球的制備

2.2.1 磁性糊精微球的活化 將烘干后的糊精微球用蒸餾水浸泡溶脹，將水濾凈后加入適宜濃度的NaOH溶液，將一定量的環(huán)氧氯丙烷邊攪拌邊滴加到液體中，30℃振蕩一定時(shí)間，將溶液去掉。用丙酮和蒸餾水洗滌數(shù)次，直至淋洗液中加入硫代硫酸鈉和酚酞指示劑無明顯顏色變化即可，得到的球就是活化后的磁性糊精微球[15]。

2.2.2 活化后的磁性糊精微球環(huán)氧密度的測定 環(huán)氧基可與硫代硫酸鈉反應(yīng)，活化好的磁性糊精微球先與硫代硫酸鈉發(fā)生反應(yīng)，然后用鹽酸滴定反應(yīng)生成的OH-。定義環(huán)氧密度（Epoxy density，EPD）為每克活化磁性糊精微球中含有環(huán)氧基的μmol數(shù)?；罨蟮拇判院⑶蚣尤?mL 1.3 mol/L的Na2S2O3，室溫下反應(yīng)2 h后加入5 mL H2O，用0.1mol/L的HCl滴定。環(huán)氧密度（μmol/mg）=C×V×1 000/M（1）式中，C——HCl濃度，mol/L；V——滴定消耗HCl體積，L；M——磁性糊精微球質(zhì)量，g。

2.2.3 各因素對磁性糊精微球環(huán)氧密度的影響 在環(huán)氧氯丙烷活化磁性糊精微球的過程中，反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)體系中氫氧化鈉的濃度與環(huán)氧氯丙烷的用量是影響反應(yīng)的幾個(gè)重要因素，為得到最佳活化條件，對這幾個(gè)因素做了考察。

1）環(huán)氧氯丙烷的用量對磁性糊精微球環(huán)氧密度的影響 按照2.2.1的方法活化磁性糊精微球。其它條件不變，改變環(huán)氧氯丙烷的用量來活化微球，考察環(huán)氧氯丙烷的用量對磁性糊精微球環(huán)氧密度的影響。固定NaOH溶液濃度為2mol/L，30℃下振蕩5 h，環(huán)氧氯丙烷用量分別為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mL/g的條件下活化磁性糊精微球，然后將活化好的磁性糊精微球按照2.2.2的方法，測定環(huán)氧氯丙烷的用量對磁性糊精微球環(huán)氧密度的影響。

2）NaOH溶液濃度對磁性糊精微球環(huán)氧密度的影響 按照2.2.1的方法活化磁性糊精微球。其它條件不變，改變NaOH溶液濃度來活化微球，考察NaOH溶液濃度對磁性糊精微球環(huán)氧密度的影響。固定環(huán)氧氯丙烷的用量為0.4mL/g，30℃下振蕩 5 h，NaOH 溶液濃度分別為1.0，1.5，2.0，2.5，3.0mol/L的條件下活化磁性糊精微球。然后將活化好的磁性糊精微球按照2.2.2的方法，測定NaOH溶液濃度對磁性糊精微球環(huán)氧密度的影響。

3）反應(yīng)時(shí)間對磁性糊精微球環(huán)氧密度的影響 按照2.2.1的方法活化磁性糊精微球。其它條件不變，改變反應(yīng)時(shí)間來活化微球，考察反應(yīng)時(shí)間對磁性糊精微球環(huán)氧密度的影響。固定環(huán)氧氯丙烷的用量為0.4mL/g，NaOH溶液濃度為2mol/L，30℃下，反應(yīng)時(shí)間分別為1，3，5，7，9 h的條件下活化磁性糊精微球。然后將活化好的磁性糊精微球按照2.2.2的方法，測定反應(yīng)時(shí)間對磁性糊精微球環(huán)氧密度的影響。

