吳天福 霍光華 韓啟燦 吳 勝 鄒長江

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院菌物資源保護(hù)與利用江西省重點(diǎn)實驗室 南昌 330045）

柑橘是世界上第一大果樹作物，我國種植面積和產(chǎn)量均居世界第一。柑橘主要分布在我國長江中、下游省份，已成為各產(chǎn)區(qū)主要的經(jīng)濟(jì)支柱[1-2]。然而，柑橘采后貯藏和運(yùn)輸過程中，外界的機(jī)械損傷和其自身新陳代謝衰老易于招致病害而造成腐爛，腐爛率達(dá)20%～40%[3-4]，其中意大利青霉（Penicillium italicum）和指狀綠霉（P.digitatum）是引起柑橘采后腐爛最重要的2種病原菌[5-6]。青綠霉病導(dǎo)致柑橘果實腐爛約占總量的70%～80%[7-8]?，F(xiàn)行柑橘采后防腐保鮮的化學(xué)防治易引起藥物殘留、病原抗藥性等問題，某些化學(xué)殺菌劑被禁用或限制使用[4]。生物源柑橘采后防腐保鮮劑因其環(huán)境相容性好，病原難以產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)，逐步成為柑橘采后防腐保鮮主流方法[9]。

TLC-生物自顯影（TBA）因涂布方式及顯影方法可分為3種：瓊脂擴(kuò)散法（Agar diffusion）、瓊脂覆蓋法（Agar overlay）和瓊脂噴涂法（Agar spray）[10]。瓊脂擴(kuò)散法又稱為瓊脂接觸法（Agar contact），通常將層析后的層析紙或展層后的薄層板揮發(fā)干有機(jī)溶劑后貼在混有孢子的PDA培養(yǎng)基表面進(jìn)行生物自顯影[11]。瓊脂覆蓋法又稱為浸潤法（Immersion），通常是將展層好的薄層板浸入含有孢子懸液的熔融PDA培養(yǎng)基中，或?qū)⒑墟咦討乙旱娜廴赑DA培養(yǎng)基涂布到薄層板上使其自顯影[12]。瓊脂噴涂法是在瓊脂覆蓋法的基礎(chǔ)上演變出來的一種直接生物自顯影的操作方法[14]，是在薄板表面直接噴灑一層含菌培養(yǎng)基，使其自顯影[13-14]；瓊脂澆注法（Agar casting）是本實驗室將浸潤法稍加改良后的一種延伸方法，即將混有病原菌孢子的熔融PDA培養(yǎng)基均勻澆注在展層后的薄層板表面，待瓊脂凝固后在適宜條件下進(jìn)行生物自顯影。本實驗室篩選到一株野生裸腳菇屬Gymnopus sp.（0612-9）大型真菌，其胞外代謝產(chǎn)物對青綠霉病原菌具有很強(qiáng)的抑殺作用。為了研究其抑菌活性物質(zhì)，利用改良TBA成功實施其活性成分的色譜分離，獲得5種單體化合物，其中4種具有抗青綠霉病菌的活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

目標(biāo)菌株：裸腳菇屬菌（Gymnopus sp.，0612-9）。

病原菌株：意大利青霉（Penicillium italicum）、指狀綠霉（P.digitatum）。

以上菌種均由江西省菌物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實驗室提供。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato dextrose a-gar，PDA）：馬鈴薯 20%，葡萄糖 2%，瓊脂 2%，pH自然。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，KH2PO40.3%，MgSO4·7H2O 0.15%，自然 pH。

發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯280 g/L，葡萄糖30 g/L，麩皮 8.25 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.41 g/L，pH 5.0。

顯色劑：10%濃硫酸乙醇溶液。

二氯甲烷、正丁醇、甲醇、吐溫80（分析純），西隴化工股份有限公司；甲醇、乙腈（色譜純），西隴化工股份有限公司；硅膠柱填料（200～300目）、GF254高效硅膠板，青島海洋化工廠；C18反相硅膠柱填料（10μm；120?），Canada Silicycle公司。