2.2.4 免疫磁性糊精微球的制備 由PBST溶液（含0.05%吐溫20，pH 7.4）作為反應(yīng)的偶聯(lián)緩沖液，取0.5mg已活化的磁性糊精微球，用活化緩沖液洗滌后，用偶聯(lián)緩沖液洗滌數(shù)遍，再加入450 μL偶聯(lián)緩沖液和50μL抗體溶液，在適當(dāng)?shù)臏囟认路磻?yīng)一段時(shí)間，使得磁性糊精微球表面上的羥基基團(tuán)同抗體上的氨基基團(tuán)相互結(jié)合，將抗體偶聯(lián)到磁性糊精微球表面上[2]。得到的微球就是所需要的免疫磁性糊精微球。

2.2.5 各因素對免疫磁性糊精微球制備的影響

1）偶聯(lián)抗體時(shí)最佳抗體質(zhì)量濃度的選擇取5個(gè)EP管，將0.5mg已經(jīng)活化過的磁性糊精微球加入管中。洗滌后加入450μL偶聯(lián)緩沖液進(jìn)行重懸。在5個(gè)EP管中分別加入50μL質(zhì)量濃度分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5mg/mL的抗體溶液，使磁性糊精微球表面的羧基同抗體上的氨基在28℃下反應(yīng)2.5 h。反應(yīng)后的免疫磁性糊精微球用PBS緩沖液多次淋洗，直至在波長280 nm處的吸光值為零時(shí)，停止淋洗，收集淋洗液并定容。在波長280 nm和260 nm處測其淋洗液的吸光值，利用蛋白質(zhì)濃度公式（蛋白質(zhì)濃度=1.45A260-0.74A280）計(jì)算剩余抗體量，利用交聯(lián)率公式確定最佳質(zhì)量抗體濃度。

2）偶聯(lián)抗體時(shí)最佳偶聯(lián)時(shí)間的選擇 取6個(gè)EP管，將0.5mg已經(jīng)活化過的磁性糊精微球加入管中。將其洗滌后，加入450μL偶聯(lián)緩沖液進(jìn)行重懸。分別在6個(gè)EP管中加入50μL質(zhì)量濃度為1mg/mL的抗體溶液，使磁性糊精微球表面的羥基同抗體上的氨基在28℃下反應(yīng)0.5，1，1.5，2，2.5，3 h。反應(yīng)后的免疫磁性糊精微球用PBS緩沖液多次淋洗，直至在波長280 nm處的吸光值為零時(shí)，停止淋洗，收集淋洗液并定容。在波長280 nm和260 nm處測其淋洗液的吸光值，利用蛋白質(zhì)濃度公式（蛋白質(zhì)濃度=1.45A260-0.74A280）計(jì)算剩余抗體量，利用交聯(lián)率公式確定最佳偶聯(lián)時(shí)間。

3）偶聯(lián)抗體時(shí)最佳偶聯(lián)溫度的選擇 取6個(gè)EP管，將0.5mg已經(jīng)活化過的磁性糊精微球加入管中。洗滌后加入450μL偶聯(lián)緩沖液進(jìn)行重懸。分別在6個(gè)EP管中加入50μL質(zhì)量濃度為1 mg/mL抗體溶液，使磁性糊精微球表面的羧基同抗體上的氨基在 5，15，20，25，30，35℃下反應(yīng) 2.5 h。反應(yīng)后的免疫磁性糊精微球用PBS緩沖液多次淋洗，直至在波長280 nm處的吸光值為零時(shí)，停止淋洗，收集淋洗液并定容。在波長280 nm和260 nm處測其淋洗液的吸光值。利用蛋白質(zhì)濃度公式（蛋白質(zhì)濃度=1.45A260-0.74A280）計(jì)算剩余抗體量，利用交聯(lián)率公式確定最佳偶聯(lián)溫度。

2.3 免疫磁性糊精微球捕獲單增李斯特菌

2.3.1 免疫磁性糊精微球捕獲單增李斯特菌時(shí)各個(gè)因素的影響 免疫磁性糊精微球的用量和捕獲時(shí)間是捕獲單增李斯特菌時(shí)的關(guān)鍵性因素。在前期準(zhǔn)備試驗(yàn)中得知捕獲時(shí)菌液的濃度為102，103，104CFU/mL時(shí)，涂布前、后計(jì)數(shù)效果最好。以下試驗(yàn)中菌液濃度均為這3種菌液濃度。制備好的免疫磁性糊精微球包被在PBST緩沖液中。

1）捕獲單增李斯特菌時(shí)免疫糊精微球最佳用量選擇 取5個(gè)EP管，加入100μL一定濃度的單增李斯特菌菌液，每個(gè)管分別加入50，100，150，200，250μL的免疫磁性糊精微球，在 25℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中反應(yīng)1 h。外加磁場作用于免疫磁性糊精微球，將懸浮液及用適量的緩沖液重復(fù)洗滌3次的懸浮液置于另一個(gè)EP管中。將每個(gè)EP管中的剩余菌液在LB平板上涂布，37℃下培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)，利用捕獲率公式得到免疫磁性糊精微球的最佳用量。

2）捕獲單增李斯特菌時(shí)的最佳時(shí)間選擇 取5個(gè)EP管，分別加入100μL一定濃度的單增李斯特菌菌液，每個(gè)管加入100μL包被后的免疫磁性糊精微球，在25℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中反應(yīng)0.5，1，1.5，2，2.5 h。外加磁場作用于免疫磁性糊精微球，將懸浮液及用適量的緩沖液重復(fù)洗滌3次的懸浮液置于另一個(gè)EP管中。將每個(gè)EP管中的剩余菌液在LB平板上涂布，37℃溫度下培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)，利用捕獲率公式得到免疫磁性糊精微球捕獲菌的最佳時(shí)間。

2.3.2 捕獲后DNA的提取 取6個(gè)EP管，分別依次加入 100 μL 濃度為101，102，103，104，105，106CFU/mL的單增李斯特菌菌液，每個(gè)管分別加入100μL免疫磁性糊精微球，在25℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中反應(yīng)1 h。采用同濃度的沙門氏菌作為對照組。外加磁場作用于免疫磁性糊精微球，待沉淀與懸浮液完全分離，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書上的方法，分別提取沉淀與懸浮液中的DNA。

2.3.3 瓊脂糖凝膠電泳 用膠帶封住塑料托盤開放的兩端，形成模具，置一水平面上；準(zhǔn)確稱量0.5 g瓊脂糖干粉加到盛有50mL TAE電泳緩沖液的三角瓶中，在電爐上加熱至瓊脂糖熔化，放置常溫冷卻，再加熱，如此反復(fù)溶解3～5次，排出氣泡；將熔化的凝膠稍冷卻后加入溴化乙錠（10mg/mL）5 μL使終質(zhì)量濃度為0.5μg/mL，輕輕地旋轉(zhuǎn)以充分混勻凝膠溶液；將梳子放在托盤上形成符合要求的加樣孔，把溫?zé)岬沫傊悄z溶液倒入模具，凝膠厚度為3～5 mm；讓凝膠完全凝結(jié)，小心拔出梳子，輕輕撕去封邊膠帶，將凝膠安放到電泳槽內(nèi)。向電泳槽加入電泳緩沖液，剛好沒過凝膠約1 mm；混合 5μL DNA模板和1μL 6×Loading-Buffer后，加入凝膠的加樣孔內(nèi)，對照為BM 2000 DNA Marker；蓋上電泳槽蓋，接好電極插頭，110 V電泳15 min。電泳完成后，將凝膠板放在成像系統(tǒng)中觀察，并拍照。

2.3.4 PCR擴(kuò)增 根據(jù)單增李斯特菌的基因序列，選取溶血素hlyA基因序列作為引物的基礎(chǔ)，用Beacon Designer軟件設(shè)計(jì)引物，并由北京全式金生物有限公司進(jìn)行合成，引物具體序列如表1所示。