1.2 儀器與設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠；智能生化培養(yǎng)箱（SHP-250FE），上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；SuKun搖床SKY-2102，上海蘇坤實業(yè)有限公司；雙光束紫外可見分光光度計Tu-1900，北京普析通用儀器有限公司；Waters 2695分析型高效液相色譜儀、Waters 1525半制備型高效液相色譜儀，Amercia Waters公司；Venusil XBP 分析柱（C18，5μm，4.6mm×250mm），Agela Technologies公司；Kromasil 100-5-C18制備柱（C18，5 μm，10 mm×250 mm）、Saier空氣泵（S-20），賽爾科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 病原菌孢子懸液制備及孢子-吸光度值標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 用含0.1%（體積分?jǐn)?shù)）的吐溫80生理鹽水制備青綠霉孢子懸液；在560 nm波長下測得不同濃度梯度孢子懸液吸光度值，并用血球計數(shù)板計數(shù)，得出不同吸光度值下的孢子數(shù)，記為X×106CFU/mL[15]。以孢子數(shù)為橫坐標(biāo)，以孢子吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出意大利青霉和指狀綠霉的孢子數(shù)與吸光度回歸方程分別為y=24.752x-1.2502 R2=0.9946，y=23.509x-1.1448 R2=0.9984。參照上文意大利青霉和指狀青霉標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定吸光度調(diào)節(jié)孢子懸液濃度為1×106CFU/mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 目標(biāo)菌株的活化與發(fā)酵液制備 無菌條件下將保藏在斜面中的目標(biāo)菌株接種到PDA平皿中，28℃恒溫培養(yǎng)7 d。將活化好的菌種接種至錐形瓶中，28℃振蕩培養(yǎng)12d，具體方法參見文獻(xiàn)[15]。

1.3.3 發(fā)酵液中抗菌活性成分初步提取、分離將36 L發(fā)酵液經(jīng)真空抽濾除去菌絲球，濾液50℃減壓濃縮5倍體積，濃縮液與95%乙醇按1∶1（體積比）混合后4℃冰箱中醇沉過夜。醇沉液1 500 r/min離心后，取上清液減壓旋蒸回收乙醇，剩余部分與乙酸乙酯等體積混合超聲萃取3次，萃取液合并后減壓濃縮共得到3.55 g浸膏，乙酸乙酯回收。萃取浸膏用甲醇溶解后與硅膠拌樣上硅膠柱[16]，以二氯甲烷∶正丁醇（體積比）=19∶1，18∶1，17∶1，16∶1 4 個梯度洗脫。各柱流分 TLC 檢測，共收集到10個不同流分，層析條件為二氯甲烷∶正丁醇（體積比）=15∶1。合并相同Rf值流分減壓旋蒸濃縮。

經(jīng)硅膠柱層析得到兩組活性成分Ⅰ′（210 mg）和Ⅱ′（300mg）。樣品用少量甲醇溶解過0.45 μm濾膜，除去不溶性雜質(zhì)，樣品分別緩慢加到反相硅膠柱（ODS）中，用L型轉(zhuǎn)接頭將反相硅膠柱與加壓泵連接，開啟加壓泵并逐漸增大壓力至到所需壓力為止?；钚猿煞症瘛浜廷颉浞謩e用45%乙腈和50%乙腈等度洗脫，流速為1mL/4min，TLC檢測后合并相同Rf值流分減壓旋蒸濃縮，流分經(jīng)改良TBA檢測。

經(jīng)ODS柱層析后得到兩組活性成分Ⅰ（24.1 mg）和Ⅱ（15.2mg）。將兩組有效成分分別用色譜甲醇溶解，利用半制備高效液相（Semi-preparative HPLC）色譜儀對兩個活性成分進(jìn)行純化制備單體物質(zhì)，制備條件分別為化合物Ⅰ用55%甲醇等度洗脫，檢測波長為220，254 nm和化合物Ⅱ用50%甲醇等度洗脫，檢測波長為210，220 nm。

1.3.4 活性成分常規(guī)檢測方法 萃取浸膏經(jīng)正相硅膠柱層析后共得到10組Rf值不同的柱流分，用牛津杯法初步篩選抑菌活性柱流分；活性組分經(jīng)TLC展層后先置于紫外燈（254 nm）下照射，并標(biāo)記斑點(diǎn)位置[17]及噴灑10%濃硫酸乙醇溶液在80℃顯色10min[18]。