表1 PCR引物序列Table1 Primer sequences for PCR

以提取的DNA為模板，采用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[11]。擴(kuò)增條件：94℃變性5min，之后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)（94℃ 40 s，50℃ 30 s，72℃ 1min 30 s），最后72℃延伸10min。再用TAE配制1%瓊脂糖凝膠，取5μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并用凝膠成像系統(tǒng)記錄電泳圖。

圖1 環(huán)氧氯丙烷用量對磁性糊精微球環(huán)氧密度的影響Fig.1 Effect of epichlorohydrin amount on epoxy density of magnetic starch microspheres

3.1.3 反應(yīng)時(shí)間對磁性糊精微球環(huán)氧密度的影響 由圖3可知，反應(yīng)時(shí)間對磁性糊精微球上環(huán)氧密度有重要影響，在30℃反應(yīng)5 h，可獲得最高環(huán)氧密度。在反應(yīng)初期，糊精微球上環(huán)氧密度隨時(shí)間的延長而增加；反應(yīng)5 h以后，糊精微球上環(huán)氧密度開始降低。這可能是由于活化反應(yīng)是在水相中

3 結(jié)果與分析

3.1 磁性糊精微球的活化

3.1.1 環(huán)氧氯丙烷的用量對磁性糊精微球環(huán)氧密度的影響 從圖1可以看出，在一定范圍內(nèi)，反應(yīng)體系中環(huán)氧氯丙烷的添加量越多，環(huán)氧密度（EPD）越高，且其曲線關(guān)系接近線性，當(dāng)環(huán)氧氯丙烷用量為0.40mL/g時(shí)，環(huán)氧密度達(dá)到最大，繼續(xù)增加環(huán)氧氯丙烷用量，環(huán)氧密度反而略微下降，這可能是由于溶液中游離過多的環(huán)氧基導(dǎo)致已活化微球表面的環(huán)氧基相互交聯(lián)，或是發(fā)生開環(huán)等一系列副反應(yīng)，造成環(huán)氧密度下降。因此合適的環(huán)氧氯丙烷用量為0.40mL/g。

3.1.2 NaOH溶液濃度對磁性糊精微球環(huán)氧密度的影響 圖2中數(shù)據(jù)顯示，反應(yīng)體系中氫氧化鈉的濃度為2mol/L時(shí)，環(huán)氧密度（EPD）最大。NaOH在此反應(yīng)中起催化作用，濃度過低，不利于反應(yīng)的進(jìn)行，活化反應(yīng)不完全；濃度過高，有更多的環(huán)氧氯丙烷參與反應(yīng)，而環(huán)氧氯丙烷自身的水解反應(yīng)速度增加，使磁性糊精微球的活化程度降低，另外，NaOH濃度過高可能會(huì)使已活化的磁性糊精微球上的環(huán)氧基發(fā)生開環(huán)反應(yīng)，導(dǎo)致環(huán)氧密度降低。因此活化磁性糊精微球選擇2.0 mol/L的NaOH濃度最為適宜。進(jìn)行，而環(huán)氧氯丙烷難溶于水，這使它在水相中的濃度很低，而且環(huán)氧氯丙烷要靠擴(kuò)散到達(dá)磁性糊精微球表面與羥基反應(yīng)，所以反應(yīng)需要一定的時(shí)間才能使環(huán)氧密度達(dá)到最大值，然而時(shí)間過長，已活化的磁性糊精微球上的環(huán)氧基會(huì)發(fā)生交聯(lián)或水解開環(huán)等副反應(yīng)，造成環(huán)氧密度降低。

圖2 NaOH濃度對磁性糊精微球環(huán)氧密度的影響Fig.2 Effect of NaOH concentration on epoxy density of magnetic starch microspheres

3.2 免疫磁性糊精微球的制備與優(yōu)化

3.2.1 不同因素對免疫磁性糊精微球制備的影響 根據(jù)各個(gè)樣品所測定的吸光值，利用蛋白質(zhì)濃度公式（蛋白質(zhì)濃度=1.45A260-0.74A280）確定淋洗液中的抗體含量，從而得到磁性糊精微球所偶聯(lián)的抗體量，根據(jù)交聯(lián)公式得到交聯(lián)率：交聯(lián)率=（原始反應(yīng)抗體量-淋洗液中抗體量）/原始反應(yīng)抗體量

1）制備免疫磁性糊精微球時(shí)抗體質(zhì)量濃度的影響 由圖4的5個(gè)不同抗體質(zhì)量濃度環(huán)境下的磁性糊精微球交聯(lián)率來看，抗體質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，磁性糊精微球偶聯(lián)效果明顯要優(yōu)于抗體質(zhì)量濃度為0.5mg/mL的偶聯(lián)效果，基本上與1.5，2.0，2.5mg/mL這3種抗體質(zhì)量濃度的偶聯(lián)效果相當(dāng)。再者因?yàn)榭贵w本身是一種比較昂貴的生物試劑，結(jié)合應(yīng)用的成本考慮，將最佳偶聯(lián)抗體的質(zhì)量濃度選擇為1.0mg/mL。

圖3 反應(yīng)時(shí)間對磁性糊精微球環(huán)氧密度的影響Fig.3 Effect of reaction time on epoxy density of magnetic starch microspheres

2）制備免疫磁性糊精微球時(shí)偶聯(lián)時(shí)間的影響 由圖5可知，在偶聯(lián)時(shí)間為0.5～2 h時(shí)，隨著時(shí)間的延長磁性糊精微球的交聯(lián)率逐漸增加；當(dāng)偶聯(lián)時(shí)間由2 h到3 h時(shí)，交聯(lián)率有所降低。這是因?yàn)榭贵w是一種具有生物活性的物質(zhì)，在室溫放置過久容易失活。

3）制備免疫磁性糊精微球時(shí)偶聯(lián)溫度的影響 從圖6可知，偶聯(lián)溫度為5℃時(shí)，偶聯(lián)的磁性糊精微球在偶聯(lián)率上效果比較差，交聯(lián)率在35%左右，達(dá)不到理想的效果；磁性糊精微球在偶聯(lián)溫度為25℃的免疫磁性糊精微球交聯(lián)率更高，說明獲得的產(chǎn)物性能更優(yōu)。

圖4 抗體質(zhì)量濃度對交聯(lián)率的影響Fig.4 Effect of antibody mass concentrations on the degree of cross linking

圖5 偶聯(lián)時(shí)間對交聯(lián)率的影響Fig.5 Effect of coupling time on the degree of cross linking

圖6 偶聯(lián)溫度對交聯(lián)率的影響Fig.6 Effect of coupling temperature on the degree of cross linking

3.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定各因素的最佳用量范圍，設(shè)計(jì)了以抗體質(zhì)量濃度、偶聯(lián)時(shí)間、偶聯(lián)溫度組成的3因素3水平正交試驗(yàn)。如表2、3所示。

由表3的極差分析可知，抗體濃度對制備免疫磁性糊精微球的影響最大，對其它各因素也有不同程度的影響?？疾榈?個(gè)因素對制備免疫磁性糊精微球的影響大小為：抗體質(zhì)量濃度＞偶聯(lián)溫度＞偶聯(lián)時(shí)間。制備免疫磁性糊精微球的較優(yōu)條件為A2B3C3，即抗體質(zhì)量濃度為1.0mg/mL，偶聯(lián)溫度為28℃，偶聯(lián)時(shí)間為2.5 h。正交分析與試驗(yàn)結(jié)果并不一致，需進(jìn)一步驗(yàn)證，2組試驗(yàn)對比后可知，制備免疫磁性糊精微球的最優(yōu)條件是抗體質(zhì)量濃度為1.0mg/mL，偶聯(lián)溫度為28℃，偶聯(lián)時(shí)間為2.5 h。