1.3.5 改良TBA活性物質(zhì)檢測 將樣品用甲醇配制成質(zhì)量濃度為1mg/mL的溶液，點(diǎn)樣18.5μL于薄層板上，展層后揮干有機(jī)溶劑備用。用移液槍分別吸取1mL意大利青和指狀青霉孢子懸液，并分別加入到15mL熔融PDA培養(yǎng)基中，充分搖勻后緩慢傾倒在展層后的薄層板表面，待瓊脂凝固后將薄板正面朝上放在墊有用無菌水浸潤濾紙的培養(yǎng)皿中，用保鮮膜封口平皿，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h使其生物自顯影，可以觀察到青綠色或淺綠色背景下的透明抑菌區(qū)，即為抗菌活性成分所在位置。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌物質(zhì)的初步分離與檢測分析

發(fā)酵液萃取成分過正相硅膠柱后得到Rf值不同的10組柱流分，用牛津杯法初步篩選出活性成分。見表1、圖1。將活性成分分別用紫外燈（254 nm）和10%濃硫酸乙醇溶液顯色，并通過改良TBA顯示活性成分準(zhǔn)確位置，見圖2、圖3。

由表1和圖1可知，萃取物中的抑菌活性成分主要集中在2、3和4柱流分中，經(jīng)HPLC檢測3、4均有相同保留時間，故為同一種物質(zhì)。將流分2作為活性成分Ⅰ′，流分3、4合并后作為活性成分Ⅱ＇。

如圖2a所示，活性成分Ⅰ′、Ⅱ′經(jīng)10%濃硫酸乙醇溶液顯色和紫外線照射兩種不同方法處理后，可以觀察到活性成分Ⅰ′（Rf=0.715）處理前、后斑點(diǎn)沒有變化，活性成分Ⅱ′經(jīng)10%濃硫酸顯色后的薄板有兩個斑點(diǎn)（RfA=0.654、RfB=0.525），紫外線照射的薄板顯示只有一個斑點(diǎn)（Rf=0.525）；由圖2b的HPLC色譜圖可以看出在4min前兩種物質(zhì)峰型大致相同，在4.52min時Ⅱ′A峰消失而Ⅱ′B仍有較高的保留時間，說明Ⅱ′B為主要成分。如圖3所示，活性成分Ⅰ′、Ⅱ′對意大利青霉和指狀青霉均有明顯的抑制作用，其抑菌斑RfⅠ′=0.715、RfⅡ′=0.525。結(jié)合圖2和圖3分析可以得出物質(zhì)Ⅱ′B為活性成分，在薄層板上的位置為Rf=0.525，成分Ⅰ′也為活性成分，在薄層板上位置為Rf=0.715。

表1 不同柱流分層析及其抑菌效果Table1 Different column flow and its antimicrobial effect

圖1 牛津杯法檢測不同柱流分抑菌活性Fig.1 Dection antimicrobial activity of different columns flow

圖2 化合物Ⅰ′、Ⅱ′兩種不同處理檢視圖及成分Ⅱ′A、Ⅱ′B HPLC分析圖譜Fig.2 Two different treatments of active substance Ⅰ′，Ⅱ′and compounds Ⅱ′A，Ⅱ′B were analyzed by HPLC

圖3 成分Ⅰ′和Ⅱ′經(jīng)改良TBA檢測Fig.3 ComponentⅠ′andⅡ′were detected by developed TLC-bioautograph

2.2 單體物質(zhì)的制備與檢測分析

活性成分Ⅰ和活性成分Ⅱ分別用半制備高效液相色譜儀分離純化及HPLC分析檢測，檢測波長均為220 nm，見圖4。將分離純化得到的5種化合物用改良TBA進(jìn)行檢視，見圖5。

圖4 活性成分Ⅰ和Ⅱ半制備HPLC純化（a、b）及HPLC分析色譜圖（c、d）Fig.4 The active constituentsⅠ andⅡ were purified by semi-prepared HPLC（a，b）and HPLC analyzed（c，d） chromatograms

圖5 化合物Ⅰ1.1、Ⅰ1.2、Ⅰ2、Ⅰ3、Ⅱ經(jīng)UV照射（a）和改良TBA檢測（b）Fig.5 CompoundsⅠ1.1，Ⅰ1.2，Ⅰ2，Ⅰ3 andⅡ were irradiated by UV（a）and detection by developed TLC-bioautograph（b）

如圖4a、4b所示，活性成分Ⅰ和活性成分Ⅱ分別用55%甲醇經(jīng)半制備HPLC洗脫不同時間，共制備純化出5種單體化合物Ⅰ-1.1、Ⅰ-1.2、Ⅰ2、Ⅰ3和Ⅱ，其質(zhì)量分別為0.8，1，1，4.4，3.2mg。如圖4c、4d所示，純化后的單體化合物用40%～55%乙腈在分析型HPLC分析可知，化合物Ⅰ-1.1、Ⅰ-1.2、Ⅰ2、Ⅰ3和Ⅱ保留時間分別為6.05，6.18，7.20，7.05，4.36min，且其制備純度在 95%以上。