由表4的方差分析可知，抗體質(zhì)量濃度對制備免疫磁性糊精微球的影響顯著，偶聯(lián)時(shí)間和偶聯(lián)溫度對制備免疫磁性微球的影響不顯著。3個(gè)因素對制備磁性糊精微球的影響大小依次是：抗體質(zhì)量濃度、偶聯(lián)溫度、偶聯(lián)時(shí)間。

表2 正交試驗(yàn)的因素和水平Table2 Factors and levels of orthogonal experiment

表3 制備免疫磁性糊精微球的正交表L9（33 ）與試驗(yàn)結(jié)果Table3 Preparation of immunomagnetic starch microspheres orthogonal table L9（33 ）and experimental results

表4 制備免疫磁性糊精微球的正交試驗(yàn)方差分析Table4 Variance analysis of orthogonal test for preparing immunomagnetic dextrin microspheres

3.3 免疫磁性糊精微球捕獲單增李斯特菌時(shí)各個(gè)因素的影響

通過對比捕獲后殘余菌液涂布平板與原菌液涂布平板所得到的菌落數(shù)，進(jìn)而算出原菌液與捕獲后菌液中各自的菌體數(shù)，利用捕獲率公式：

捕獲率=（捕獲前菌液菌體數(shù)-捕獲后菌液菌體數(shù)）/捕獲前菌液菌體數(shù)

得到免疫磁性糊精微球捕獲單増李斯特菌的捕獲率。

3.3.1 捕獲單增李斯特菌時(shí)免疫微球用量的影響 如圖7所示，在5種菌液濃度下，當(dāng)免疫磁性糊精微球用量從50μL變?yōu)?00μL時(shí)，免疫磁性糊精微球的捕獲率不斷增大；繼續(xù)增大免疫磁性糊精微球的用量直到250μL時(shí)，捕獲率基本沒有變化，免疫磁性糊精微球用量從100μL到250 μL時(shí)，對其捕獲效率影響很小，后者都較為接近，變化幾乎為零。因此確定100μL免疫磁性糊精微球?yàn)橛糜诓东@樣品中的單增李斯特菌的最佳用量。

3.3.2 免疫磁性糊精微球捕獲單增李斯特菌時(shí)捕獲時(shí)間的影響 如圖8所示，在3種菌液濃度中，免疫磁性糊精微球捕獲時(shí)間從0.5 h到1 h時(shí)，捕獲效率逐漸提高；當(dāng)捕獲時(shí)間達(dá)到1 h時(shí)，免疫磁性糊精微球的捕獲效率達(dá)到最大值，且繼續(xù)延長捕獲時(shí)間，捕獲效率幾乎不會(huì)增加。由于單增李斯特菌在2～42℃的溫度環(huán)境條件下均可生長，如果捕獲時(shí)間過長，可能會(huì)發(fā)生菌落生長的情況，導(dǎo)致計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確。此外，本試驗(yàn)?zāi)康氖情_發(fā)快速準(zhǔn)確、便捷有效的檢測方法。從整體考慮的話，選擇1 h作為免疫微球捕獲的最適時(shí)間。

圖7 免疫磁性糊精微球用量對不同濃度菌液中捕獲效率的影響Fig.7 Effect of adding amount of IMBS on the capture efficiency to various concentrations of Listeria monocytogenes

圖8 捕獲時(shí)間對免疫磁性糊精微球在不同濃度菌液中捕獲效率的影響Fig.8 Effect of enrichment time on the capture efficiency to various concentrations of Listeria monocytogenes

3.4 DNA提取后瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

取6個(gè)EP管，分別依次加入100μL濃度為101，102，103，104，105，106CFU/mL的單增李斯特菌菌液，每個(gè)管分別加入100μL免疫磁性糊精微球，在25℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中反應(yīng)1 h。在外加磁場的作用下，使附著有單增李斯特菌的免疫磁性糊精微球沉淀下來，待沉淀與懸浮液完全分離，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書上的方法，分別提取沉淀與懸浮液中的DNA。提取后按照2.3.3的方法進(jìn)行電泳，結(jié)果見圖9、圖10。采用相同的方法，同濃度的沙門氏菌作為對照，結(jié)果見圖11、圖12。

圖9 提取沉淀中單增李斯特菌DNA電泳后結(jié)果Fig.9 The results of DNA electrophoresis of Listeria monocytogenes in precipitation

圖10 提取上清液中單增李斯特菌DNA電泳后結(jié)果Fig.10 The results of DNA electrophoresis of Listeria monocytogenes in supernatant

圖11 提取沙門氏菌沉淀中的DNA電泳后結(jié)果Fig.11 Extract the results of DNA electrophoresis after precipitation in Salmonella

由圖9可知，隨著菌液濃度的遞減，條帶亮度逐漸減弱，免疫磁性糊精微球能夠有效與單增李斯特菌結(jié)合。從圖10可以看出，上清液中還殘留有一些單增李斯特菌沒有被特異性結(jié)合，對比圖9、圖10可以看出，絕大部分的李斯特菌都被有效快速結(jié)合。圖11和圖12表示采用同種方法、同種濃度的沙門氏菌的電泳結(jié)果。從圖11可以看出，免疫磁性糊精微球具有很好的特異性，只能特異性結(jié)合單增李斯特菌，而不能結(jié)合沙門氏菌；從圖12可知沙門氏菌全部留在了上清液中。

3.5 PCR擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

按照2.3.2的方法提取單增李斯特菌的DNA，以提取DNA作為模版，依照2.3.4的PCR擴(kuò)增體系反應(yīng)，用擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，成像并拍照，如圖13所示。

圖13 提取沉淀中DNA擴(kuò)增后電泳結(jié)果Fig.13 Extraction of DNA in the precipitate after electrophoresis results

圖12 提取沙門氏菌上清液中的DNA電泳后結(jié)果Fig.12 Extraction of Salmonella supernatant after DNA electrophoresis results

免疫磁性糊精微球能夠捕獲單增李斯特菌，并擴(kuò)增出特異性產(chǎn)物，對比圖9看出，擴(kuò)增后的產(chǎn)物明顯增多，說明此免疫磁性糊精微球可以快速、有效檢測單增李斯特菌，特異性良好，檢出限可以達(dá)到每mL菌液中10個(gè)單增李斯特菌。

4 結(jié)論

研究表明，在制備免疫磁性糊精微球之前，先需要活化磁性糊精微球，在此過程中，活化反應(yīng)的最佳條件：環(huán)氧氯丙烷的用量0.4mL/g，NaOH濃度2.0mol/L，反應(yīng)的最佳時(shí)間5 h。在此基礎(chǔ)上，才能更好的交聯(lián)抗體，制備出免疫磁性糊精微球，在制備過程中，抗體質(zhì)量濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間這3個(gè)因素都對制備免疫磁性糊精微球產(chǎn)生了影響。隨著抗體質(zhì)量濃度的增加，微球與抗體的交聯(lián)率逐漸增大，隨著反應(yīng)溫度升高，反應(yīng)時(shí)間延長，微球與抗體的交聯(lián)率先增大后減小。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，抗體質(zhì)量濃度對制備免疫磁性糊精微球影響顯著，反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度對制備免疫磁性微球的影響不顯著，3個(gè)因素對制備磁性糊精微球的影響大小依次是：抗體質(zhì)量濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間。同時(shí)得到了制備免疫磁性糊精微球的最優(yōu)合成條件為抗體質(zhì)量濃度1.0mg/mL，反應(yīng)溫度28℃，反應(yīng)時(shí)間2.5 h。用制備好的免疫磁性糊精微球捕獲單増李斯特菌時(shí)，免疫磁性糊精微球用于樣品中的最佳用量為100μL；最佳的捕獲時(shí)間為1 h。采用最優(yōu)方案制備出的免疫磁性糊精微球可以快速、有效捕獲單增李斯特菌，并能擴(kuò)增出特異性產(chǎn)物，檢出限可以達(dá)到每mL菌液中10個(gè)單增李斯特菌。