如圖5所示，經(jīng)UV照射顯示的斑點(diǎn)與改良TBA檢測顯示的抑菌斑位置一一對應(yīng)，各化合物點(diǎn)樣量為18.6μg，由改良TBA結(jié)果可看出化合物Ⅰ-1.1、Ⅰ-2、Ⅰ-3和Ⅱ都對意大利青霉有抑殺效果，其中Ⅰ-2和Ⅱ?qū)η嗝沟囊謿⑿Ч鼮轱@著。

3 討論

3.1 TBA與常規(guī)檢測方法的比較

天然產(chǎn)物分離過程，物質(zhì)成分和活性檢測常規(guī)方法有牛津杯法、濾紙片法，顯色劑顯色（如10%濃硫酸乙醇溶液）、TLC-UV熒光法、HPLC等方法，這些方法均有一定的局限性。如牛津杯法、濾紙片法可檢測出成分的活性且樣品消耗量大，適用于物質(zhì)初步分離的跟蹤；TLC-UV熒光法可觀察到成分的分離效果，且僅適用于有紫外吸收的樣品檢測；顯色劑顯色法雖可檢測出物質(zhì)的有無，但無法確定物質(zhì)的活性；HPLC雖然可以精確定性與定量，但需要標(biāo)準(zhǔn)對照品、內(nèi)標(biāo)物，并且儀器價格昂貴，檢測成本高。TBA是一種將薄層層析和生物活性檢測相結(jié)合的抗菌活性物質(zhì)檢測方法[19-20]。它具有活性成分的分離和實時追蹤檢測雙重效果[21]，并且還可顯示所分離的成分間極性大小和活性強(qiáng)弱[22]，一定程度上揭示活性成分的化學(xué)特征[23]。TBA可適用于具有抗細(xì)菌/真菌、酶抑制劑以及清除自由基和抗氧化等活性天然產(chǎn)物的篩選[24]，且用樣量少（幾微克甚至幾納克），適于難溶于水的化合物檢測[25]，可與對照品的最小抑制濃度（MIC）值比較推測化合物活性的強(qiáng)弱[26]，也可利用藥劑濃度與抑菌斑面積間的關(guān)系進(jìn)行定量分析[27-28]。

3.2 改良TBA與傳統(tǒng)TBA方法的比較

傳統(tǒng)TBA有瓊脂擴(kuò)散法、瓊脂覆蓋法、瓊脂噴涂法等[10]，然而這些方法都存在一些明顯的不足。如瓊脂擴(kuò)散法的展層硅膠板與含菌的瓊脂培養(yǎng)基表面易接觸不均，導(dǎo)致薄板上活性成分不能完全轉(zhuǎn)移或沒有轉(zhuǎn)移到瓊脂培養(yǎng)基上[20，24]，此外薄板與瓊脂面接觸時間長，硅膠充分浸潤后會部分脫落[29]，貼板時間短會影響薄板上活性物質(zhì)擴(kuò)散到培養(yǎng)基上的效果，特別是對含量較少、不易擴(kuò)散的活性成分影響較大，此外，平板培養(yǎng)基較厚，活性成分可擴(kuò)散的空間較大，不易形成輪廓清晰的抑菌斑[21]。瓊脂覆蓋法即浸潤法，在浸潤操作時可導(dǎo)致被展層物溶出而擴(kuò)散到瓊脂菌懸液中，引起活性強(qiáng)弱定量不準(zhǔn)確。瓊脂噴涂法由于噴霧操作使培養(yǎng)基形成霧狀液滴，在薄板表面培養(yǎng)基凝固后呈“海綿”狀疏松結(jié)構(gòu)，橫截面變厚而影響自顯影效果，且還易污染操作環(huán)境。瓊脂澆注法有利于被展層物質(zhì)與瓊脂菌懸液有足夠的浸潤時間，又可控制其在一定范圍內(nèi)局部擴(kuò)散轉(zhuǎn)移，使得瓊脂覆蓋層平整光滑，更能清晰、準(zhǔn)確的顯示活性成分位置，達(dá)到理想的自顯影效果。